Ｖｏ１．３６ ２０１５年４月 高等学校化学学报 ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＩＮＥＳＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＩＥＳ Ｎｏ．４ ６４６～６５３ 衍生于双氰基二苯代乙烯的用于活体成像的 双光子荧光锌离子探针 黄池宝 ，梁 兴 ，曾启华 ，陈华仕 ，曾伯平 ，易道生 ，陈晓远 （１．遵义师范学院化学化工学院，遵义５６３００２； ２．韶关学院英东农业科学与工程学院，韶关５１２００５） 摘要制备了衍生于双氰基二苯代乙烯的双光子荧光锌离子探针，该探针以４一（２一吡啶甲基）哌嗪为锌离子 受体，当络合锌离子时，探针的荧光强度增强了７２．５倍和５８０ ＧＭ的双光子吸收截面．该探针无细胞毒性且 在体内环境中无ｐＨ敏感性，其解离常数 ＝（０．５２￣０．０１）ｔｘｍｏｌ／Ｌ．性能测试结果表明，该探针能选择性地 检测活细胞中的游离锌离子，耐时长达约１５００ ｓ，且能探测活体组织８０～１５０ ｍ深处的锌离子，不受其它 金属离子与生物膜的干扰． 关键词 双光子荧光探针；锌离子；活体成像；双光子发射截面 中图分类号０６５５．２５ 文献标志码Ａ 生物体内的ｚｎ 是继Ｆｅ 之后的第二个含量较为丰富的重金属离子，在许多生理过程中起着重要 作用 Ｉ２ ．锌不但广泛参与各种生命活动的生化过程，同时也是生命体的构成元素．自１９８７年第一个 锌离子荧光探针（ＴＳＱ） 被合成以来，已研制出多种锌离子单光子荧光探针，如Ｚｉｎｑｕｉｎｌ４ Ｊ，ＺｎＡＦ＿５ Ｊ， Ｚｉｎｐｙｒ ，ＦｌｕｏＺｉｎ一３Ｈ ，ＴＦＬＺｎ ，ＡＣＦ一１，ＡＣＦ一２ 和Ｂｉｓ—ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｙｌ—ｃａｌｉｘ 等，这些单光子荧光探针 能方便快捷地检测ｚｎ ，但在检测时易导致光致毒及光漂白，易受组织自发荧光的干扰，只能用于组 织或细胞的浅层成像．为了克服这些问题，双光子锌离子探针被陆续开发，但其检测性能尚不够理想， 亟待开发性能更优良的双光子锌离子探针¨卜Ｈ Ｊ． 本文以双氰基二苯代乙烯（ＤＣＳ）作为双光子荧光母体，设计开发了性能优良的双光子荧光锌离子 探针（ＤＺｎ），该探针以双氰基二苯乙烯¨ 作为双光子荧光团，以４一（吡啶一２一甲基）哌嗪（ＰＭＰ）作为 锌离子受体．对该探针的光物理性质、对离子的识别作用及细胞成像进行了研究． １ 实验部分 １．１试剂与仪器 Ⅳ，Ⅳ，Ⅳ ，Ⅳ 一四（２一吡啶基）乙二胺（ＴＰＥＮ）、ｓ一亚硝基半胱氨酸（ＳＮＯＣ）、乙二醇一双一（２．氨基乙醚） 四乙酸（ＥＧＴＡ）、３一（Ⅳ一吗啉代）丙磺酸（ＭＯＰＳ）、胎牛血清（ＦＢＳ）、磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）、达尔伯克 （氏）改良伊格尔（氏）培养基（ＤＭＥＭ）、人工脑脊髓培养液（ＡＣＳＦ＋１３８．６ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＩ＋３．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣＩ＋２ １ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３＋０．６ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ２ ＰＯ４＋９．９ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ十１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣ１２＋３ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１ ）和噻唑蓝（ＭＴＦ）均为分析纯试剂，使用前均经除水处理． Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ４００ ＭＨｚ核磁共振仪（美国Ｖａｒｉａｎ公司）；ＨＰ ８４５３型紫外一可见分光光度仪（美国惠普 公司）；ＲＦ一５０００型荧光分光光度仪（日本岛津公司）；Ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｘｌ９０型分光光度计（美国分子仪器公 司）；ＧＣ—ＴＯＦＭＳ型电子轰击质谱仪（ＥＩ源，美国Ｗａｔｅｒｓ公司）；ＸＴ－４型双目体视显微熔点测定仪（北 收稿日期：２０１４—１０４）８．网络出版日期：２０１５－０３－２７． 基金项目：中国博士后科学基金（批准号：２０１００４７１２２４）、广东省自然科学基金（批准号：ｓ２０１１０４００００５３６）、湖南省科技计划项目 （批准号：２０１１ＲＳ４０２０）、深圳大学省部重点实验室开放基金项目（批准号：２０１２０２）、韶关市科技计划项目（批准号：２０１１ＣＸ／ＫＩ９）和贵 州省教育厅自然科学重点研究项目（批准号：黔教合ＫＹ字［２０１４］２９６）． 联系人简介：黄池宝，男，博士，教授，主要从事双光子荧光探针研究．Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｃｈｉｂａｏ＠１６３．ｃｏｍ Ｎｏ．４ 黄池宝等：衍生于双氰基二苯代乙烯的用于活体成像的双光子荧光锌离子探针 ６４７ 京泰克公司）；ＨＰ１１００ＬＣ／ＥＳＩ—ＭＳＤ型电喷雾质谱仪（美国安捷伦公司）；ＦＴ／ＩＲ－４３０型红外光谱仪（波 数扫描范围为３５０～７８００ ｃｍ～，ＫＢｒ压片，日本Ｊａｓｃｏ公司）；Ｐｅｒｋｉｎ２４００（ＩＩ）型元素分析仪（美国Ｐｅｒ— ｋｉｎ公司）；Ｍｉｒａ ９００．Ｆ型锁模飞秒钛蓝宝石激光器（美国Ｃｏｈｅｒｅｎｔ公司）． １．２实验过程 中间体及目标化合物ＤＺｎ的合成路线如Ｓｃｈｅｍｅ １所示，其中化合物２—７参考文献［１７～１９］方法 合成，表征结果见表１． Ｏ ＣＵＣＮ 厂＿＿＼ Ｎ Ｂｒ Ｏ ＨＣＯＮ（ＣＨｓ）ｚ ２ ａ、ｌ、Ｎ ａ ＣＣｌ ㈣ Ｂｒ Ｐ（ＯＣ２Ｈ５）３ 占篓 ４ ５ －－ＣＨ’ＮＨ２ Ｎ 厂—、 Ｎ Ｎ 、 ／ Ｋ２ＣＯ３，ＣＨ３ＣＮ，ＫＩ ｒｅｆｌｕｘ，７ ｄ，５８％—＿６３％ ７ ＤＺｎ Ｓｃｈｅｍｅ １ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ＤＺｎ Ｔａｂｌｅ １ Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ［ＨＲＭＳ（Ｅ１）］ｄａｔａ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ２—７ Ｃｏｍｐｄ． Ｒｅｆ．