*CN102349548A*
(10)申请公布号 CN 102349548 A(43)申请公布日 2012.02.15
(12)发明专利申请
(21)申请号 201110234076.7(22)申请日 2011.08.16
(71)申请人江苏省农业科学院
地址210014 江苏省南京市孝陵卫钟灵街
50号(72)发明人王冉 张辉 包红朵
(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限
公司 32200
代理人孙忠浩(51)Int.Cl.
A01N 65/32(2009.01)A01N 65/24(2009.01)A01N 63/00(2006.01)A01P 1/00(2006.01)A61L 2/18(2006.01)
(54)发明名称
一种以噬菌体为主要组分的环境生物消毒剂及其应用(57)摘要
本发明提供一种以噬菌体为主要组分的环境生物消毒剂及其应用，由大肠杆菌噬菌体CCTCCM209208，肠炎沙门氏菌噬菌体CTCCM2010226，鸡白痢沙门氏菌噬菌体CCTCC M2011042，福氏志贺氏菌噬菌体CCTCCM209029，肉桂提取液，白头翁提取液和辅剂组成；其中各
用于环种纯化的噬菌体制备成浓度≥104pfu/ml，
境场所及器具上杀菌和净化。它具有杀菌力强、杀菌快、无毒害、无刺激、无腐蚀性、无着色等特点，非常适合养殖场、屠宰场、畜产品加工厂、食品仓库等环境和器具的消毒和净化，具有很好的推广使用价值。CN 102349548 A权利要求书 1 页 说明书 6 页
CN 102349548 ACN 102349551 A
权 利 要 求 书
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1.一种以噬菌体为主要组分的环境生物消毒剂，其特征在于：按体积百分比计，其配方为大肠杆菌噬菌体CCTCC M 209208 10-30%，肠炎沙门氏菌噬菌体CTCC M 2010226 10-30%，鸡白痢沙门氏菌噬菌体CCTCC M 2011042 10-30%，福氏志贺氏菌噬菌体CCTCC M 209029 10-30%，肉桂提取液5-8%，白头翁提取液5-8%，余量为辅剂；其中各种纯化的噬菌体制备成浓度≥104pfu/ml。
2.根据权利要求1所述一种以噬菌体为主要组分的环境生物消毒剂，其特征在于：所述的辅剂为生物消毒剂用常规辅剂。
3.根据权利要求2所述一种以噬菌体为主要组分的环境生物消毒剂，其特征在于：所述的生物消毒剂用常规辅剂是指水或甘油。
4.根据权利要求1所述一种以噬菌体为主要组分的环境生物消毒剂，其特征在于：所述的白头翁提取液是由白头翁属植物中获得的植物提取物，所述的白头翁属植物为择一选择的白头翁、金县白头翁、兴安白头翁、蒙古白头翁、西南白头翁、掌叶白头翁、黄花白头翁、钟萼白头翁、紫蕊白头翁、细叶白头翁、朝鲜白头翁和肾叶白头翁。
5.一种如权利要求1所述环境生物消毒剂的应用，其特征在于：将该环境消毒剂用于抑制或消杀环境中相应的大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌的污染，尤其是用于养殖场、畜舍、屠宰场、食品仓库和畜产品加工厂环境及器具的净化消毒。
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说 明 书
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一种以噬菌体为主要组分的环境生物消毒剂及其应用
技术领域
本发明提供一种以多株分离的裂解性噬菌体为主要组分的环境消毒剂及其在养殖场、屠宰场、食品加工厂、医院等场所的环境及其相关器皿上大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等病原菌的杀灭和净化应用。属于生物工程领域。
[0001]
背景技术
目前，养殖场细菌性疾病蔓延、呈多发、高发及混合感染趋势，对养殖场疫病控制
