・综 述・ ２０１２年５月第ｌ９卷第１４期 蛋白质相互作用研究的常用方法进展及比较 涂占晗 林旭 福建医科大学基础医学院．福建福州 ３５０００８ 【摘要１如今蛋白质问的相互作用已成为生命科学领域研究的重点，而各种蛋白质问相互作用的研究方法的飞速发展 成为蛋白质研究的重点。本综述中将着眼于酵母双杂交方法新进发展与Ｓｏｓ系统、噬菌体展示、ＧＳＴ—ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ、免疫 共沉淀、串联亲和纯化等蛋白质相互作用研究方法做一比较分析。以便在未来的研究中，根据不同方法的优缺点选 择合适的研究技术。 『关键词１酵母双杂交；Ｓｏｓ系统；噬菌体展示；ＧＳＴ ｐｕｌｌ—ｄｏｗｎ；免疫共沉淀；串联亲和纯化 【中图分类号】Ｒ３４ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１６７４—４７２１（２０１２）Ｏ５（ｂ）－００１８－０３ Ｔｈｅ ａｄｖａｎｃｅ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｉｎ ｃｏｍｍｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ－・ｐｒｏ－・ ｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ 刀 ａｎｈａｎ ＬＩＮＸｕ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ ３５０００８，Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｐｒｏｔｅｉｎ—ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｈａｓ ｂｅｃｏｍｅ ａ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｓｕｂｊｅｃｔ ｉｎ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐ— ｍｅｎｔ．ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｖａｒｉｏｕｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｈａｖｅ ｃｒｅａｔｅｄ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ—ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ ｗｉｌｌ ｍａｋｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ：￣ｙｅａｓｔ ｔｗｏ—ｈｙｂｒｉｄ，Ｓｏｓ，ｃｏ—ｉｍｍｕｎ０ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＧＳＴ ｐｕｌｌ—ｄｏｗｎ，ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ，ｔａｎｄｅｍ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｉｃａｔｉｆｏｎ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ａｌｌ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ａｆｔｅｒ ｔｈａｔ．ｉｔ ｗｉｌｌ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅｉｒ ｏｗｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｆｉ－ ｎａｌｌｙ，ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ ｗｉｌｌ ｄｉｓｃｕｓｓ ｈｏｗ ｔｏ ｃｈｏｏｓｅ ａ ｓｕｉｔａｂｌｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ—ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｉｍｓ ａｎｄ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｙｅａｓｔ ｔｗｏ—ｈｙｂｒｉｄ；Ｓｏｓ；Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ；ＧＳＴ ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ；Ｃｏ—ｉｍｍｕｎ０ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；Ｔａｎｄｅｍ ａｆｉｆｎｉｔｙ ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ 蛋白质作为生命活动的承载体已及功能的执行者，了解 蛋白质的功能特性被视为理解生命活动的重要步骤。