ＨＲＭＳ（ｃａｌｃｄ．），ｍ／ｚ Ｃｏｍｐｄ． Ｒｅｆ．ＨＲＭＳ（ｃａｌｃｄ．），ｍ／ｚ ２ ３ ４ ［１７］ ［１７］ ［１８］ ２６３．９２０７（２６３．９２００） ３１３．８８０３（３１３．８８０１） ２３３．９７４７（２３３．９７４２） ５ ６ ７ ［１８］ ［１９］ ［１８］ ２９２．０９７７（２９２．０９７７） ２４５．０３７４（２４５．０３５２） ３８３．０９５２（３８３．０９５２） 将化合物７（３８３ ｍｇ，１ ｍｍｏ１）和无水Ｋ：ＣＯ，（４１４ ｍｇ，３ ｍｍｏ１）置于装有ＭｅＣＮ（２５ ｍＬ）的５０ ｍＬ圆 底烧瓶中，在氮气保护下搅拌回流７ ｄ．将所得混合物过滤除去不溶物，减压浓缩除去溶剂，得灰黄色 黏稠状液体．粗品经柱色谱（丙酮一二氯甲烷）分离纯化得黄棕色固体（２５１ ｍｇ，０．６００ ｍｍｏ１），产率 ６０％，于甲醇中重结晶得针型固体，ｍ．Ｐ．２４５～２４６℃．。Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１ ，４００ ＭＨｚ），６：８．５９３（ｄ，．，＝ ４．０ Ｈｚ，１Ｈ），７．９６７（Ｓ，１Ｈ），７．６８０（ｔ，ｌ，＝７．６ Ｈｚ，１Ｈ），７．５４６（Ｓ，１Ｈ），７．４７２（ｄ，‘，＝８．８ Ｈｚ，２Ｈ）， ７．４５０（ｄ，Ｊ＝８．８ Ｈｚ，１Ｈ），７．２１０（ｄ，Ｊ＝１６．０ Ｈｚ，１Ｈ），７．１９９（ｄ，Ｊ＝７．２ Ｈｚ，１Ｈ），７．１６１（ｄ， ．，＝１６．４ Ｈｚ，１Ｈ），６．９０６（ｄ，．，＝８．８ Ｈｚ，２Ｈ），３．７４１（Ｓ，２Ｈ），３．３２８（ｔ，Ｊ＝４．８，５．２ Ｈｚ，４Ｈ），２．６９４ （ｔ，Ｊ＝４．８，５．２ Ｈｚ，４Ｈ），２．５５２（Ｓ，３Ｈ）； Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１ ，１００ ＭＨｚ）， ：１５８．２１７，１５２．０３８， １４９．５４８，１３９．７２６，１３９．４６７，１３６．６５９，１３４，８０７，１３４．４１２。１２８．９０９，１２８．７３４，１２６．３４３，１２３．５１９， １２２．３８１，１１８．４４１，１１７．４９２，１１６．９６８，１１６．８９２，１１５．３９７，１１４．１２２，６４．６９０，５３．２０５，４８．２１８， ２９．８５６，２０．０７９；ＩＲ（ＫＢｒ）， ｃｍ～：３４２５（ＯＨ），２２２３（Ｃ—Ｎ），１６２１（Ｃ—Ｃ）；元素分析（％， ｃ２７Ｈ２５Ｎ５计算值）：ｃ ７７．１８（７．３０），Ｈ ６．０８（６．０１），Ｎ １６．７３（１６．６９）；ＨＲＭＳ（ＥＩ）（ｃ２７Ｈ２５Ｎ５计算值）， ｍ／ｚ：４１９．２１１３（４１９．２１１０）． ２结果与讨论 ２．１探针ＤＺｎ在水中的溶解性 研究了探针ＤＺｎ在水中的溶解性（图ｓ１，见本文支持信息），结果表明，当ＤＺｎ的浓度由０增至 ２０ ｐ，ｍｏｌ／Ｌ时，溶液的单光子荧光强度逐渐增大，且与浓度成正比；当浓度进一步增大时，单光子荧光 强度增加缓慢，由ＤＺｎ的浓度与单光子荧光强度构成的数据点背离了原来的直线，均落在原来直线的 高等学校化学学报 下方．由于荧光物质的荧光强度与其浓度呈正比，因此推断ＤＺｎ的浓度大于２０ Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ时，ＤＺｎ未能 完全溶解，否则数据点不会背离原来的直线．由此可见，ＤＺｎ在水中的溶解度为２０ Ｆ￣ｍｏＬ／Ｌ． ２．２探针ＤＺｎ对金属阳离子的识别 ２．２．１ 锌离子对探针ＤＺｎ的紫外一可见吸收滴定 由于探针ＤＺｎ的分子结构设计是建立在光诱导电 子迁移机制（ＰＥＴ）上的，在未络合锌离子前，介于吡啶与芳胺氮原子之间的叔氮原子上的电子在光诱 导下能够跃迁至荧光团的ＨＯＭＯ轨道上，ＨＯＭＯ轨道的电子不能发生受激跃迁，因此荧光团无荧光； 当叔氮原子络合锌离子后，其轨道能级降低，电子不能跃迁，即ＰＥＴ禁阻，此时荧光团ＨＯＭＯ轨道上 的电子能够受激跃迁至ＬＵＭＯ轨道上，当电子回落至基态时发出荧光，由于是长波激发，短波发射， 故只能吸收２个光子，发出１个光子，即双光子诱导荧光，如Ｓｃｈｅｍｅ ２所示． Ｓｃｈｅｍｅ ２ Ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ＰＥＴ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＤＺｎ 在１ ｉｘｍｏＬ／Ｌ ＤＺｎ（３０ ｍｍｏＬ／Ｌ ＭＯＰＳ＋１００ ｍｍｏ￣Ｌ ＫＣＩ＋１０ ｍｍｏ￣Ｌ ＥＧＴＡ，ｐＨ＝７．２）的水溶液中， 采用微量进样器加入Ｚｎ （０～６０￣ｚｍｏｌ／Ｌ）溶液，随锌离子浓度的增大测定其ｕＶ．Ｖｉｓ光谱（图Ｓ２，见本 文支持信息）的变化，加入量小于待测体积的２％．实验结果表明，探针ＤＺｎ的ｕＶ—Ｖｉｓ光谱几乎不随 Ｚｎ“浓度的增大而发生明显变化，出现２个吸收带，一个是位于３２５～５１０ ｎｍ处的强吸收带（中心位于 ４０３ ｎｎｌ附近），另一个是位于３００～３２５ ｎｍ处的弱吸收带（中心位于３１３ ｎｍ附近）．强吸收带是探针 ＤＺｎ固有的紫外吸收带，与ｚｎｎ络合后，自身的大 电子几乎不向ｚｎ 转移，仍能发生７ｒ一７ｒ 吸收跃 迁，因而吸收强度几乎不变．弱吸收带是探针ＤＺｎ中苯环的紫外吸收带，与ｚｎ 络合后，由于大７ｒ电 子并不向ｚｎ 转移，大７ｒ共轭平面保持不变，单一苯环也保持原来的状态，因此其吸收强度不变． ２．２．２探针ＤＺｎ对金属阳离子的选择性 分别用单光子荧光滴定和双光子荧光滴定法考察了探针 ＤＺｎ对金属阳离子的选择性．配制含探针ＤＺｎ（１．Ｏｘ１０ ｍｏｌ／Ｌ）的３０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ（１００ ｍｍｏ￣Ｌ ＫＣＩ＋ １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＧＴＡ，ｐＨ＝７．２）缓冲溶液，取１７份各３ ｍＬ的缓冲溶液，用微量进样器分别加入ｚｎ ， Ｋ ，Ｃａ２＿Ｍｇ２＋Ｂａ２＋Ｆｅ２＋Ｆｅｎ，，，，，Ｐｂ２＋ｃｏ２＋２＋ｃｒｎＣｄ ，Ｍｎ２＋Ｃｕ２＋，， ，，，，Ａｇ ，Ｎａ 和Ｈｇ２十，使离子 浓度分别为２０ ｉｎｍｏｌ／Ｌ，测定各离子与探针组成的混合溶液的单光子和双光子荧光光谱的变化；测定 后分别补加Ｚｎ ，使离子浓度为１ ｐ，ｍｏｌ／Ｌ，再次测定混合溶液的单光子和双光子荧光光谱的变化．