第２３卷第５期 ２０１６年ｌ０月 莆田学院学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｕｔ ｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 中图分类号：Ｘ１７２ 、，０１．２３ Ｎｏ．５ Ｏｃｔ，２０１６ 文章编号：１６７２．４１４３（２０１６）０５．００９６．０４ 文献标识码：Ａ 多环芳烃芘输入对红树林沉积物微生物菌落结构的影响 蔡丽希，刘黎星，陈小萍 （莆田学院基础医学部，福建莆田３５１１１０） 摘 要：采用变性梯度凝胶电／￣（ｄｅｎａｍｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）技术分析在多环芳烃芘持续输 入情况下，莆田红树林表层沉积物富集驯化前后５个月微生物的种属结构变化。结果表明，随着芘浓度的增加， 富集驯化前后５个月沉积物的微生物种群结构和数量存在明显的演替过程，既存在红树林原有优势种属的消 亡，也有新种属的增长，种群多样性降低后趋于稳定。试验结果为长期监测多环芳烃污染物对海洋微生物茵群 变化的影响提供可靠的试验方法。 关键词：多环芳烃；芘；红树林；微生物；多样性；变性梯度凝胶电泳 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｍａｎｇｒｏｖｅ Ｓｅｄｉｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｏｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＡＨｓ。＿－Ｐｙｒｅｎｅ ＣＡＩ Ｌｉｘｉ，ＬＩＵ Ｌｉｘｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｘｉａｏｐｉｎｇ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｕｔｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｕｔｉａｎ Ｆｕｊｉａｎ ３５ １ １ ００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：、ｖｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｅｓｓ ｏｆ ＰＡＨｓ—Ｐｙｒｅｎｅ．ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｙ ｄｉｔｖｅｒｓｉｙｔ ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｎｇｒｏｖｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｐｕｔｉａｎ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ）ｗｉｔｈｉｎ ５ ｍｏｎｔｈｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ ｓｙｌｌｏｇｉｓｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎ ｃｏｍｍｕｎｉｙ ｓｔｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｎｄ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｐｙｒｅｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｃｈａｎｇｅｓ ｑｕｉｃｋｌｙ，ｓｏｍｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｄｉｅｓ ｏｕｔ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｏｔｈｅｒ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｑｕｉｃｋｌｙ．Ｔｈｅ ｃｏｍｍｕｎｉｙ ｄｉｔｖｅｒｓｉｙ ｔｅｎｄｓ ｔｔｏ ｂｅ ｓｔａｂｌｅ ａｆｔｅｒ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ．Ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆＰＡＨｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｈｅ ｃｏｍｍｕｎｉｔｔｙ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆｍａｒｉｎｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ（ＰＡＨｓ）；ｐｙｒｅｎｅ；ｍａｎｇｒｏｖｅ；ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｙ；ｄｉｔｖｅｒｓｉｙ；ｔ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ） ０引言 多环芳烃（ＰＡＨｓ）是一类具有明显毒性的典 型持久性有机污染物（ＰＯＰｓ） ，广泛分布于海洋 的含量、组成及微生物降解作用具有重要意义。 传统的纯培养技术可从海洋红树林表面沉积 物中筛选得到单一多环芳烃芘降解优势菌株，但 该技术被微生物的可培养性所限制，实验室能分 离出的菌株只占其中的０．０１％～１０．００％，且培养分 环境中并呈不断累积的趋势，其化合物具有极强 的致癌效应［２ 】。因此，国内外学者广泛关注其生 离周期长，工作量大 】。应用变性梯度凝胶电泳 （ＤＧＧＥ）技术，不用实验室培养分离，可直接从沉 积物中提取环境微生物的总ＤＮＡ，再对其１６Ｓ ｒＤＮＡ保守序列进行扩增和产物分离，进而分析沉 物降解 。目前研究表明，红树林常常是ＰＡＨｓ的 主要吸收和累积场所，其ＰＡＨｓ含量较非红树林区 高２～１０倍 】。因此，研究该系统生物体中ＰＡＨｓ 收稿日期：２０１６．０９．０６ 基金项目：莆田市科技计划项目（２０１３Ｓ０１（４）） 作者简介：蔡丽希（１９８０．），女，福建莆田人，讲师，硕士。 第５期 蔡丽希，等：多环芳烃芘输入对红树林沉积物微生物菌落结构的影响 ９７ 积物中的微生物在多环芳烃芘输入前后的群落多 样性，旨在筛选得到多环芳烃芘高效降解菌，进而 为芘的微生物修复提供科学依据 】。 １材料与方法 １．１材料与试剂 取自莆田红树林保护区，采样时用采泥铲刮 取０～１０ｃｍ表层沉积物，避光保存于一２０℃冰箱中。 无机培养基（ＭＳＭ）（ｍｇ／Ｌ）：ＣａＣＩ：・２Ｈ：Ｏ （１Ｏ０），（ＮＨ ）：ＳＯ （１ ０００），ＫＨ：Ｐ０ （２００），Ｎａ２ＨＰＯ （８００），（ＮＨ４）６ＭｏＯ２４・４Ｈ２Ｏ（１），ＦｅＣ１３・６Ｈ２Ｏ（５）， ＭｇＳＯ ・Ｈ：０（２００），ｐＨ ７．２，１２１ ｏＣ灭菌２０ｍｉｎ。 １．２测定方法 １．２．１沉积物样品的富集培养 称取１Ｏｇ红树林表层沉积物样品到９０ｍＬ无 菌水中，加人一定量的玻璃珠，在１５０ｒｐｍ的摇床 中震荡３ｈ。静置３０ｍｉｎ后，移取５ｍＬ上清液至４５ ｍＬ含芘的无机盐培养基中，多环芳烃芘的质量终 浓度达到５０ｍｇ／Ｌ。１５０ｒｐｍ、２５ ｏＣ下闭光培养，并 每天定期监测培养液的浊度和颜色变化。约一个 月后如发生明显变化，移取５ ｍＬ上清液到新配制 的４５ｍＬ含有芘的无机盐培养基中，进行再富集培 养约一个月，重复以上步骤，如此富集培养共进行 ５个月，每个月芘的质量终浓度分别为５０、１００、 ２００、３００、４００ ｍｇ／Ｌ。收集每个月的菌液，加人 ２０％甘油于一２０￣（２保藏。 １．２．２芘输人前后富集培养液的ＰＣＲ模板制备 分取芘输入前后６个阶段富集培养液各１．５ ｍＬ，１２ ０００ ｒｐｍ、５ ｍｉｎ，弃上清，加入０．４７５ ｍＬ ＴＥ 溶液悬浮沉淀，加０．２５ｍＬ １０％ＳＤＳ，２５ Ｌ２０Ｍ的 蛋白酶Ｋ混匀，３７℃水浴１ ｈ。加７５ Ｌ ５Ｍ ＮａＣＩ 混匀，并加７５ Ｌ ＮａＣ１／ＣＴＡＢ混匀，６５℃恒温２Ｏ ａｒｉｎ。