单增李斯特氏菌检验 方新元 贾立云 蔡扩军。徐敏。蒲敬伟 （１．乌鲁木齐市米东区畜牧兽医站，乌鲁木齐２．乌鲁木齐市天山区畜牧兽医站，乌鲁木齐８３１４００， ８３０００１； ３．乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，乌鲁木齐８３００６３； ８３０００９） ４．生产建设兵团第十二师畜牧兽医工作站，乌鲁木齐摘要：本研究对肉、胴体拭子等４００份单增李斯特氏菌样品进行 养箱购自上海一恒科学仪器有限公司。 前增菌，然后用荧光ＰＣＲ方法对前增菌样品进行检测，挑取阳性样 ２方法 品进行后续的分离、鉴定。结果显示，本研究在传统单增李斯特 ２．１检验程序 氏菌分离、鉴定方法基础上增加了荧光ＰＣＲ初步筛选，提高了检测 的灵敏度与特异性，省工省时，最终分离Ｎ５株单增李斯特氏菌。 关键词：单增李斯特氏菌；荧光ＰＣＲ：分离：鉴定 单核细胞增生李斯特氏菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，ＬＭ），简 称单增李斯特氏菌，是近年普遍受到关注的食源性人畜共患病原 菌 ＿２］。人、畜感染该菌后可引起的败血症、脑膜炎及单核细胞增 多，也可造成孕妇流产、死胎，其危害日益受到重视 。】。ＬＭ存 在于许多食品加工环境中，能在各种食品、加工厂、家居环境及 食品服务机构，特别是冷藏或冷冻储藏温度下长期存活，是冷藏 食品威胁人类健康的主要病原菌之一 】。ＬＭ主要污染肉类、乳制 品和蔬菜等，欧美国家发生了多起由ＬＭ引发的食物中毒，病死率 高达达４０％，我国也加强了对ＬＭ的主动监测，因此，开展对ＬＭ 的检测技术研究具有重要的公共卫生学意义Ｉ６Ｊ。 国标传统检测程序方法对ＬＭ进行分离、鉴定，耗时长、灵 敏度低，尤其在有较多样品量的情况下，完全采用国标检测方法 试剂药品消耗多、工作量大。近些年，荧光ＰＣＲ方法发展迅速， 具有特异性好、灵敏度高、操作简单、安全、自动化程度高等很 多优点，但只能检测到是否存在病原菌，最终分离不到ＬＭ菌株 ［７－８］ｏ鉴于此，本研究将两种方法结合起来，对ＬＭ检测技术方法 进行了优化改进，以期该病的防控提供技术支持。 １材料 １．１样品 畜禽粪便、畜禽肉、酮体拭子、环境拭子各１００份，一共４００ 份样品。 １．２主要试剂 显色培养基购自法国科玛嘉公司；细菌分离鉴定的其他试剂 购自北京陆桥公司；细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒购白天根生化科 技（北京）有限公司；单增李斯特氏菌荧光ＰＣＲ检测试剂盒购自 澳东检验检测科技有限公司；细菌鉴定卡购自美国ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｉｎｃ 公司。 １．３标准菌株 单增李斯特氏菌标准菌株购于中国工业微生物菌种保藏管理 中心（ＣＩＣＣ）。 １．