加 入量小于待测体积的２％，所有的单光子和 双光子荧光光谱均在Ａ ＝４０３ ｎｍ和Ａ ＝ 川 ■■ＤＺｎ＋Ｍ 十Ｚｎ ８１０ ｎｍ的激发波长下测定，结果如图１所 ，。 示．由图１可见，探针ＤＺｎ对各金属阳离子 富川 的选择性具有明显区别．在未补加锌离子 ” 前，探针对锌离子显示出相当强的选择性， 几乎没有其它离子产生干扰，Ｈｇ ，Ｃｄ 和 ｃｕ 虽能使荧光少量增强，但不足以干扰锌 ＪＪＪｒ｜Ｉ广｜．广｜．厂ＪＩ厂｜．厂１ｌ广＿ 厂１Ｉ ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ Ｊ ｋ １ ｍ １１ Ｏ Ｐ ｑ 离子．补加锌离子后，除Ｋ ，Ｃａ ，Ｍｇ ， Ｆｉ ．】 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ ｏｆ １ ｐｍｏｌ／Ｌ ＤＺｎ ｉｎ Ｂａ 和Ｎａ 不对锌离子产生掩蔽效应外，其 ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ２０ ｍｍｏｔ／Ｌ ｏｆ ｓｏｍｅ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ（ｅｍｐ－ 它离子均能对锌离子产生强烈的掩蔽效果， ｔｙ ｂａｒｓ）ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ １ ｐｍｏｌ／Ｌ ｏｆ Ｚｎ。 使荧光受到强烈的抑制．因此，在Ｋ ，Ｃａ ， （ｆｉｌｌｅｄ ｂａｒｓ） Ｍｇ“，Ｂａ 和Ｎａ 存在下探针能够很好地检 ａ．Ｚｎ ；ｂ．Ｋ ；ｃ．Ｃａ ；ｄ．Ｍｇ ；ｅ．Ｂａ ；ｆ Ｆｅ ； 测锌离子，这些离子的存在不会对锌离子的 ｇ．Ｆｅ ；ｈ．Ｐｂ ；ｉ．Ｃｏ ；Ｊ．Ｎｉ ；ｋ．Ｃｒ ；１．Ｃｄ ； 检测造成影响．一般的锌离子探针均会受 ｍ．Ｍｎ ；ｎ．Ｃｕ ；ｏ．Ａｇ ；Ｐ．Ｎａ ；ｑ．Ｈｇ ． Ｎｏ．４ 黄池宝等：衍生于双氰基二苯代乙烯的用于活体成像的双光子荧光锌离子探针 ｃ 的干扰，而探针ＤＺｎ却对ｃ 不产生响应． ２．２．３探针ＤＺｎ对溶液ｐＨ值的响应 研究了溶液ｐＨ对探针ＤＺｎ的影响（图ｓ３，见本文支持信 息），结果表明，当溶液ｐＨ值从２增加到５时，探针的荧光强度从约７５增加到约９５，其原因可能是在 酸性较强的情况下，过多的Ｈ 与芳胺氮原子结合，导致共轭体系电子云密度大大降低，从而荧光较 弱；当溶液ｐＨ值从５增加到１ １时，探针的荧光强度大体上变化很小．存在ｚｎ 的情况与上述结果类 似．可见，在ｐＨ＝５～１１时，溶液ｐＨ值不影响探针ＤＺｎ对锌离子的检测，即探针ＤＺｎ的环境ｐＨ适应 范围较宽．很多基于ＰＥＴ机制的锌离子探针的ｐＨ适应范围很窄，如文献［１２］报道的探针ｌ１和１２只 能适应生理ｐＨ范围． ２．２．４探针ＤＺｎ对锌离子的单、双光子荧光滴定探针ＤＺｎ对锌离子的单、双光子荧光滴定在含探 针ＤＺｎ（１．０ｘ１０ ｍｏｌ／Ｌ）的３０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ（１００ ｒｅｏｏｌｔ／Ｌ ＫＣＩ＋１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＧＴＡ，ｐＨ＝７．２）缓冲溶液 中进行，单、双光子激发波长分别为Ａ ＝４０３ ｎｍ和Ａ ＝８１０ Ｉｌｍ． 由图Ｓ４和图ｓ５（见本文支持信息）可见，探针ＤＺｎ具有单发射峰，位于４５０～８００ ｎｍ处（中心位 于６１０ Ｂｉｌ附近），随着ｚｎ 浓度的增大，荧光逐渐增强．探针ＤＺｎ的双光子发射峰与其单光子发射峰 相类似，峰宽稍微变窄，位于４５０～７５０ ｎｍ处（中心位于６１０ ｎｍ附近），随着ｚｎ“浓度的增大，荧光亦 逐渐增强． 由探针ＤＺｎ的单、双光子荧光谱可见，探针的荧光峰不但较宽，且最大发射波长达６１０ ｎｍ，这与 单光子最大吸收峰４０３ ｎｍ相差高达２０７ ｎｍ，为探针的斯托克斯位移（Ｓｔｏｋｅｓ ｓｈｉｔｆ），这是作为探针所要 求的显著优点，可以避免激发光对荧光的干扰，提高检测的准确性．发射波长６１０ ｎｍ接近近红外成像 窗口（６５０～９００ ｎｍ），便于显微镜的观测成像． 由单、双光子荧光滴定曲线（图ｓ４和ｓ５，见本文支持信息）可得到探针ＤＺｎ的单、双光子荧光强 度随锌离子浓度的变化关系图（图ｓ６和ｓ７，见本文支持信息），再进行数据的Ｓｉｇｍｏｉｄａｌ拟合得到曲线 （图ｓ８和ｓ９，见本文支持信息），同时也可获得在单、双光子荧光滴定中络合物ＤＺｎ—Ｚｎ 的解离常数 Ｋｏ ：（０．５１±０．０２）ｍｏｌ／Ｌ和 一＝（０．５２＿＋０．０１）Ｉｘｍｏｌ／Ｌ．其倒数即为探针与锌离子的络合常数． ２．２．５ 探针ＤＺｎ络合锌离子的工作曲线 将探针ＤＺｎ和ＺｎＣ１：溶于缓冲溶液（３０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ＋１００ ｍｍｏＬ／Ｌ ＫＣＩ＋１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＧＴＡ，ｐＨ＝７．２）中，按锌离子摩尔分数分别为０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．６， ０．７，０．８和０．９配成总摩尔浓度为１．０ｘ１０ ｍｏｌ／Ｌ［即 （ＤＺｎ）＋ （Ｚｎ ）＝１．０ｘｌ０ ｍｏｌ／Ｌ］的溶液各５ ｍＬ，每份溶液均以Ａ ＝４０３ ｎｍ的光激发，测定在Ａ ＝６１０ Ｈ１ＴＩ处的单光子荧光强度，通过所得荧光 强度并结合其络合常数，分别计算出９份溶液中所生成络合物的摩尔浓度，对应络合物浓度最大的数 据点指示的横坐标值即为形成络合物的探针与锌离子的摩尔配比关系． 由图Ｓ１０（见本文支持信息）可见，当锌离子摩尔分数为０．５时，络合物ＤＺｎ—Ｚｎ 的浓度达到最大， 此时探针ＤＺｎ的摩尔分数为０．５，即探针ＤＺｎ与锌离子形成了１：１的配合物． ２．３探针ＤＺｎ的双光子吸收截面 使用双光子诱导荧光测量技术测定双光子吸收截面，计算公式如下式所示． ＝丽ＳｓＴ］ｒ￣ｒＣｒ６ （１） 式中，Ｓ与ｒ分别代表样品与参比分子；Ｓ为由光电倍增管探测器（ＰＭＴ）采集的双光子诱导荧光信号强 度；叼为荧光量子产率；咖为仪器采集荧光效率（包含信号检测器、光学仪器以及参比与样品所溶溶剂 的折射率的差别对检测波长的依赖程度）；Ｃ为色素浓度；６为双光子吸收截面 ． 以荧光素水溶液（ｐＨ＝１１）的双光子激发荧光发射 作参比，在室温及同一波长下分别测定样品 与参比（溶液为空气所饱和）的双光子激发荧光信号，溶液浓度为１０～～１０ ｍｏｌ／Ｌ时测定样品的６． 