加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（２５：２４：１）溶 液进行抽提，１２ ０００ ｒｐｍ、１０ ｍｉｎ，移上清液至干净 离心管中，再加人等体积的氯仿：异戊醇（２４：１）混 匀抽提，取上清液移至离心管中，１２０００ ｒｐｍ、３ ａｒｉｎ。加入１倍体积的冰异丙醇，颠倒混合，４℃冰 箱放置３０ｍｉｎ。沉淀ＤＮＡ。用玻棒捞出ＤＮＡ沉 淀，７０％乙醇漂洗后，吸干，溶解后溶于２０Ｊ山ＬＴＥ 取上清即为ＰＣＲ模板。 １．２－３ １６Ｓ ｒＤＮＡ通用引物序列 ６次富集培养液采用细菌１６Ｓ ｒＤＮＡ通用引物 Ｂ１、Ｂ２，扩增产物大小预期为３４９ｂｐ，包含Ｖ９高变 区。 Ｂｌ（１０５５－－１０７０）：ＡＴＧＧＣＴＧＴＣ ＧＴＣＡＧＣＴ Ｂ２（１４０６—１３９２）：ＡＣＧ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＴＧ ＴＡＣ １．２．４ ＰＣＲ扩增与电泳回收 ＰＣＲ扩增体系为２５ Ｌ，２ｘＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １２．５ Ｌ，ＤＮＡ模板１ ＩｘＬ，上下游引物各ｌ Ｌ（１０Ｉ．Ｌｍｏｌ／ Ｌ），无菌ｄｄ Ｈ Ｏ ９．５ Ｌ。扩增程序为：９４ｃｃ预变性 ５ｍｉｎ；９４℃变性６０ Ｓ；４６ｏＣ退火６０ Ｓ；７２ｏＣ延伸９０ Ｓ； ２８个循环后，７２￣Ｃ延伸１５ｍｉｎ。 ＰＣＲ产物回收：采用浓度为０．８％的琼脂糖凝 胶电泳方法来监测ＰＣＲ产物，电泳的Ｍａｒｋｅｒ为天 根２００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（ＭＤ１１５），将约为２００ｂｐ目 的片段条带切下置于离心管中，使用ＯＭＥＧＡ公 司的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收纯化。 １．２．５ ＤＧＧＥ分析 制备８％聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度从２５％ 至７５％，变性剂溶液为７ｍｏｌ／Ｌ的尿素和４０％去离 子甲酰胺的混合物。电泳缓冲液为ｌｘＴＡＥ，ＰＣＲ 产物的上样量为５００ｎｇ，６０ ｏＣ，１５０Ｖ恒压下电泳 １５ ｍｉｎ后，再以２５０Ｖ电泳４．５ ｈ，电泳结束后银染 凝胶并通过Ｔａｎｏｎ ＧＩＳ凝胶成像系统分析并拍照， 统计各个样品的电泳条带的数量及面积，用于对 图谱的统计分析。 ２结果与讨论 ２．１各富集阶段细菌１６Ｓ ｒＤＮＡ高变区扩增 富集培养过程中，每隔一个月更换新配制的 培养基，同时将菌液于一２ＯｃＣ保藏。将保藏的菌液 用酚、氯仿法制作ＰＣＲ模板，以引物Ｂ１、Ｂ２进行混 合菌群１６Ｓ ｒＤＮＡ高变区的扩增，扩增产物的琼脂 糖凝胶电泳分析结果见图ｌ。从图１可以看出，各 个阶段的菌群都可以扩增出清晰的条带，产物的 长度大小约为３５０ｂｐ。其产物未出现非特异性扩 增产物，纯度与亮度较好，可以做为ＤＧＧＥ的样 品，可以用来监测样品中的微生物多样性。 ２．２ ＤＧＧＥ结果分析 为了考察海洋红树林环境被芘干扰后微生物 ９８ 莆 田 学ｌ ｌ ３ 图１各富集阶段培养液的１６Ｓ ∞ ∞∞ ｒＤＮＡ基因 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析 ｐ ｐ 注： 巾．１为第・个．Ｖｌ芘降解菌种的ＰＣＲ产物；２ 第二个 芘降解菌群的ＰＣＲ产物；３为第 个月芘降斛菌 群的ＰＣＲ产物；４为第四个月芘降解菌群的ＰＣＲ产物；５勾 第五个月芘降解菌群的ＰＣＲ产物；６为红树林表层沉积物 的ＰＣＲ产物：Ｍ为Ｎ ３２３１Ｖ，１００ｂｐ，ＤＮＡＬａｄｄｅｒ 群落或某种指示微生物的命运 。 １，本实验对芘输 入前后６个时期样品的ＰＣＲ产物进行了ＤＧＧＥ分 析。冈２为样品ｌ６Ｓ ｒＤＮＡ Ｖ３ ＤＧＧＥ罔潜，ｉｉｒ 见，表层沉积物样品经过ＤＧＧＥ分离 ２０条带 谱，且每条带谱的迁移距离和信号强度不一样。 由于ＤＧＧＥ一般只能检测出样品中数量较多的微 生物种属，带谱的亮度从原理上ｒ ｒ以反映该种属 的数量，一般认为带谱中较亮的条带代表了红树 林环境巾的优势种属１１ ２ １ ３］。