实验十一 质粒DNA的提取与纯化

实验十一 质粒DNA的提取与纯化

一、实验目的与原理

质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。提取质粒的基本步骤分为三步：①细菌的培养和质粒的扩增，②细菌菌体的裂解，③质粒DNA的纯化。本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。

二、材料与试剂

1、材料：大肠杆菌

2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪

3、试剂：

Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)

10 mM EDTA(pH8.0)

50 mM葡萄糖

高压灭菌，4℃保存

Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用

Solution III 5 N KAc pH4.8

高压灭菌，4℃保存

3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌，4℃保存。异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70％乙醇，LB培养基，电泳试剂

三、操作步骤

1、细菌繁殖

LB培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜

2、离心10 min，5000 rpm, 4℃；弃上淸液

3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5000 rpm, 4℃

加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min

4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min

5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min

6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12000 rpm, 4℃

7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min

8、离心10 min，12000 rpm, 4℃

9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中

10、加入40 ul，3 M NaAc

11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀

12、离心10 min，12000 rpm, 4℃

13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。

14、电泳检测提取DNA的质量

三、结果与分析

超螺旋结构DNA

四、注意事项

在本实验中，如果不经过RNase处理，在电泳带中，RNA会呈现极亮的带，所以，建议使用RNase处理一下。离心时应注意转速不能太低，太低会导致质粒不纯；也不要太

高，否则质粒不易溶解。电泳时应注意电压，电压太高或混有蛋白质杂质时电泳带容易产生偏离和拖尾。在DNA操作中应尽可能轻地操作（尤其是分别加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ轻轻摇），否则质粒容易断裂，从而在观察条带时出现许多杂带。无水乙醇可用于沉淀质粒，如果质粒量比较大的话，一般用异丙醇来沉淀。

整个制备过程一般可分为5个阶段：

①材料的选择和预处理

②细胞的破碎（有时需进行细胞器的分离）

③提取

④纯化（包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、层析、超离心及结晶等）

⑤浓缩、干燥及保存。以上5个阶段不是要求每个方案都完整地具备，也不是每一阶段截然分开。

原料的选择主要依据实验目的。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）

时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。

二、前处理

1、细胞的破碎

材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。

主要方法有：

Ⅰ反复冻融法

Ⅱ冷热变替法

Ⅲ超声波法

Ⅳ加压破碎法

化学及生物化学方法

Ⅰ有机溶媒法

Ⅱ自溶法

Ⅲ酶法

细胞器的分离一般采用差速离心法。细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。细胞器的分离制备、介质的选择十分重要。最早使用的介质是生理盐水。因它容易使亚细胞颗粒发生聚集作用结成块状，沉淀分离效果不理想，现一般改用蔗糖、Ficoll（一种蔗糖多聚物）或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。

蛋白质提取与制备的方法:

1. 分离纯化的原则

从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后操作。常用有机溶剂提取除去。

主要采用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超离心法及柱层析法等

蛋白质的提取和纯化--选择分离材料及预处理

以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。

蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。

蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，

提取和纯化，浓细、干燥和保存。

微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中

的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

细胞的破碎

1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先

拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG

频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。

4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，

使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢

自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲

磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离

子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。