测定了向１／ｘｍｏｌ／Ｌ探针ＤＺｎ缓冲溶液（３０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ＋１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣ１＋１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＧＴＡ， ｐＨ：７．２）中加入６ ｔｘｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ 时的双光子发射谱．由图Ｓ１１（见本文支持信息）可见，ＤＺｎ与锌离子在 缓冲水溶液中达到络合饱和时，其双光子发射截面（ ）和双光子吸收截面（６）分别从８和４００ ＧＭ增 至５８０和９３５ ＧＭ，分别增加了７２．５倍和２．３倍；ＤＺｎ的最大双光子激发波长为８１０ ｎｍ． ６５０ 高等学校化学学报 Ｖｏ１．３６ ａ．Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｍａｘｉｍｕｍ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ｅｎｅｒｇｙ，ｅ（ＤＺｎ）＝１０一ｍｏ￣Ｌ；ｂ．ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｍ￣ｉｍＨｍ，ｃ（ＤＺｎ）＝１０ ｍｏＬ／Ｌ，Ａ ＝４０３ ｎｍ； ｃ．ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｏ ｑｕｉｎｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ １０－。’ｍ０Ｌ／Ｌ ｉｎ ０．０５ ｍ０ｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４，ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｅｒｒｏｒ，土１０％ｏｆ ｔｈｅ ｇｉｖｅｎ ｖａｌｕｅｓ；ｄ．ｔｗｏ—ｐｈｏｔｏｎ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｍａｘｉｍｕｍ； ｅ．ｔｈｅ ｐｅａｋ ＴＰＡ ｃｍｓｓ—ｓｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ １０一 。ｃｍ ・ｓ・ｐｈｏｔｏｎ一 ｆ ＧＭ）． ２．４探针ＤＺｎ对锌离子的核磁滴定 图Ｓ１２（见本文支持信息）示出了探针ＤＺｎ（９．５ ｍｍｏｌ／Ｌ，ＤＭＳＯ—ｄ ）分别在０，９．５和９５ ｍｍｏｌ／Ｌ锌 离子存在下的 Ｈ ＮＭＲ谱，相应的各种氢的核磁峰值如表３所示．除了Ｈ ，Ｈ 和Ｈ 的化学位移几乎 保持不变外，其余Ｈ（Ｈ ，Ｈ ～Ｈ。）的化学位移均向低场移动．由于锌离子与氮原子上的孤对电子络 合，哌嗪环上的碳原子所受的诱导效应增强较大，从而促使哌嗪环上的碳原子上氢的化学位移向低场 大幅移动（Ｈ 和Ｈ ）；同时由于吡啶氮原子与锌离子的络合，吡啶上Ｈ 和Ｈ 的化学位移也显著向低场 移动．尤为异常的是，除了氢的化学位移向低场移动外，峰与峰之问的间距也随锌离子浓度的增加而 显著增大，表明探针络合锌离子的能力相当强． Ｔａｂｌｅ ３ Ｈ ＮＭＲ ｄａｔａ ｆｏｒ ＤＺｎ、】．｛ｔｌｌ ｖａｒｉｏｕｓ ｚｉｎｃ ｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｃ（ｚｎ ）／ Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ—ｄ６，４００ ＭＨｚ），６ 竺 ： ： ２ ０ ９．５ ９５ ！ ８．４１９ ８．４２１ ８．４１８ ！ ７．９２０ ７．９２３ ７．９２０ ７．７８５ ７．９０８ ７．９８９ 里！ ７．５６７ ７．５７２ ７．５７０ 旦 ７．４７８ ７．４８６ ７．４９０ 旦ｇ ７．２８１ ７．４１１ ７．５８６ 旦 ７．０６６ ７．０７４ ７．０７５ ６．９８２ ６．９９３ ６．９９７ 里 ３．６６９ ３．７８９ ３．８６９ 里 ３．２６２ ３．３３８ ３．３８ｌ ２．５８４ ２．６７６ ２．７４１ ２．５０２ ２．５０２ ２．５００ ８．５０８ ８．５６３ ８．５９７ ２．５探针ＤＺｎ用于活细胞中锌离子的双光子显微成像（ＴＰＭ） ２．５．１ 小鼠成纤维细胞的培养 将１０％（质量分数）ＦＢＳ、青霉素（１００ ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）和链霉素（１００ ｍＬ）加入细胞培养基ＤＭＥＭ中并混合均匀，用于培养小鼠成纤维细胞．成像前２ ｄ进行细胞筛选处理． 为了标记，先除去培养介质再换上不含ＦＢＳ的ＤＭＥＭ介质．将细胞用１ ｉｘｍｏｌ／Ｌ ＤＺｎ在组织培养室中 （５％ＣＯ：，３７℃）孵化３０ ｍｉｎ，然后用ＰＢＳ缓冲液洗涤３次，并于无色血清游离介质中再孵化１５ ｍｉｎ 后进行成像操作． ２．５．２小鼠脑组织切片的制备与染色小鼠脑组织切片的制备与染色参照文献［１２，２４］方法．切片取 自出生１４ ｄ的小鼠海马体，用薄片切片机于ＡＣＳＦ中切成冠状薄片．将切片用１０ ｉｚｍｏＬ／Ｌ ＤＺｎ于３７℃ 在ＡＣＳＦ中充气（９５％０ 和５％ＣＯ：）浸泡１ ｈ，取出后用ＡＣＳＦ洗涤３次，转移至透明显微镜用贮存盒 （ＭａｔＴｅｋ）中，在双光子共焦显微镜下观察成像． ２．５．３ 细胞与组织显微成像 图２为探针ＤＺｎ应用于小鼠成纤维细胞内锌离子的双光子共聚焦荧光 显微照片（２０倍目镜）．可见，当探针未与锌离子络合时，其双光子荧光很弱，甚至难以观察到；而当 它与细胞内释放出的锌离子络合后发出强烈的荧光，且当加入ＴＰＥＮ俘获锌离子后，荧光又再次减弱． 由此可见，探针ＤＺｎ能清晰地成像细胞中的锌离子，可用于细胞中锌离子的检测与成像分析，且不存 在来自膜绑探针的干扰（在３６０～４６０ ｎｍ处没有荧光）． 为了更进一步研究探针在组织深处的成像，用１０￣ｘｍｏｌ／Ｌ ＤＺｎ在３７℃，含５％ＣＯ 的细胞培养箱 中孵育小鼠脑组织切片０．５ ｈ后，经双光子共聚焦显微镜得到双光子荧光照片．在１２０ ｖｍ处的同一平 面获得了３个图像，加入ＳＮＯＣ前的图像很暗淡［图３（Ａ）］；加入３０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＮＯＣ后，图像变得明亮 清晰［图３（Ｂ）］；当加人０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＰＥＮ后，图像又快速变得模糊暗淡［图３（Ｃ）］．