蛋白组 学技术的不断发展，使得发现新蛋白质以及研究其功能和机 制成为如今生命科学界的热门课题。由于极大多数蛋白质不 能单独行使其功能，而是通过与其他蛋白相结合形成复合体 参与到细胞或机体的各种生理活动中。在对一种蛋白质的功 能进行研究的过程中发现，直接对感兴趣蛋白进行研究是非 常困难的，通常利用蛋白与蛋白相互作用的特性，利用已知 蛋白的功能对与其相互作用的未知蛋白的功能特性做出推 断及验证口１。到目前为止，已涌现出多种蛋白与蛋白相互作用 的检测技术，但各自的适用情况和优缺点各有不同。本文将着 眼于酵母双杂交方法新进发展与Ｓｏｓ系统、噬菌体展示、ＧＳＴ— 酵母双杂交技术在蛋白质相互作用的研究方面具有敏 图１ 酵母双杂交检测蛋白质相互作用机理 感、高效、简捷、真实、广泛等诸多优点 ，但它并非适用于所 有蛋白质。因其原理决定，酵母双杂交只能检测定位于胞核内 的蛋白．对发生在胞质和胞膜的相互作用或诱饵蛋白自身具 ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ、免疫共沉淀、串联亲和纯化等蛋白质相互作用研 究方法做一比较分析进行综述。 １酵母双杂交系统及Ｓｏｓ恢复系统 １９８９年，在研究真核基因转录的过程中，Ｆｉｅｌｄｓ和 Ｓｏｎｇ初步建立的酵母双杂交系统 是近年来用于研究蛋白相 互作用经典有效的方法。酵母双杂交系统是依据ＧＡＩＡ转录 激活因子的特性进行设计的。ＧＡＩＡ转录激活因子是一种由 有转录活性时．则不能将与其相互作用的蛋白质筛选出来ｆｓＩ。 最近几年．Ｓｏｓ恢复系统对经典的酵母双杂交系统进行 了弥补。Ｓｏｓ系统是应用一种突变菌株一ｃｄｃ２５Ｈ进行构建的。 该菌株是一种在基因１３２８位置上有一个氨基酸残基点突 变．即ＣＤＣ２５基因。这种菌株不依赖转录激活机制但是对温 度敏感。在酵母菌株中的ＣＤＣ２５基因是人Ｓｏｓ（ｈＳｏｓ）基因的 同源基因．该基因可编码一个能够结合并激活Ｒａｓ的脒基核 两个彼此分离但功能必需的结构域组合而成的，即ＤＮＡ结合 结构域（ＤＮＡ—ＢＤ）和转录激活结构域（ＡＤ），ＤＮＡ—ＢＤ能够 苷酸交换因子，从而可启动Ｒａｓ信号转导通路。该系统的特 性是．在３７℃的条件下生长的为ＣＤＣ２５基因不表达的ｃｄｃ２５ 识别并结合位于ＧＡＬ４反应元件的上游激活序列（ＵＡＳ）．但 必需与ＡＤ结合后才能激活ＵＡＳ下游的启动子，从而表达出 突变体抑制菌株，但是２５℃这个特定的温度下却允许突变菌 株一ｃｄｃ２５Ｈ生长。经证实，人Ｓｏｓ（ｈＳｏｓ）蛋白能够补充ｃｄｃ２５ ＧＡＩＡ完整的转录因子活性，使启动子下游的报告基因（如 ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬａｃＺ、ＭＥＬ１）得到转录表达［３１。见图１。 菌株这种缺陷，并且具有激活酵母中Ｒａｓ信号通路的功能， 通过与其相互作用的蛋白可将表达出的ｈＳｏｓ蛋白固定于细 胞膜上．使得ｃｄｃ２５Ｈ酵母菌能够在３７℃生长。在该系统中，通 １８中国当代医药ＣＨＩＮＡ ＭＯＤＥＲＮ ＭＥＤｌＣｌＮＥ ２０１２年５月第１９卷第１４期 ・综 述・ 过将诱饵蛋白基因构建到ｐＳｏｓ载体上。而目的蛋白基因则构 建到ｐＭｙｒ载体上可分别形成ｈＳｏｓ和诱饵蛋白的融合蛋白。 十四烷基化信号序列和目的蛋白的融合蛋白。由于十四烷基 化信号序列的作用，目的蛋白可被固定于细胞膜上 继而ｈＳｏｓ 蛋白能与诱饵蛋白作用，被固定在细胞膜上并激活Ｒａｓ信号 方法是将诱饵蛋白的编码基因与ＧＳＴ标签整合后表达．表 达的融合蛋白经纯化后与有目的蛋白质的溶液孵育。经一定 时间的孵育后即会形成ＧＳＴ一融合蛋白一目的蛋白复合物．并 用谷胱甘肽一Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ将其沉淀下来。最后通过聚丙烯酞胺 凝胶电泳（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）方法鉴定猎物蛋白。ＧＳＴ—ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ 传导通路，最终在３７℃ｅｄｅ２５Ｈ菌株可得以生长。见图２。 ———． ３７℃ 圈２ Ｓｏｓ系统原理示意圈 遗憾的是。该系统具有高背景假阳性等局限性．而应用 ＧＳＴ—ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ和Ｃｏ—ＩＰ实验方法对初筛结果进行进一步筛 查验证即成研究的重要方法和关键性步骤。 ２噬菌体展示（ＰＤＴ） １９８５年Ｇｅｏｒｇｅ Ｐ Ｓｍｉｔｈ闷在丝状噬菌体（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ，ｆｄ）的外壳蛋白基因ＩＩＩ中克隆入ＲＩ核酸内切 酶基因片段获得的噬菌体粒子可以在外壳蛋白中融合表达 的酶分子。在之后的验证中证实ＥｃｏＲ Ｉ内切酶抗体可以有 效中和外壳蛋白表达有这种酶分子的噬菌体。此结果说明该 酶分子的构象和活性与天然酶分子相同或极为相似。该实验 的成功标志着噬菌体展示技术的开始。该技术的基本原理 是：噬菌体外壳蛋白与外源蛋白质或多肽的基因表达产物融 合，并可展示于噬菌体表面．从而使得展示于噬菌体表面的 外源多肽有较的空间结构和生物活性，通过筛选表达有 特异性多肽或蛋白的噬菌体而得到大量富集．然后进行 ＤＮＡ测序。该技术是将展示肽的表型与基因型通过丝状噬 菌体直接地联系起来 ，再利用其配体的特异性亲和力，将有 需要的蛋白质或多肽筛选出来Ｉ 。Ｓｃｏｔｔ ＪＫ等［９１于１９９０年运用 该技术构建了随机多肽文库，此文库包含特定长度的随机段 肽，理论上涵盖了某一长度短肽的所有氨基酸的排列组合序 列。因依靠特定的氨基酸或特异性的肽段，可使蛋白质问相 互识别和作用。据该原理所述，用受体蛋白对随机肽库进行 筛查，以获得与之结合的短肽序列，由筛得的短肽序列便可 得到与目的蛋白相互作用所依靠的氨基酸残基序列㈣，即可 进一步研究蛋白间的分子识别和结合等等。 这一研究技术也证明了无需了解蛋白的详尽结构也能 够对其相互作用进行检测。迄今为止，已构建成功的噬菌体 表达载体ｆｌ、Ｍ１３、Ｔ４等，成为蛋白质组学研究中的重要Ｔ 具。２００４年，通过噬菌体展示技术的运用，Ｊｅｓｐｅｒｓ Ｌ等Ｉ”Ｉ运用 热变性的原理发展了一种方法选择和鉴定抗凝集蛋白，从而 防止或促进蛋白的凝集反应．且在诊断凝集蛋白引起的疾病 方面有重大意义。 ３ ＧＳＴ——ｐｕｌｌ—．ｄｏｗｎ Ｓｍｉｔｈ ＤＢ和其研究团队Ｉ ２１于１９８８年利用谷胱甘肽一Ｓ一 转移酶（ＧＳＴ）融合标签纯化出ＧＳＴ融合蛋白，ＧＳＴ—ｐｕｌｌ— ｄｏｗｎ开始成为一种热门研究方法。ＧＳＴ—ｐｕｌｌ—ｄｏｗｎ这一研究 主要有两方面用途：（１）鉴定能与已知融合蛋白质相互作用的 未知蛋白质；（２）验证两已知蛋白质之间是否存在相互作用。 该方法特异性较强，也较简便，能减少一定的假阳性率， 也不需要使用同位素等危险物质，在研究蛋白质相互作用中 应用广泛。但该方法不适用于大规模筛查相互作用的蛋白， 除此之外。活性融合蛋白的量及避免内源性诱饵蛋白干扰是 该方法成功的关键。 ４免疫共沉淀（Ｃｏ－ＩＰ） 免疫共沉淀是一种研究蛋白质之间相互作用的特异性 强的研究方法。该技术运用特异性抗体与蛋白特异性结合的 原理，通常是蛋白或其复合物与带有标签蛋白的特异性抗体 的融合蛋白相互结合．形成蛋白复合体。用试剂将蛋白质复 合体进行溶解。再利用通过亲和色谱柱对标签蛋白具有特 异吸附作用的特性将蛋白复合体分离纯化出来．最后运用ＳＤＳ— ＰＡＧＥ、双向电泳或质谱等技术对分离所获的蛋白进行鉴定。 此方法同样不适用于相互作用蛋白的大规模筛查，但其 优势在于能用于确定在生理条件下在细胞或组织内是否存 在与目的蛋白能够结合并作用的蛋白质，亦可运用该方法验 证蛋白间的相互作用。见图３。 ． 静 羹囊鼍囊鼙谯■白羹慷脒秘 ●自 图３免疫共沉淀原理图 ５串联亲和纯化（ＴＡＰ） Ｒｉｇａｕｔ Ｇ等［１３—１４１在１９９９年一同提出了一套称为串联亲 和纯化（ＴＡＰ）的研究方法，用于分离复合蛋白，该技术兼备 了免疫共沉淀和标准亲和纯化的优点，成为鉴定和分离蛋 白质复合体新途径ｌｌ５１。该研究方法首先将ＴＡＰ标签整合于该 蛋白质的一端，标签由一个钙调蛋白结合多肽（ＣＢＰ）与蛋白 ＣＨＩＮＡ ＭＯＤＥＲＮ ＭＥＤＩＣＩＮＥ中国当代医药１９ ・综 述・ ２０１２年５月第１９卷第１４期 标签组成，并将ＴＥＶ蛋白酶切位点插入二者之间，之后用带 有ＴＡＰ标签的基因置换内源的蛋白基因并表达，且可与特 基础。通过不同的蛋白质研究技术可了解和阐明蛋白相互作 用及新蛋白的发现和作用机制等重要问题。蛋白组学研究的 兴盛标志着后基因组时代的到来，蛋白功能的研究成为重中 之重。以近期国内外该领域的趋势，现阶段蛋白质研究的热 点已锁定于研究蛋白质之间的相互作用关系的揭示及其网 络图的建立。多样化的蛋白质相互作用的研究方法，给科研 定蛋白进行识别和结合裂解细胞，提取细胞总蛋白，并将所 获总蛋白加入ＩｇＧ亲和柱。