MM_FS_CNG_0357食品 淀粉 酶-比色法
MM_FS_CNG_0357
食品中淀粉的测定方法.酶-比色法
1.试用范围
本方法适用于各类食品中淀粉的测定。
本标准最低检出限量为0.09μg（淀粉）／mL（试液）。
2.原理概要
淀粉在淀粉葡萄糖苷酶（AGS）催化下，最终水解为葡萄糖。葡萄糖氧化酶（GOD）在有氧条件下，催化β-D-葡萄糖（葡萄糖水溶液）氧化，生成D-葡萄糖酸-δ-内酯和过氧化氢。受过氧化物酶（POD）催化，过氧化氢与4-氨基安替比林和苯酚生成红色醌亚胺。在505nm波长处测醌亚胺的吸光度，计算食品中淀粉的含量。
（C6H10O5）n＋nH2OAGS nC6H12O6
C6H12O6＋O2 GOD C6H10O6＋H2O2
H2O2＋C6H5OH＋C11H13N3O POD C6H5NO＋H2O
3.主要试剂和仪器
3.1.主要试剂
组合试剂盒
1号瓶：内含淀粉葡萄糖苷酶（amyLogLucosidase）200U（活力单位）、柠檬酸、柠檬酸三钠；
2号瓶：内含0.2moL／L磷酸盐缓冲液（pH＝7.0）200mL，其中含4-氨基安替比林为0.00154moL／L；
3号瓶：内含0.022moL／L苯酚溶液200mL；
4号瓶：内含葡萄糖氧化酶（gLucose oxidase）800U（活力单位）、过氧化物酶（辣根，peroxidase）2000U（活力单位）；
1、2、3、4号瓶须在4℃左右保存。
3.2.酶试剂溶液
3.2.1.将1号瓶中的物质用重蒸馏水溶解，使其体积为66mL。轻轻摇动（勿剧烈摇动），使酶完全溶解。此溶液即为淀粉葡萄糖苷酶试剂溶液，其中柠檬酸（缓冲溶液）浓度为0.1moL／L，pH＝4.6。在4℃左右保存，有效期1个月；
3.2.2.将2号瓶与3号瓶中的溶液充分混合；
3.2.3.将4号瓶中的酶溶解在3.2.2混合液中，轻轻摇动（勿剧烈摇动），使酶完全溶解，即葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂溶液。在4℃左右保存，有效期1个月；
3.3.二甲基亚砜；
3.4.6moL／L盐酸溶液
将12moL／L盐酸与等体积重蒸馏水混合，摇匀；
3.5.6moL／L氢氧化钠溶液
称取24g氢氧化钠，溶于1000mL重蒸馏水中，摇匀；
3.6.淀粉标准溶液
称取经100±2℃干燥2h的可溶性淀粉0.2000g，溶于少量60℃重蒸馏水中，冷却后定容至100mL，摇匀。将此溶液用重蒸馏水稀释V10.00—→V100，即200μg／mL淀粉标准溶液。
3.2.仪器
研钵或粉碎机；
分析筛；
组织捣碎机；
恒温水浴锅；
可见光分光光度计；
酸度计或pH计；
微量移液管：1.00mL，精度0.01mL。
4.试样的制备
4.1.固体样品
粉末状样品：取有代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。
颗粒状样品：取有代表性的样品至少200g，用粉碎机粉碎，或用研钵研细，通过100目分析筛，置于密闭的玻璃容器内。
4.2.糊状样品
取有代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。
4.3.固液体样品
取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎，置于密闭的玻璃容器内。
4.4.液体样品
取有代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。
5.试液的制备
用100mL三角瓶称取试样（4.1～4.4）0.2～2g（精确至0.0001g），加入20mL二甲基亚砜和6moL／L盐酸溶液5mL，于60±1℃水浴锅中加热30min（每隔5min摇动一次）。冷却至室温后，用6moL／L氢氧化钠溶液和酸度计调整pH值至4.6左右。将溶液转移到250mL容量瓶中，用重蒸馏水定容至刻度，摇匀后用快速滤纸过滤。弃去最初滤液30mL，即为试液。
试液中淀粉含量高于1000μg／mL时，可以适当增加定容体积。
6.过程简述
6.1.标准曲线的绘制