ＤＺｎ．Ｚｎ 荧光持 续时长达约１５００ Ｓ［图３（Ｄ）］，类似地，在细胞成像过程中荧光亦持续相当长的时间．另外，８０～１５０ ｍ组织深处的荧光照片（图４）示出了锌离子在脑组织中的分布情况．以上结果证明，ＤＺｎ能够成像 细胞内游离的锌离子，且能成像活体组织８０—１５０ ｉｘｍ深处的锌离子分布． Ｎｏ．４ 黄池宝等：衍生于双氰基二苯代乙烯的用于活体成像的双光子荧光锌离子探针 ６５ｌ Ｆｉｇ・２ Ｂｒｉｇｈｔ－ｉｆｅｌｄ ｉｍａｇｅ（Ａ）ａｎｄ ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＴＰＭ）ｉｍａｇｅｓ（Ｂ—Ｄ）ｏｆ １ ｐ．ｍｏｌ／１ ＤＺｎ－ｌａｂｅｌｅｄ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｔ ５５Ｏ—１６５Ｏ ｎｍ （Ｂ）Ｂｅｆｉ）Ｆｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｌ １０ ｍｍｏｌ／１ ＳＮＯＣ；（Ｃ）ａｆｔｅ ｒ’ａ（ｈｌｉｌｉｏｎ ｏｔ １０ ｍｍｏｌ／Ｉ ＳＮＯＣ：（Ｄ）ａｆｔ¨ａ （Ｃ）・ Ｉ ＩＷＯ。ｐｈｏｔｏｎ ｔ ｘｔ’ｉｌａｔｉｏｎ ｔｌｕｏｌｖｓｔ、￣ｎｅｅ（ＴＩ Ｅｌ ）ｉｍａｇｅｓ ｗｃＩｅ（ ｏｌｌｅｃｔｅｄ ｕｐｏｎ ｅｘｃｉｔａｔｉｍｌ ａｔ ８１０ ｎｍ ｗｉｔｈ ａ ｆｅｍＲ）ｓｅｃ（ｍｄ ｐｕｌｓｅ． Ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｉｎｍｇｅｓ ｉｆ＇ｍｎ ｒｅｐｌｉｔ’ａｌｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｌｓ（ｎ＝５）．ＳＮＯＣ ｉｓ ａｎ ｅｎｄ‘）ｇｅｎｏｕｓ ＮＯ ｄｏｎｏｒ ｔｈａｔ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｌ ｎｆ Ｚｎ“．ＴＰＥＮ ｉｓ ａ ｍｅｎｌｈＦａｎｅ—ｐｅｎｎｅａｈｌｅ Ｚｎ ｃｈｅｌａＩＩ）ｒ ｔｈａｔ ｃａｎ ｍ ｎ１ｔ ｖｅ Ｚｆ１ ｅＩｋｃ．ｔｉｖｅｌｖ． ３０（）６０（Ｊ ９００ ｌ ２Ｏ（）１５（）（）ｌ ８ Ｔｍ）ｅ／ｓ Ｆｉｇ．３ ＴＰＭ ｉｍａｇｅｓ ｏｆ ａ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｓｌｉｃｅ （Ａ）Ｂｅｆｏｒｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｔ’３０ ｍｍｏＩ／Ｌ ＳＮＯＣ；（Ｂ）ａｆｔｅｒ ａｄｄｉｔｉｏｎ ０ｆ＇３０ ｍｌｌｌＯｌ／１ ＳＮＯＣ；（Ｃ）ａｆｔｅ）・ａｄ‘Ｉｉｌｌ（１ｒ１ ０ｔ’０．３ ｆｌ１ｎ１《）ｌ／１ ＴＩ ＥＮ ｔｌ 】（Ｂ）；（Ｄ）“ ｌａｔｉｖｅ ＴＰＥＦ ｉｎｌｅｎｓｉｔｙ‘）ｆ ａ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｓｌｉｔ－Ｐ ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＩＯ ｔｘｍｏｌ／Ｌ ＤＺｎ【・ｏｌｌｅｃｔｅｔｔ １１ ５５０—６５０『ｌｌ¨ａｓ ａ ｆｕｎｅｌｉＩＩｌ１ ）ｆ ｔｉｍｅ．Ｔｈｅ ＴＰＥＦ ｉｍａｇｅｓ ｗｅｒｅ ｅｏｌｌｅｔ’Ｉｅｄ ａｔ ５５０—＿６５Ｏ ｒｉｍ ａｔ ａ ｄｅｐｔｈ ｏｆ ｃａ．１２０ ＬＬｍ ｗｉｔｈ ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｌＯＯｘ ｕｐｏｎ ｃｘｔ－ｉｔａｔｉ（ｍ ａｔ ８１０ １ｎ１ Ｗｉｔｈ ａ ｆｅｍｔｏｓｅｅｏｎｄ ＤｕｌＳｅ． Ｆｉｇ・４ ＴＰＭ ｉｍａｇｅｓ ｏｆ ａ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｓｌｉｃｅ ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ １０ ｐｍｏｌ／Ｌ ＤＺｎ ｂｙ ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ １００ｘ ａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｐｔｈ ｏｆ ８０（Ａ），ｌＯＯ（Ｂ），１２０（Ｃ）ａｎｄ １５０ ｔｍａ（Ｄ） ｒｒ ＴＰＥＦ ｉｍａｇｅｓ ＷｅＦｔ＇ｃｏｉｌｅｃｔｅｄ ａｔ ５５（）—＿６５０ Ｈｍ ｕｐｏｎ ｅｘｅｉｔａｔｉ（Ｊ『１ ａｔ ８】０ ｒｉｍ ｗｉｔｈ ａ ｆｅｍｔｏｓｅｅｏｎｄ ｐｕｌｓｅ． ６５２ 高等学校化学学报 Ｖ０１．３６ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ ¨ ２．６探针ＤＺｎ的光稳定性 探针的光稳定性是探针在实际应用中的一个重要参数．对ＤＺｎ．Ｚｎ 进行光照射分解发现，在光照 射１ ｈ后，ＤＺｎ—Ｚｎ 在６１０ ｎｍ处的单、双光子荧光强度分别降低了４．３％和１％（图Ｓ１３，见本文支持信 息），证明ＤＺｎ有极好的光稳定性． ２．７探针ＤＺｎ的细胞毒性 采用体外Ｍ１＿ｒ小鼠成纤维细胞毒性实验测试了探针ＤＺｎ是否有毒及毒性大小．ＭＴＦ浓度采用比 色法于５７０ ｎｍ测定，细胞处理与ＭＴＹ分析参照文献［２５，２６］方法进行．采用Ｓｏｆｔ ｍａｘ ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒ— ｓｉｏｎ ５）进行分析，结果如图Ｓ１４所示（见本文支持信息）．可见，ＤＺｎ（０～２０￣ｍｏｌ／Ｌ）对小鼠成纤维细 胞无毒性． ３ 结 论 开发了一个性能优良的双光子荧光锌离子探针，该探针的分子尺寸小，双光子发射截面大（ ＝ ５８０ ＧＭ），无细胞毒性，发射波长较长（６１０ ｎｍ左右，接近理想的可见光成像窗口范围６５０～９００ ｌｌｍ）， 具有明显的斯托克斯位移（２０７ ｎｍ）、极好的光稳定性、适宜的水溶性和优良的细胞渗透性．该探针络 合锌离子后荧光可增强７２．５倍；在生理ｐＨ范围内，探针不显示ｐＨ敏感性；能选择性地检测活细胞 中的游离锌离子，耐时长达约１５００ ｓ，且能探测活体组织８０～１５０ Ｉｘｍ深处的锌离子，不受其它金属离 子与生物膜的干扰． 支持信息见ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｊｃｕ．ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ＣＮ／１０．７５０３／ｅｊｃｕ２０ｌ４０８９１． 参考文献 Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ Ｃ．Ｊ．，Ｋｏｈ Ｊ．Ｙ．，Ｂｕｓｈ Ａ．Ｉ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，６（６），４４９—４６２ Ｖａｌｌｅｅ Ｂ．Ｌ．，Ｆａｌｃｈｕｋ Ｋ．Ｈ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９３，７３（１），７９一ｌ１８ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ Ｃ．Ｊ．，Ｋａｓａｒｓｋｉｓ Ｅ．Ｊ．，Ｒｉｎｇｏ Ｄ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ Ｒ．Ｅ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８７，２０（２），９１一ｌ０３ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５（１３），３８８９－－３８９５ Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ Ｋ．Ｍ．，Ｇｅｕｅ Ｊ．Ｐ．，Ｗｙｎｅｓｓ Ｏ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｓ．Ｆ．，Ｗａｒｄ Ａ．Ｄ．， Ｋｏｍａｔｓｕ Ｋ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｋ．，Ｋｏｊｉｍａ Ｈ．，Ｕｒａｎｏ Ｙ．，Ｎａｇａｎｏ Ｔ．，－，．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００５，１２７（２９），１０１９７－－１０２０４ Ｂｕｒｄｅｔｔｅ Ｓ．Ｃ．．Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ Ｃ．Ｊ．，Ｂｕ Ｗ．，Ｌｉｐｐａｒｄ Ｓ．Ｊ．，ｌ，．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５（７），ｌ７７８—１７８７ Ｇｅｅ Ｋ．Ｒ．，Ｚｈｏｕ Ｚ．Ｌ．，Ｑｉａｎ Ｗ．Ｊ．，Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｒ．， Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００２，１２４（５），７７６＿７７８ Ｂｕｄｄｅ Ｔ．，Ｍｉｎｔａ Ａ．，Ｗｈｉｔｅ ｊ．Ａ．，Ｋａｙ Ａ．Ｒ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，７９（２），３４７＿３５８ Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｋ．，Ｕｒａｎｏ Ｙ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｔ．，Ｎａｇａｎｏ Ｔ．，＿，．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２（４９），１２３９９－－１２４００ Ｌｉ Ｌ．．Ｄｕ Ｌ．Ｔ．，Ｓｕｎ Ｊ．，Ｙａｎ Ｃ．Ｇ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ，２０１３，２９（５），８７４——８７８ Ｂｅｌｉｆｅｌｄ Ｋ．Ｄ．，Ｂｏｎｄａｒ Ｍ．Ｖ．，Ｆｒａｚｅｒ Ａ．，Ｍｏｒａｌｅｓ Ａ．Ｒ．，Ｋａｃｈｋｏｖｓｋｙ Ｏ．Ｄ．，Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ Ｉ．Ａ．，Ｍａｓｕｎｏｖ Ａ．Ｅ．，Ｐｒｚｈｏｎｓｋａ Ｏ．Ｖ． Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，２０１０，１１４（２８），９３１３－－９３２１ ｍ Ｈ．Ｍ．，Ｓｅｏ Ｍ．Ｓ．，Ａｎ Ｍ．Ｊ．，Ｈｏｎｇ Ｊ．Ｈ．，Ｔｉａｎ Ｙ．Ｓ．，Ｃｈｏｉ Ｊ．Ｈ．，Ｋｗｏｎ Ｏ．，Ｌｅｅ Ｋ．Ｊ．，Ｃｈｏ Ｂ．Ｒ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ． ［１２］ ＫｉＥｄ．，２００８，４７（２８），５１６７＿５１７０ ｅｋｓｈｍｙ Ｓ．，Ｈｅｎａ￣Ｍ．Ｍ．，Ｓｉｅｇｅｌ Ｎ．，Ｌａｗｓｏｎ Ｐ．Ｖ．，ＷｕＹ．，ＳｃｈｍｉｄｔＫ．，Ｂｒ６ｄａｓ Ｊ．Ｌ．，Ｐｅｒｒｙ Ｊ．Ｗ．，Ｆａｈｒｎｉ Ｃ．Ｊ ， Ａｍ． ［１３］ ＳｕｍａｌＣｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７．１２９（３９），１１８８８—１１８８９ ｉｓｈｎａ Ｇ．，Ｔｗｉｅｇ Ｒ．Ｊ．，Ｇｏｏｄｓｏｎ Ｔ．， ［１４］ Ｂｈａｓｋａｒ Ａ．，ＲａｍａｋｆＰｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃ，２００７，１１１（４０），ｌ４６０７—１４６１１ ｎ Ｃ．，Ｒｅｎ Ａ．，Ｙａｎｇ Ｎ．， Ｍｏ１．Ｓｔｒｕｃｔ．，２０１１，１００６（１＿３），９１＿＿９５ ［１５］ Ｈｕａｎｇ Ｃ．，Ｌｉｎｇ ｃ．Ｂ．，Ｚｅｎｇ Ｑ．Ｈ．，Ｚｅｎｇ Ｂ．Ｐ．，Ｆｉｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，２０１３，３０（８），９４８—－９５２（黄池宝，曾启华，曾伯平．精细化工，２０１３ ［１６］ Ｈｕａ３０（８），９４８—９５２） １７ Ｈｕａｎｇ Ｈ．，Ｈｅ Ｑ．，Ｌｉｎ Ｈ．，Ｂａｉ Ｆ．Ｌ．，Ｓｕｎ Ｚ．，Ｌｉ Ｑ．Ｓ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｓｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２００４，１５（１／２），８４＿＿８８ Ｈｕａｎｇ Ｃ．，Ｆａｎ Ｊ．，Ｐｅｎｇ Ｘ．，Ｌｉｎ Ｚ．，Ｇｕｏ Ｂ．， Ｗｉｌｅｙ Ｒ．Ｈ．，Ｎｏｔｅｓ Ｉ．Ｇ．， Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏ１．