碱性磷酸酶km实验报告

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碱性磷酸酶km实验报告

篇一：碱性磷酸酶Km值得测定(1) 碱性磷酸酶Km值得测定 原理

在适宜条件下，酶促反应的初速度随底物浓度【s】增大而增大，当底物浓度达一定时则反应趋于稳定，反应速度最大。关系可用米氏方程表示Km是酶的特征性常数。将米氏方程变形为双倒数方程 对1/s作图可算出Km 步骤，以1/V 结果

由y=9.2961x+1.1465算出当y=0时x=-0.233，继而算出Km值=8.11mmol/L 讨论

计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。

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实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成误差，所以导致与实际值差距较大。 尿蛋白定性检测 原理

加热可以使蛋白质变性，溶液ph等于pI时溶解度最小。 步骤

1.取大试管一支，加入5ml澄清尿液。

2.用试管夹持试管上端，酒精灯加热尿液斜面至沸。(:碱性磷酸酶km实验报告)

3.滴加5%乙酸2~3滴于尿液表面，轻轻混匀局部，加热。 结果

未加热部分是澄清，加热部分浑浊明显 讨论

正常尿液中不会出现浑浊，本实验尿液加入了蛋白质。尿液中如果出现沉淀则说明出现了病症。 分子筛层析（凝胶过滤法） 原理

多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应，使不同分子分离。大分子先出，小分子后出。 步骤

1.取5~8滴4mg/ml蓝色葡萄聚糖液和4滴2mg/ml重铬酸钾液混匀。

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2.将层析柱出水口打开，缓放柱内液体至凝胶柱表面加入混匀的待层析液。

3.从上口缓加蒸馏水，成2~3cm高水柱，出水口用小试管接水。

4.在上口加洗脱液洗脱。每支小试管接1cm液体，并编号。

5.观察不同小试管的液体颜色的变化。 结果 讨论

分子筛层析能够大致的分离分子量不同的物质，但是分离的物质不纯有杂质，实验时间也相对较长，操作复杂。 篇二：实验名称碱性磷酸酶的分离纯化实验报告 实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期20XX年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师

总分教师签名批改日期

碱性磷酸酶（AKp或ALp）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKp具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AKp最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKp主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和

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胎盘等组织的细胞膜上。血清AKp主要来自肝，小部分来自骨骼。

AKp可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。 一实验原理

1、碱性磷酸酶的分离纯化

AKp分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKp。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKp的滤液，AKp能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKp。 2、碱性磷酸酶的比活性测定

根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（u/mg?pr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安

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替比作用，经铁氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。 3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响

在环境的温度、ＰＨ和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。酶促反应的速度（Ｖ）随底物浓度（Ｓ）的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表 示：

式中：Vmax为最大反应速度；[s]为底物浓度；Km为米氏常数；V代表反应的起始速度。①当ν=Vmax/2时，Km=[s]。因此，Km等于酶促反应速度达最大 值一半时的底物 浓度。

②Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要的方法，大

多数酶的Km值在0.01-100mmol/L。③Km和Vmax的测

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定：主要采用Lineweaver-burk双倒数作图法。此式为直线方程，

以不同的底物浓度1/s为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方

向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/Km，由此可以正确球的该酶的Km值。方程式与图如下：

本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度时的酶活性，再根据Lineweaver-burk法作图计算其Km值。实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光值得大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上差得酚的含量，进而算出酶活性的大小。 二、实验材料

（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定 １、样品兔肝２、试剂

①0.5mol/L乙酸镁溶液②0.1mol/L乙酸钠溶液 ③0.01mol/L乙酸镁－0.01mol/L乙酸钠溶液 ④0.01mol/LTris－0.01mol/L乙酸镁ph８.８缓冲液⑤丙酮（分析纯）⑥95%乙醇（分析纯）⑦正丁醇（分析纯）⑧0.04mol/L底物液⑨１mg/ml分标准液⑩0.5mol/LＮａＯＨ

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?0.3%4－氨基安替比林?0.5%铁 ?0.1mg/mL蛋白标准液?碱性铜试剂 ?酚试剂３、仪器与器材 ①研钵

②刻度离心管③刻度吸管 ④电动离心机

⑤玻璃漏斗和玻璃棒⑥托盘天平⑦恒温水浴⑧可见分光光度计

（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 １、样品兔肝匀浆液 ２、试剂

①0.04mol/L底物液

②0.1mol/L碳酸盐缓冲液ph10（37℃）③碱性溶液 ④0.5%铁⑤0.3%4－氨基安替比林⑥酚标准液（0.1mg/ml）３、仪器与器材 ①恒温水浴锅 ②可见光分光光度计 三、实验步骤 （一）AKp的提取 AKp提取实验步骤 (二)AKp的比活性测定 1、AKp的活性测定

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AKp活性测定实验步骤 2、蛋白质含量测定 蛋白质含量测定实验步骤

（三）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 1、底物浓度对酶促反应速度的影响

将新鲜兔肝用ph10.00.1mol/L碳酸缓冲液匀浆，按倍稀释即可

酶曲线绘制步骤

2、酚标准曲线的绘制的绘制 酚标准曲线的绘制的绘制步骤 篇三：碱性磷酸酶的Km测定

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