４主要仪器 法国梅里埃全自动微生物鉴定仪ＶＩＴＥＫ一２一ＣｏｍｐａｃｔｌＩ；恒温培 基金项目：维吾尔自治区科技厅青年科技创新人才培养工程 （ｑｎ２０１５ｊｃ０５８）；乌鲁木齐市科技局现代服务业促进计 划项目（Ｙ１４１３１０００２）；兵团现代农业科技攻关与成果转 化计划项目（２０１５ＡＣ０２６） 作者简介：方新元（１９６７一），男，本科，高级兽医师，主要从事动 物疫病防治工作。 １．．．．．．．．．．．．．．．．．．＿＿ｊ ３０＋１￣Ｃ，２４ｈ １ｌ ［ ２．２操作步骤 ２．２．１前增菌 以无菌操作取样品２５ ｇ（ｍＬ）加入到含有２２５ ｍｌ ＬＢ１增菌液 的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质１～２ ａｒｉｎ；或放人盛有 ２２５ｍｌ ＬＢ１增菌液的均质杯中，８０００～１００００ ｒ／ｍｉｎ均质１～２ｍｉｎ， 于３０ ｏＣ ４－１ ｏＣ培养２４ ｈ【９Ｊｃ 若为环境拭子样品，将盛有６ｍＬ ＬＢ１的离心管直接带到采样 地点，采集环境拭子后快速打开盖子，将拭子放进后，快速盖上 盖子，带回，于３０℃±１℃培养２４ ｈ。若为粪便样品，将盛有６ｍｌ ＬＢｌ离心管直接带到采样地点，采集粪便拭子后快速打开盖子， 将拭子放进后，快速盖上盖子，带回，于３０℃±１℃培养２４ ｈ。 ２．２．２ ＰＣＲ初筛 用细菌ＤＮＡ基因组提取试剂盒，参照说明书提取细菌核酸。 用单增李斯特氏菌荧光ＰＣＲ检测试剂盒，参照说明书进行荧光 ＰＣＲ检测。 ． ２．２．３增菌 移取０．１ ｍｌ ＰＣＲ阳性ＬＢ１，转种于１Ｏ ｍｌ ＬＢ２增菌液内，于 Ｅ臣墨２０ｉ ７￣Ｅ９ｉｑＴ ３．３节、 氏染色镜榆 ｗｗｗ．ｓｙｄｋｚｚ．ｃｏｍ ３０Ｏ（：±】 ：培养１ ８ ｈ～２４ ｈ ２．２．４ 分离 ｌ＿Ｍ １ ｒ‘ 、 【 …性，¨ ，大小乃（０．４～０．５ ｔｘ １１１）ｘ 特氏 取ＬＢ２ 次增 Ｉ液划线梭干叶ｔ ｊ： ＬＣＡＭ琼『ｊ 、Ｉ 扳训 （（）．５～２ ｕ ），尤芽胞，ｆ 或俏弯， 端钝 ．常 、 ＃刑排 刈， ４ 包堵养旗 Ｋ的 落 ｊ ３６ ：±Ｉ 』 芥２４～４８ ｔｌ，脱祭符个、ｆ 橄』 ２．２．５革兰氏染色镜检 刈分离 定 球ｊ＾Ｉ 的ｌ』Ｊ跹闲 逊 纯化，－‘ 【 愉 ２．２．６ 全自动微生物鍪定仪进行生化奎定 根据 、 包 ｆｆ ，选抒刈Ｊ 定Ｉ ．川浊…协＇ｆ Ｊ＂２－ ，镜 自动做，卜物鉴定仪 Ｋ一２一ｃｏｎｉｐⅢ・Ｉｌｌ逃仃 ３结果 ３．１ 荧光Ｉ ＣＲ扩增结 荧光ＰｃＲ榆ｉ州， Ｊ …Ｊ ｒ５ｆｊ｝ ｊ—ｆ ，Ｉ冬『ｌ 图ｌ ＬＭ荧光 Ｒ检测结果 圈２ ＬＭ在ＰＡＬＣ／ｋＭ琼脂平板的菌落 ３．２分离平板前 瞍 色结 阳性 落 ｌ，＾Ｉ （：ＡＭ 忻、 ｝反』为小的 肜从殊乜 ，Ｊ州 仃抹黑包水解 ．仃 ’ 潜 １’ 包 ， ２； ｌ 科 崩 斯特 蔺 乜』 芥 ㈨０特 ： 删监色 带仃ｌ １包 换 （ ＜３ＩｌＩＩ『１），【冬【３ 图３单增李斯特氏菌在显色培养基上的菌落 图４单增李斯特氏菌革兰氏染色镜捡 ３．