Ｃ，２００８，１９９（２／３），ｌ４４一ｌ４９ １８ ｌ９ ２０ Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９６１，２６（２），５９３＿５９５ ＡｌｂｏｔａＭ．，Ｂ＠ｏｎｎｅＤ．，Ｂｒｅｄａｓ Ｊ．Ｌ．，Ｅｈｒｌｉｃｈ Ｊ．Ｅ．，Ｆｕ Ｊ．Ｙ．，Ｈｅｉｋａｌ Ａ．Ａ．，Ｈｅｓｓ Ｓ．Ｅ．，Ｋｏｇｅｊ Ｔ．，ＬｅｖｉｎＭ．Ｄ．，Ｍａｒｄｅｒ Ｓ．Ｒ． ＭｃＣｏｒｄ—Ｍａｕｇｈｏｎ Ｄ．，Ｐｅｒｒｙ Ｊ．Ｗ．。Ｒｏｃｋｅｌ Ｈ．，Ｒｕｍｉ Ｍ．，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ Ｇ．，Ｗｅｂｂ Ｗ．Ｗ．，Ｗｕ Ｘ．Ｌ．，Ｘｕ Ｃ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８ ２８１（５３８３），１６５３—１６５６ ［２１］ Ｄａｙ Ｐ Ｎ．，Ｎｇｕｙｅｎ Ｋ．Ａ．，Ｐａｃｈｔｅｒ Ｒ．， Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，２００５，１０９（５），１８０３—１８１４ Ｎｏ．４ 黄池宝等：衍生于双氰基二苯代乙烯的用于活体成像的双光子荧光锌离子探针 ６５３ ［２２］Ｐｏｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｋ．，Ｔｓｕｔｓｕｍｉ Ｏ．，Ｒｕｍｉ Ｍ．，Ｋｗｏｎ ０．，Ｚｏｊｅｒ Ｅ．，Ｊｅａｎ—Ｌｕｃ Ｂ．，Ｍａｒｄｅｒ Ｓ．Ｒ．，ＰｅｎＴ Ｊ．ｗ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００４ １２６（３０），９２９１—９３Ｏ６ ２３ ２４ ２５ ２６ Ｘｕ Ｃ．，Ｗｅｂｂ Ｗ．Ｗ．， Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ｂ，１９９６，１３（３），４８ｌ＿＿４９１ Ｗａｎｇ Ｗ．，Ｚｈａｎｇ Ｙ．，Ｌｉ Ｙ．，Ｚｈａｏ Ｑ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ，２０１３，２９（４），６３２—＿＿６３７ Ｒａｐｉｄ Ｍ Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ１．Ｍｅｔｈ．．１９８３，６５（１／２），５５—６３ Ｉ ｉ Ｘ．Ｄ．，Ｙａｎｇ Ｓ．Ｍ．，Ｘｕ Ｈ．，Ｍａ Ｙ Ｇ．，Ｃｈｅｍ．Ｊ．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ，２０１２，３３（１），２ｌＯ一２ｌ４（李晓东，杨淑敏，徐红，马於 光．离等学校化学学报，２０１２，３３（１），２１０—２ｌ４） Ｄｉｃｙａｎ０ｓｔｉｌｂｅｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔｗｏ—ｐｈｏｔｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ Ｆｒｅｅ Ｚｉｎｃ Ｉｏｎｓ ｉｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｉｖｉｎｇ Ｔｉｓｓｕｅｓ ＨＵＡＮＧ Ｃｈｉｌ）ａｏ ’ ，ＬＩＡＮＧ Ｘｉｎｇ ，ＺＥＮＧ Ｑｉｈｕａ ，ＣＨＥＮ Ｈｕａｓｈｉ ， ＺＥＮＧ Ｂｏｐｉｎｇ ，ＹＩ Ｄａｏｓｈｅｎｇ ，ＣＨＥＮ Ｘｉａｏｙｕａｎ （１．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｍ］Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｚｕｎｙｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｕｎｙｉ ５６３００２，Ｃｈｉｎａ ２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｙｉｎｇｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｈｕｒａｌ Ｓｃｉｅｌｗｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｈａｏｇｕａａｇ ｌ／ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｏｇｕａｎ ５ １２００５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ａ ｎｏｖｅｌ ｔｗｏ—ｐｈｏｔｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ Ｚｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｃｙａｎｏｓｔｉｌｂｅｎｅ ａｓ ａ ｔｗｏ—ｐｈｏｔｏｎ ｔｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ａｎｄ ４一（ｐｙｒｉｄｉｎｅ一２一ｙｈｎｅｔｈｙ１）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ Ｚｎ ｌｉｇａｎｄ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ，ａｎｄ ｉｔｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗａｓ ｅｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ Ｈ ＮＭＲ．ＩＲ ａｎｄ ｅｌｅｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｙ ＵＶ—Ｖｉｓ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ—ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉ— ｎｌｅｎｔｓ，ｏｎｅ—ａｎｄ ｔｗｏ—ｐｈｏｔｏｎ ｅｘｃｉｔｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｆｅｍｔｏｓｅｃｏｎｄ ｐｕｌｓｅｓ，ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｃｅｌｌ—ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ—ｉｍａｇｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｔｈｅ ｐｒｏｂｅ ｓｈｏｗｅｄ ａ ７２．