及畜牧业养殖效益以及畜产品致病菌污染等产生很大危害，近几年在养殖场(猪场、鸡场、牛场及鸭场等)的疫病发生及流行特点调查发现：养殖场的细菌性疾病非常厉害，是直接影响动物生产、动物产品安全的重要因素。[0003] 环境消毒剂多是化学类消毒剂，这些制剂多数毒性较大，如戊二醛、福尔马林等，或气味较难闻，如过氧乙酸、福尔马林等。化学消毒剂消毒效果虽好，但存在着稳定性差，使用时需稀释且稀释后一周用完，有一定的刺激异味等不足之处使其使用范围受到了限制。化学消毒剂是通过本身对细胞的毒性作用而杀菌的。有些消毒剂对人体有毒性作用；有些消毒剂生物降解速度极慢，容易造成环境污染；有些消毒剂对物品有腐蚀性及其他损害作用。同时，这些化学消毒剂长期应用于养殖场食品动物的消毒还会引起残留，用于器皿的消毒会产生腐蚀作用。另外，随着大量消毒剂的长期使用，养殖场的部分细菌对消毒剂产生了一定的耐药性，而使消毒效果逐渐变弱。因此，人们希望得到一种短时间内即可达到灭菌效果，无异味，作用时间长，使用方便，无毒或低毒、刺激性小而灭菌杀毒效果又好的消毒剂。随着近几年人们的保健和消毒防病意识逐渐加强，新型生物环境消毒剂成为一种发展趋势。
[0004] 噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，又称细菌病毒。对靶细菌有很强的特异性裂解作用，对环境其他生物无危害，是理想的环境中靶细菌的克星。对环境中存在的各种靶细菌有很强的杀菌作用，起到净化消毒的目的。
[0005] 申请人在养殖场污水和粪便中曾经分离获得大肠杆菌噬菌体、肠炎沙门氏菌噬菌体、鸡白痢沙门氏菌噬菌体、福氏志贺氏菌噬菌体等多株裂解性噬菌体，其中，大肠杆菌噬菌体的保藏号为CCTCC M 209208，由200910263295.0号专利申请公开，肠炎沙门氏菌噬菌体的保藏号为CTCC M 2010226，由201010508259.9号专利申请公开，鸡白痢沙门氏菌噬菌体的保藏号为CCTCC M 2011042，由201110053518.8号专利申请公开，福氏志贺氏菌噬菌体的保藏号为CCTCC M 209029，由200910029306.9号专利申请公开。[0006] 目前，在对大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等病原菌有杀灭和净化作用的制剂中，采用所述的大肠杆菌噬菌体、肠炎沙门氏菌噬菌体、鸡白痢沙门氏菌噬菌体、福氏志贺氏菌噬菌体进行复合组成，并未予以报道。
[0002]
发明内容
[0007] 本发明的目的在于：提供一种以多株裂解性噬菌体为主要组分的环境生物消毒剂
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说 明 书
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及其在养殖场、屠宰场、畜产品加工厂等场所的环境及器皿中细菌的杀灭和净化应用。[0008] 本发明的另一个目的是：提供一种新的环境中细菌污染的防治和净化方法和措施。
[0009] 一种以噬菌体为主要组分的环境生物消毒剂，其特征在于：按体积百分比计，其配方为大肠杆菌噬菌体CCTCC M 209208 10-30％，肠炎沙门氏菌噬菌体CTCC M 2010226 10-30％，鸡白痢沙门氏菌噬菌体CCTCC M 2011042 10-30％，福氏志贺氏菌噬菌体CCTCC M 209029 10-30％，肉桂提取液5-8％，白头翁提取液5-8％，余量为辅剂；其中各种纯化的噬菌体制备成浓度≥104pfu/ml。