４令ｎ础微，ｔ－物鉴定仪进行生化鉴定 绛个¨ ｜ＪＪ做 物鉴定仪进仃１ 化鉴定， 分离…５侏Ｉ．．．． ４讨论 近 ＂１－， ｌ｛浊俄靠 ｆ火述简他、敏感特 等优 一、 ，很 快们㈨术疾 诊断、厶』Ｊ物疾病榆测、食ｔ 奠令等领域 刨』 ‘泛 川 ＩｌｌＩ 小 ｆ究利川佚 Ｉ｛ 法ｘ￣Ｊ＇４０（）份１ Ｍ仆榆样 ｌｌｌ进仃卡ＪＪ步 筛选，选收… ｒＩ ・ｉＩｉｆ ｌｌｆ进行下一步分离 ，橄人地捉『岛ｒ Ｌ．ＭＩ＇ｆＪ， 检…卒干¨ｌｆｉ－效半，ｌ１ ＿约＿ｒ大 的 刹｝Ｅ村．竹叫竹，Ｊ 似Ｊ １陔注意的址．…Ｊ 伏比定｝￣ ，Ｐ ３／只愉测痫 的梭限， 小能区分 病 蔺址 ｊＩ仃 物 ； 性 此…ｉ１仃 ｌ＿Ｍ荧比 Ｒ为 ， ｝ｊ＿ Ｉ『ｌ １Ｍｉｔ．ｑ‘ 物学活 ，才 ｒ【ＩＩ能分离 ＩｊＩ．Ｍ 侏 参考文献 『１】冯社』，农刖， 忮玲．广安ｆｆ ｉ ．１＾一 梭细ｊＪ也增 拿斯特 污 染 测纳 分析…．Ｉ…ｌ 【ｊ 榆验杂忠．２０ｌ ７，【４）：５８３～５８４ Ｉ ２Ｉ 尖Ｊ令玲， №； ，ｌｒ －力． ．２（）ｌ ５‘ ｆｌ】』 竹坝包装熟肉制Ｉ； Ｊ ：Ｊ１１ １ｌ 过 的 状删 … Ｉ究，２０１ ７，（５）： ８３４—８３６． Ｉ３ｆ 蕊 ．，５秀仆．ｒ术川蜘 ＪＬ氍 核 ”也增多 ！圻４牛 】ⅡＩ自膜炎２ 倒…．ＩＬ￣：Ｉ曲 ’ ：： 忠．２００１．（１０）：６３—６５． １４＿ ｒ海涛，张抗怀． 淼．等． １＝幺＿细ｉＪｉ￣Ｊ－ｆ，＇ Ｉ Ｌ ！ｑ 特 脑幢炎的临 床特 及机悠染治 ｊ １．１Ｉ 围感染控制杂忠，！（）ｌ ７，ｌ６（８）： ７３３—７３６． Ｊ５１ ］：热协，乔ｔｉｔ ，竹小协， ２０ｌ０ 汀 ）ｊ：竹 源 敛痫 峨测分 ￣ｔ？ｌＪｌ现ｆ 颅防 ：，２（）ｌ ３．４０（１７）：３ｌ ７（）一３Ｉ ７２ Ｊ Ｗｌｌ１１ｇ ｌＩＣ， …１１ｇ（： Ｈ、ｆｌｒＩ Ｐｌ１【ｌｈｉｉ。ｉＩ ｙ．‘ ｌ１ ａｄｈ ㈨（ ， （ 。Ｉ【ｌＩ【Ｉ ｘｉ ｒｌ｝ ． ＩｌＩ１ ｒ ＩＰｉ１Ｉ ｒ ｒｆｌｆ『１ｘｉ ｇｒＩＩｊ（。１Ｉ ｙ Ｉｆ ＨＩ：ｌ１ ｖ ｒｆ１ Ｖｉｌ）Ｉｉ‘） ｐａｒａｈ￣ｌｔ ｍｏｌ＇．Ｉｉｃ Ｉ川．Ｊ ｒ¨【ｌＩＩ Ｐｍｔ，２００５，６８（Ｉ）：１５４—１５６ Ｈ柏． 啉巡，洲改． ． 源 致 寸衙队述俭测技水研究逊腱 … Ｉ ＾科 ’ ，！（）ｌ２．３３（２１）：３３２—３３９． Ｉ８】徐 ． 爨峰 品巾 核细胞增 挛断特 史Ｉｔ，』荧光ＰＣＲ怏 速榆；『ｌ！ｌ』 ‘法ｆ』０业 ‘Ｉ Ｊｆ巾Ｊ 人 共患 对 、 ：４１｛，２００７．２３（４）： ３８０—３８３ 『９１ 人【 ｊ 和ｌｌ｝ ｌ１Ｕｔ－ ５（；Ｉ｛４７８９．３０—２０ｌ６｛ ｌ Ｊ安令ｌ 家 准食 ｌ 敞 物 、ｊ ：愉验 、 核细 增ｑ！ 斯特【 伶验 —Ｅ 小阳标 准…坩ｌ ．２（）１７． Ｉ１ｏＩ刘 Ｉ ，刈碱，拿洲 ， ．食实时定ｆ 荧 Ｉ｛怏速鉴定食品 － 细胞＿｝ｆｌｊ Ｉ Ｌ 斯特【 …．食品发个埙 愉测学，２０ｌ７． （１ １－２５ ＿－－５￣ ．