５－ｆｏｈｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｈａｎｅｅｍｅｎｔ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｚｎ“， ａ ｌａｒｇｅ ｔｗｏ—ｐｈｏｔｏｎ ａｃｔｉｏｎ ｃｒｏｓｓ—ｓｅｅｔｉｏｎ（５８０ ＧＭ），ａ ｎｏｎｅｙｔｏｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔ，ａｎｄ ｐＨ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ［）ｉｏｌｏ— ｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｒａｎｇｅ，ｗｉｔｈ ａ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ（ＫＴ。 ）ｏｆ（０．５２－＋－０．０１）￣ｍｏｌ／［ ．Ｔｈｅ ｐｒｏｂｅ ｃｏｕｌｄ ｄｅｔｅｃｔ ｌｅｅ Ｚｎ“ｉｆｏｎｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎ ｌｉｖｅ（：ｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｂｏｕｔ １ ５００ ｓ ａｎｄ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｔ ａ ｄｅｐｔｈ ｏｆ ８０～１ ５０ ＬＬｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ｏｒ ｍｅｎｌｂｒａｎｅ—ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｂｅｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｔｗｏ—ｐｈｏｔｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅ；Ｚｉｎｃ ｉｏｎ；Ｌｉｖｅ—ｉｍａｇｉｎｇ；Ｔｗｏ—ｐｈｏｔｏｎ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｃｒｏｓｓ—ｓｅｃｔｉｏｎ （Ｅｄ．：Ｐ，Ｈ，Ｎ，Ｋ） 十Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｐｏｓ｜ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｆｕｎｄｅｄ Ｐｍｊｅｅｔ（Ｎｏ．２０１００４７１２２４），ｔｈｅ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｔ’ｉｅｎｅｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．￥２０１ １０４００００５３６），ｔｈｅ Ｐｌａｎｎｅｄ Ｓｃｉｅｎｅｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌ＂ｏｊｅｅｔ ｆ】ｆ Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．２０１ １ＲＳ４０２０），ｔｈｅ Ｋｔ、Ｙ Ｉａ１）ｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｏｐｔｏｅｌｅｅｔｒｏｎｉｅ Ｉ）ｅｖｉｅｅｓ ａ［１ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆＥｄｕｅａｔｉｏｎ ａｎｔｉ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．２０１２０２），ｔｈｅ Ｐｌａｎｎｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎ（Ｉ Ｔｅｔｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｎ）ｊｅｅｌ ｏｆ Ｓｈａｕｇｕａｎ，ＣＩｎｎａ（Ｎｏ ２０ １ １ ＣＸ／ＫＩ ９）ａｌｕｔ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｋｅｙ Ｉｌｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｄｅｌｍｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｄｕｅａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏａ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｐｒｏｖｉ，ａｃｅ Ｏｆｆｋ・ｅ ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ Ｃｏｕｌｒａｔ［ＫＹ［２０１４］２９６）． 化学工业出版社化学专业图书推荐 碳酸化重碱结晶过程与操作 ｌ 仝著 本书详细论述了不冷式碳化联合制碱制取重碱结晶披术，并与常规联合制碱技术作了比较 和评价。全书按物理化学过程和工程基础，不冷式碳酸化工艺及牛产流程，环流式碳化塔， 工岂指标与操作控制，母液组成、物料平衡和热量甲衡计算等内容分章节介绍 本书可作 为联合制碱工厂引进不冷式碳化技术的培训读＿拳 书 号：９７８７１２２２１９８２４ 定价：９８．ｏＯ元 开本：ｌ６ ｆＨ版时间：２０１５年２月 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● － ● ● ● Ｉ ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 如需更多图 竹息，晴登录ｗｗｗ．ｅｉｐ．ｅｏｍ ｅｌｌ服务【乜话：０１０ ６４５１８８８８，６４５１８８９９（销售ｌ｛】心）