亲和柱上的ＩｇＧ可与ＴＡＰ标签的 ＰｒｏＡ端特异性结合，之后用洗脱液洗脱大多数非特异性结 合蛋白，依次在洗脱液（含ＴＥＶ蛋白酶）洗脱和钙离子的协 助下．获得高纯度的目的蛋白复合体（见图４）。经上述步骤 所得的蛋白质复合体再进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳分离及质谱分 工作者提供了多种多样的研究途径。但不同的研究方法具有 各自的适用范围及优劣性，研究者需要根据自己的研究对象 析．进而可发现其中的新组分或新蛋白复合物。 ＴＨＶ切｛Ｉｌｌ位点 ■ 辩洗 ＴＥ 圈套ｌ ＴＫＶ甥刺位点 ■ ｅｃｒＡ：ｅｌ￣瑷 （℃ ２ 一 —■■ ＞ ＇ 墨 图４重组标签融合蛋白的结构示意图 此种研究方法不仅能保持复合物结构的完整性。并且能 够得到纯度较高的特异性。因该技术的灵敏性、可靠性和特异 性都优于传统的酵母双杂交技术，尤其适用于研究蛋白质在 生理条件下的相互作用。但是，该技术在对高等真核细胞进行 研究时却因原位蛋白标记难在真核细胞内进行．且易受内源 蛋白的干扰等因素而具局限性。Ｆｏｌｅｒ Ｄ及其科研团队１１６１将 ＲＮＡｉ技术与ＴＡＰ方法结合（ｉＴＡＰ技术），内源基因可通过此 技术发生沉默，减少内源性基因的竞争性干扰作用。 ６对未来蛋白与蛋白相互作用研究的展望 机体内蛋白之问的结合和相互作用是机体生理活动的 ２０中国当代医药ＣＨＩＮＡ ＭＯＤＥＲＮ ＭｆｆＤＩＣＩＮＥ 及课题设计，选择合适的一种或几种研究方法。同时，随着科 研条件和材料科学地不断突破，许多新的研究技术和方法在 不断推陈出新，不断改进，这对蛋白质的功能研究及解释蛋 白质在生命活动中的角色和机制，具有重大意义。蛋白组学 的发展必将推动生命科学大步向前。 【参考文献】 ［１］Ｏｌｉｖｅｒ Ｓ．Ｇｕｉｌｔ ｙ—ａｓｓ０ｃｉａｔｉｏｎ ｇｏｅｓ ｇｌｏｂａｌ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３（６７７０）： ６Ｏ１—６０３． ［２】Ｆｉｅｌｄｓ Ｓ，Ｓｏｎｇ Ｏ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ～ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，４０（６２３０）：２４５－２４６． ［３］Ｆｉｅｌｄｓ Ｓ，Ｓｔｅｍｇｌａｎｚ Ｒ．Ｔｈｅ ｔｗｏ—ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ：ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ—ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ，１９９４，１０（８）：２８６－２９２． ［４】ＹａｎｇＭ，ＷｕＺ，ＦｉｅｌｄｓＳ．Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｅｐｔｉｄｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎａｌｙｚｅｄｗｉｔｈｔｈｅｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９５，２３（７）：１１５２—１１５６． ［５１ Ａｒｏｎｈｅｉｍ Ａ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＳＯＳ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＧＡＰ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｓ ＧＴＰａｓｅ ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９７，２５（１６）：３３７３－３３７４． ［６】Ｓｍｉｔｈ ＧＰ．Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｈａｇｅ：ｎｏｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｄｉｓｐｌａｙ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２８（４７０５）： ｌ３１５－１３ｌ７． ［７］Ｐｅｒｈａｍ ＲＮ，Ｔｅｒｒｙ ＴＤ，Ｗｉｌｌｉｓ ＡＥ，ｅｔ ａ１．