[0010] 所述的辅剂为生物消毒剂用常规辅剂。[0011] 所述的生物消毒剂用常规辅剂是指水或甘油[0012] 所述的肉桂提取液为选择肉桂，洗净切碎，按体积比1∶10加入95％乙醇，70℃浸提5小时，真空抽虑，旋转蒸发仪蒸至近干，过滤，用水溶液溶解，获得肉桂提取液。[0013] 所述的白头翁提取液是由白头翁属植物中获得的植物提取物，所述的白头翁属植物为择一选择的白头翁、金县白头翁、兴安白头翁、蒙古白头翁、西南白头翁、掌叶白头翁、黄花白头翁、钟萼白头翁、紫蕊白头翁、细叶白头翁、朝鲜白头翁和肾叶白头翁。[0014] 一种以噬菌体为主要组分的环境生物消毒剂的应用，其特征在于：将该环境消毒剂用于抑制或消杀环境中相应的大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌的污染。[0015] 本发明的优点是：1)由于本发明所涉及的裂解性噬菌体是在养殖场的污水和粪便中分离获得，且裂解谱比较广，对养殖场的特异致病菌有很强的针对性，杀菌消毒效果更强，也对畜产品中携带的致病菌同样有很强的杀灭作用；2)由于该发明是几种裂解性噬菌体的复合物，与单一的噬菌体相比，大大扩宽了其噬菌谱，既能杀灭环境中的大肠杆菌，也能杀灭环境中存在的沙门氏菌和志贺氏菌致病菌，大大提高了对养殖场常见致病菌的杀灭效力。3)该发明克服了以往环境消毒剂的腐蚀性及刺激性气味，对环境及器皿消毒净化效果好，无臭无味、还有一点中药的香味、安全无毒，可以带动物和带器具进行消毒使用。4)同时本发明对养殖场及屠宰场等场所和器具上的耐药性大肠杆菌和沙门氏菌及志贺氏菌有很好的杀灭作用。
具体实施方式
[0016] 实施例1、环境生物消毒剂的组成
[0017] 将本实验室保藏的4种纯化噬菌体，分别活化后进行稀释，使其浓度分别≥104pfu/ml即可，然后按照以下体积比进行混合，混合均匀，然后按照以下体积比加入白头翁提取液和肉桂提取液，进行充分混合，然后在加入适量辅剂。配方组成如下：[0018] 肠炎沙门氏菌噬菌体(CTCC M 2010226)：10-30％；[0019] 鸡白痢沙门氏菌噬菌体(CCTCC M 2011042)：10-30％；[0020] 大肠杆菌噬菌体(CCTCC M 209208)：10-30％；[0021] 福氏志贺氏菌噬菌体(CCTCC M 209029)：10-30％；[0022] 肉桂提取液(外购)5-8％；[0023] 白头翁提取液(自制)5-8％；[0024] 辅剂补充至100％。制备成液体，备用；
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其中：所述的白头翁提取液是这样获得的。[0026] 所述的辅剂为水。[0027] 具体实施时，所述的白头翁属植物可以择一选择的白头翁、金县白头翁、兴安白头翁、蒙古白头翁、西南白头翁、掌叶白头翁、黄花白头翁、钟萼白头翁、紫蕊白头翁、细叶白头翁、朝鲜白头翁和肾叶白头翁。所述的辅剂还可以采用甘油，或采用在生物消毒剂中的其他常规辅剂。
[0028] 实施例2：环境消毒剂对房间空气自然菌的杀菌净化效果[0029] 本实验选择一种商品化的消毒剂：过氧乙酸消毒剂作为对比，研究本发明消毒剂对房间空气自然菌的进化消毒能力。
[0030] 将本发明的环境生物消毒剂成溶液，经喷雾器造成气溶胶，喷雾前后密闭门窗1h。过氧乙酸喷雾前后也密闭1h。上述2种不同的消毒剂均采用气溶胶喷雾法，分别于消毒前30min、消毒后30min采样进行细菌培养。[0031] 空气消毒监测方法：根据卫生部颁发的《消毒技术规范》要求，均采用平板暴露法，按消毒房间面积大小放置平板数，每次在同一高度，同一位置布点，于消毒前后进行空气采样，培养皿暴露5min，合盖检测。[0032] 消毒效果：检测结果表明，两种消毒产品均显示出良好的消毒效果，本发明提供的环境生物消毒剂杀菌率略低于过氧乙酸，但差异不显著，本发明提供的环境生物消毒剂无刺激性气味、无腐蚀作用，还有一定的中药香味。噬菌体消毒剂溶液经喷雾器造成气溶胶，其粒子细小扩散作用既快又强。该法不仅具有消毒作用，还能使尘埃沉降，并湿化、清新空气。
[0033] 结果表明：本发明提供的环境消毒剂与过氧乙酸具有同等的对自然菌的杀菌效力，且无刺激性气味，可在公共场所喷雾使用，解决了长期以来未能解决的动态环境下的消毒问题以及耐药菌的问题。
[0034] 表1环境消毒剂对室内空气自然菌杀灭效果
[0035]