用微量移液管吸取0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL淀粉标准溶液，分别置于10mL比色管中，各加入1mL淀粉葡萄糖苷酶试剂溶液，摇匀，于58±2℃水浴锅中恒温20min。冷却至室温，加入3mL葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂溶液（3.2.3），摇匀，在36±1℃水浴锅中恒温40min。冷却至室温，用重蒸馏水定容至10mL，摇匀。用1cm比色皿，以淀粉标准溶液含量为0.00的试剂溶液调整分光光度计的零点，在波长505nm处测定各比色管中溶液的吸光度。
以淀粉含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。
6.2.试液吸光度的测定
用微量移液管吸取0.20～2.00mL试液（6）（依试液中淀粉的含量而定），置于10mL比色管中。以下按6.1步骤操作；但须用等量试液（6）调整分光光度计的零点。测出试液吸光度后，在标准曲线上查出对应的淀粉含量。
7.结果计算
食品中淀粉的含量以质量百分率表示，按式（1）计算：
X＝ | C | × | 1 | ×100＝ | C | ……………（1） | ||||||
m× | V2 |
| 1000×1000 | m× | V2 | ×10000 | ||||||
| V1 |
|
|
| V1 |
| ||||||
式中：X——样品中淀粉的含量，质量百分率，％； C——标准曲线上查出的试液中淀粉含量，μg； m——试样的质量，g； V1——试液的定容体积，mL； V2——测定时吸取试液的体积，mL。 | ||||||||||||
计算结果精确至小数点后第二位。
8.允许差
同一样品的两次测定值之差，不得超过两次测定平均值的5.0％。
9.GB／T 16287—1996
附 录 A
（标准的附录）
淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶的技术要求、
试验方法及判定规则
A1.技术要求
A1.1.酶活力
淀粉葡萄糖苷酶酶活力（U／mg）：≥2；
葡萄糖氧化酶酶活力（U／mg）：≥20；
过氧化物酶酶活力（U／mg）：≥50。
A1.2.干扰酶
淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶都不得含有纤维素酶、β-果糖苷酶、半乳糖苷酶和过氧化氢酶。
A2.试验方法
用微量移液管吸取0.50mL淀粉标准溶液，置于10mL比色管中，加入100μg乳糖、100μg蔗糖和100μg纤维二糖（生化纯），再加入1mL淀粉葡萄苷酶试剂溶液，以下按6.1步骤操作。测定吸光度后，在标准曲线（6.1）上查出对应的淀粉含量，按式（A1）计算淀粉的回收率：
R＝ | C | ×100……………………………（A1） | |
0.5×200 | |||
式中：R——淀粉的回收率，％； C——淀粉的实测值，μg。 | |||
A3.判定规则
测得淀粉的回收率，如在95％～105％范围内，则判定淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶和过氧化物酶符合技术要求。
刊载于1998年第1期〈中国标准化〉
GB／T 16287-1996《食品中淀粉的测定方法 酶－比色法》
第1号修改单
本修改单经国家技术监督局于1997年9月11日以技监国标函（1997）第200号文批准，自1998年1月1日起实施。
1 3.5条第2行中的“溶于1000mL重蒸馏水中”更改为“溶于100mL重蒸馏水中”。
2 7.2条改用新条文：
“6.2.试液吸光度的测定
用微量移液管取0.20～2.00mL（依试液中淀粉的含量而定）试液（6），置于10mL比色管中。以下按6.1步骤操作；但须用等量试液（6）调整分光光度计零点，操作步骤如下。
取等量试液（6）加入3mL葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂溶液，摇匀，在36±1℃水浴锅中恒温40min。冷却至室温，用重蒸馏水定容至10mL。用此溶液调整分光光度计零点。
测出试液吸光度后，在标准曲线上查出对应的淀粉含量。”