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｐｅｐｔｉｄｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｏｎ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ［ＪＪ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ， １９９５，１７（１２２）：２５—３１． ［８】ＭｃＣａｒｒｅｙ ＪＲ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＳＡ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｌｉｍｉｔｉｎｇ Ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｃｕｍ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９４，５（１）：３４—３９． ［９］Ｓｃｏｔｔ ＪＫ，Ｓｍｉｔｈ ＧＰ．Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｌｉｂｒａｒｙ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４９（４９６７）：３８６－３９０． ［１Ｏ］Ｈｏｅｓｓ ＲＨ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ ａｓ ａ Ｖｅｈｉｃｌｅ ｆｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｓｐｌａｙ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，３（１）：２３－２８． 【ｌ１］Ｊｅｓｐｅｒｓ Ｌ，Ｓｃｈｏｎ Ｏ，Ｊａｍｅｓ ＬＣ，ｅｔ ａ１．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＨＥＩＡ，ａ ｓｏｌｕｂｌｅ， ｒｅｆｏｌｄａｂｌｅ ｈｕｍａｎ ＶＨ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｗｉｔｈ ａ ｇｅｒｍ－ｌｉｎｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ［Ｊ］．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００４，３３７：８９３—９０３． ［１２】Ｓｍｉｔｈ ＤＢ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＫＳ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｓ ｆｕｓｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆＪ］．Ｇｅｎｅ， １９８８，６７（１）：３１—４０． ［１３］Ｒｉｇａｎｔ Ｇ，Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ Ａ，Ｒｕｔｚ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ａ ｇｅｎｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．１９９９，１７：１０３０—１０３２． 【１４】Ｐｕｉｇ Ｏ，Ｃａｓｐａｒｙ Ｆ，Ｒｉｇａｕｔ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ Ｔａｎｄｅｍ Ａｆｉｆｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ （ＴＡＰ）ｍｅｔｈｏｄ：ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｍｅｔｈｏｄ，２００１，２４：２１８－２２９． ［１５】王海波，安学丽，张艳贞，等．蛋白质相互作用研究方法及其应用【ＪＪ． 生物技术通报，２００６．（ｚ１）：１６７—１７０． ［１６］Ｆｏｄｅｒ Ｄ，Ｋｏｅｈｅｒ Ｔ，Ｒｏｄｅ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ｅｍｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ［Ｊ１． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３，２１（１）：８９－９２． （收稿日期：２０１２—０２—２９本文编辑：陈俊）