实施例3：消毒剂在鸡舍的消毒效果实验
[0037] 本实验选3栋蛋鸡舍进行实验。[0038] 消毒方法：鸡舍1：采用喷雾器彻底消毒，包括地面和墙壁，尽量使药液完全扩散开来。对环境中空气、墙壁和地面进行采样，进行细菌分离测定。鸡舍内2：用浸润消毒剂的纱布对笼架、蛋筐和饲料推车擦拭消毒。鸡舍3：采用过氧乙酸喷雾消毒，采集环境中空气样品进行细菌分离测定。[0039] 消毒效果检测：分别在喷雾消毒或擦拭消毒前30min和消毒后30min、24h后对鸡
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舍1和鸡舍3中的空气采样，分析细菌变化情况，同时对鸡舍1中的墙壁和地面进行采样，进行细菌分离检测，对鸡舍2中的笼架、蛋筐和饲料推车采样，进行细菌培养及检测。[0040] 空气中细菌的检测：空气中细菌取样采用自然沉降法，在同一位置和同一高度布点，每个鸡舍布8个点，将无菌培养基敞口放置于8个采样点，分别在消毒前和消毒后30min或24h后进行取样，培养基暴露5分钟，盒盖，带回实验室，放培养箱恒温培养，计算各类细菌的落菌数，计算室内落下菌的平均数。[0041] 地面、墙壁、蛋筐和饲料推车的采样：在消毒前后，分别用无菌棉拭子，在鸡舍内的墙壁和地面上各取3个点，每点擦涂面积为5×5cm，消毒后采样与消毒前位置相邻而不重合，将棉式子浸于5.0ml的无菌生理盐水的小瓶中(内加0.1％的酪蛋白，以提高样品的收获率)。密封后，带回实验室处理。鸡舍内的笼架用灭菌棉拭子取样，无菌接种到培养皿，进行培养测定。
[0042] 表2环境消毒剂对鸡舍空气净化消毒效果
[0043]
实验结果表明：从表2看出：本发明提供的环境生物消毒剂对鸡舍空气中菌落总
数及大肠杆菌、沙门氏菌及志贺氏菌等致病菌有很好的杀菌效果，杀菌率均达到88％以上。而过氧乙酸消毒剂对自然菌落消毒效果较好，但对鸡舍中的大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌的灭菌效果不理想，远低于本发明的环境消毒剂。这说明：本发明提供的环境消毒剂对养殖场特定的致病菌有很好的杀菌效果，有很强的针对性。而过氧乙酸针对性不强，或由于长期使用细菌对其产生了耐药性的缘故，致使消毒效果不理想。[0045] 同时还发现，在鸡舍带鸡喷雾消毒的过程中，过氧乙酸消毒过程中，鸡群有明显的闭眼、摇头、剧烈抖动身体和头部等不适反应，而本发明环境消毒剂在喷雾中没有发现明显的鸡群不适应反应。
[0046] 表3环境消毒剂喷雾对鸡舍墙壁和地面的净化消毒效果
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表4环境生物消毒剂擦拭对笼架、蛋筐和饲料推车等物体表面消毒效果
从表3和表4看出，本发明提供的环境生物消毒剂通过喷雾和擦拭消毒，对鸡舍内空气和墙壁、地面、笼架以及蛋筐和饲料推车等物品进行杀菌净化，且杀菌率均超过87％以上。
[0051] 实施例4：消毒剂的安全性评价
[0052] 在江苏省实验动物中心南京医科大学购买昆明小鼠30只，雌雄各一半，体重20±2g。开展小鼠吸入和灌胃本发明提供的环境生物消毒剂，观察消毒剂对小鼠的毒副反应。
[0053] 试验结果显示：消毒剂的小鼠急性口服毒性：LD50＞5000mg/kg，急性吸入毒性：LD50＞2.5mg/L；急性皮肤毒性：LD50＞3000mg/kg，表明消毒剂为无毒性药物。[0054] 以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限定，有关技术领域的技术人
[0050]
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员，在不脱离本发明的精神和技术范围内，可以制备出各种配比和各种变型的产品，因此，所有技术领域等同的技术方案，都应属于本发明的权利范围。
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