将红树林表层沉积物 添加到以芘为唯一碳源与能源的培养基【１１富集培 养，间隔一个月转接，分析培养液１６Ｓ ｒＤＮＡ的保 守序列的ＤＧＧＥ指纹 谱。结果 示，富集培养１ 个月后，其优势种属达到１７种，既存在红树林原仃 种属的消亡，也有新种属的增长 、 表明表层沉 积物巾有一部分微 物对芘具有一定的耐受性， 甚至芘对某些微生物种属具有一定的激发效应， 有新增条带出现，而个别种群对芘胁迫较为敏感， 种群数量降低比较明 ，达到ＤＧＧＥ分辨率的下 限，致使谱带变暗甚至消失” 。随着培养液中芘 浓度的增加，富集培养２个月后，芘对微生物多样 性的影响也逐渐增强，培养液中微生物种属的多 样性大大降低，样品ｒｆ１只有８个条带，已有９个条 带消失．表明芘对微生物种群有明显的胁迫作 院学报 ２０１６年ｌ０月 川。到第３月时，这种影响有减少的趟势．佯晶中 有１个条带消失 第４月．样品ｆｆＩ仍有７个条０ ，微 物的多样性 本保持不变，群落结构之州的相 似性逐步升高，演铃过程慢慢减弱，形成Ｊ 较为稳 定的种属类型”…、寓集培养的 ５个』｛，样ｒｆｌＩＩ 有 ６个条带，这表明培养液ｆＩ１ 能ｒｔｔ ６个或６个以上 科１群的微生物组成，一些微 物种属 高浓度芘 的输入 迫下被淘汰，而一些微生物种属通过协 同不１ｌ竞争作用彤成Ｊ 稳定的 降解菌群 ｒ） １ ２ ４ 图２样品Ｉ６Ｓ ｒＤＮＡＶ３区ＤＧＧＥ图谱 ：图巾．Ｄ为红树林表层ｆ）ｉｌ．ｆ．￣ｔ物；１为第一１＼Ｊ１ 降 解 群；２为第二一个川 降解蔺群：３为第 个川 降解 群；４为第四个』】葩降解菌群；５为 个，Ｊ芘降解 舯 内外学并 利用ＤＧＧＥ技术分析样 Ｉｆ，，埘 分离到的单个ＤＧＧＥ带谱检测斤进行分子诊断 时，ｊ￡结果与血接形态观察或传统实验事培养的 结果均呈现Ｈ｛一致性，证明ｒ ＤＧＧＥ技术是一种 稳妥、快速的 法” 】。本研究仞步从ＤＧＧＥ带 谱的差异Ｌ比较＿ｒ红树林表 沉积物样品经人 Ｔ富集驯化后不川时问的细菌多样性，ｎＪ‘以比较 直观羽Ｉ形象地了解佯品任芘胁迫下的细菌雌异 性 ．最终要确定海洋污染环境中的细茼组成还 需要结合纯培养等其他方法，ｆＬｊ是本研究获得的 结果对进一步利川纯培养及ＤＧＧＥ或其他方法 研究海洋污染环境中的微生物多样性具有一定 的指导意义 ”Ｉ ．第５期 蔡丽希，等：多环芳烃芘输入对红树林沉积物微生物菌落结构的影响 ９９ 参考文献： ［１］盛下放，何琳燕，胡凌飞．苯并（ａ）芘降解菌的分离筛选 及其降解条件的研究［Ｊ］．环境科学学报，２００５，２５（６）： ５２—５６． ［２］赖成婷．质￣ｉＤＮＡ提取方法的研究进展【Ｊ］．科技信息， ２０１１，２４（１５）：５６４—５６７． ［３］蔡其洪．恒波长同步荧光法同时测定三种多环芳烃［Ｊ］． 莆田学院学报，２００６，１３（５）：８Ｏ一８３． ［４］蔡丽希，许桂芬．芘降解质粒提取方法的研究［Ｊ］．生物 技术通报，２００９，２５（５）：９２—９５． ［５】曾小康，李凤兰，周凯，等．深圳坝光红树林沉积物和植 物多环芳烃的分布［Ｊ］．环境科学与技术，２０１３，３６（１２）： ３６８—３７３． ［６】ＬＩＡＮＧ Ｙ，ＴＳＥ Ｍ Ｆ，ＹＯＵＮＧ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｓｔｉｒｂｕ・ ｔｉｏｎ ｐａ￣ｅｒｎｓ ｏｆ ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ （ＰＡＨｓ）ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｆｉｓｈ ａｔ Ｍａｉ Ｐｏ Ｍａｒｓｈｅｓ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ［Ｊ］．Ｗａｔｅｒ Ｒｅｓ，２００７，４１ （６）：１３０３—１３１ｔ． ［７］何莉莉，杨慧敏，钟哲科，等．生物炭对农田土壤细菌群 落多样性影响的ＰＣＲ—ＤＧＧＥ分析［Ｊ］．生态学报，２０１４， ３４（１５）：４２８８—４２９４． 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