比色法测印楝种仁提取物中柠檬苦素类物质的含量_李永红

比色法测印楝种仁提取物中柠檬苦素类物质的含量

󰀁

李永红,张󰀁毅,肖卫民,杨光伟*

(西南农业大学生物中心,重庆󰀁400716)

摘要:印楝素(Azadirachtin,C35H44O16)以及相似的柠檬苦素类物质(AZRL,azadirachtinrelatedlimonoids)与加入了硫酸的香兰素甲醇溶液有显色反应。以此为基础,通过选择比色波长及优化香兰素浓度、硫酸加入量、反应时间几个因素,得到一种用比色法测定印楝种仁提取物中AZRL含量的方法。并测定了3种印楝种仁提取物中的AZRL含量。关󰀁键󰀁词:印楝素;柠檬苦素类;比色法中图分类号:Q503󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁文献标识码:A

DETERMINATIONOFLIMONOIDSINNEEMSEEDKERNELWITHCOLORIMETRY

LIYong-hong,ZHANGYi,XIAOWei-min,YANGGuang-wei*

(BiotechnolicalTechnologyResearchCenter,SouthwestAgriculturalUniversity,Chongqing400715,China)

Abstract:AcolorimetricprocedurefordeterminingAZRL(azadirachinrelatedlimonoids)contentsintheextractsfromneemseedswasdevelopedbyselectionforadesirablewavelengthandoptimizationofthereactionconditions(vanillinconcentration,volumeofH2SO4added,andreactiontime)basedonthefactthatacolorizationreactionoccursbetweenazadirachin(C35H44O16)andAZRL,ontheonehand,andacidifiedvanillininmethanol,ontheother.AppliedtodetermineAZRLcontentin3neemkernelextracts,thisproceduregavesatisfactoryresults.Keywords:Azadirachtin;limonoids;colorimetry

󰀁󰀁印楝(AzadirachtaindicaA.Juss)是楝属热带植物,原产印度、巴基斯坦等国。从1968年,Butterworthetal.[1]从印楝中分离得到印楝素(Azadirachtin,AZ)并证明其对沙漠蝗具很强的拒食活性后,经过几十年的研究,发现印楝素对8目农林、仓储、卫生害虫具有拒食、驱避、影响生殖、干扰生长发育等作用。更为重要的是印楝质农药在环境中易降解、无残留、害虫也不易产生抗药性,对人畜、有益生物安全。所以印楝质农药被认为是一种极具开发前景的植物源生物农药。

印楝素(C35H44O16)是一种高度氧化的四环三萜类物质(柠檬苦素类),是其中活性最高、最重要的化学物质。印楝素在种仁中含量最高(0.2%~0.6%),

󰀁

[2]

但印楝素含量受产地气候、土壤条件影响而差别较大。在印楝中除了印楝素外,还有nimbin,salannin等多种柠檬苦素类物质,其约占到已发现的300多种化合物的1/3[2~3]。这些物质同样具有拒食、干扰生长发育等与印楝素相似的作用。所以印楝的粗提物在印楝素含量相同的情况下,比印楝素纯品表现出更强的杀虫活性。

在对印楝质生物农药的研究中,一直希望有一种简便、快速、灵敏的定量其中活性物质的方法。在印楝质农药生产中,更是需要一种这样的检测技术。印楝提取物样品中由于印楝素相似的柠檬苦素类物质(AZRL,azadirachtinrelatedlimonoids)的存在,DaiJian-mingetal.[3]建立了一种用比色法测样品中AZRL含

收稿日期:2002-10-16

作者简介:李永红(1978-),男,河南安阳人,西南农业大学硕士研究生,从事生物化学及分子生物学研究。*为通讯作者

第25卷第2期󰀁󰀁󰀁󰀁李永红等󰀁比色法测印楝种仁提取物中柠檬苦素类物质的含量量的方法,用一种简单快速的方法检测样品中活性物质的含量。但作者在实际的应用中却难以达到其做的结果。本文就是对方法的各种条件进行了优化,建立了一种适用的比色法测印楝种仁提取物中柠檬苦素类物质的含量。

次重复。

151

2󰀁结果与分析

2.1󰀁波长的选择

用所得的印楝素样品(AZ)及从印楝种仁提取到的2种物质(S1,S2)溶于二氯甲烷配成一定浓度的溶液,保证显色后能在比色的范围之内。在不同波长(400~700nm)下测其光吸收值,发现在560~580nm之间光吸收值最高(图1)。在波长570~580nm之间,577nm处有最大的光吸收值(图2)。所以比色时选择波长577nm,这与DaiJianmingetal得到的结果是一致的。

1󰀁材料与方法

1.1󰀁试剂和仪器

香兰素,甲醇,二氯甲烷,四氯化碳,石油醚,正己烷,乙酸乙酯,氯仿,无水乙醇,浓硫酸(98%),所用试剂都为分析纯。印楝素(95%,购于Sigma公司),硅胶G(100~200目,青岛海洋化工生产),硅胶G普通薄层板(烟台大学生产)。印楝种子10kg。722可见光分光光度计,旋转蒸发器,真空泵。

1.2󰀁方法

1.2.1󰀁印楝素(AZ)的提取分离󰀁采用DRSchroed-erd[4]的提取方法(方法见参考文献)从印楝种仁中分离印楝素,为一白色粉末。用薄层层析检测,不同的展开溶液都得到单个斑点,Rf值与印楝素标准样品一致。所用展开溶液为乙酸乙酯󰀁正己烷=3󰀁1,乙酸乙酯󰀁氯仿󰀁正己烷=1.5󰀁1.5󰀁1,二氯甲烷󰀁甲醇=20󰀁1。用这种提取物作为标准样品。

1.2.2󰀁样品的提取方法󰀁印楝种子剥去种壳,种仁在40~60󰀁下烘箱中干燥10h,用粉碎机粉碎为粉末。取100g该种子粉置500ml磨口三角瓶中,加入正己烷去脂(250ml󰀁3,8h)。再加入甲醇浸提(250ml󰀁4,8h)。合并甲醇浸提液,旋转蒸发器中40󰀁真空浓缩。得到浓缩产物溶于甲醇,加入等量蒸馏水。等量的石油醚萃取3次,用二氯甲烷萃取3次,浓缩二氯甲烷萃取液(40󰀁,真空),得到样品1(Sample1,S1)。重复上面提取步骤,用石油醚萃取之后,用等量的CCl4󰀁石油醚(4󰀁6)萃取三次。CCl4󰀁石油醚(4󰀁6)萃取溶液在40󰀁浓缩后得到物质为样品2(Sample2,S2)。最后再用等量二氯甲烷萃取3次,二氯甲烷萃取液浓缩。二氯甲烷提取物上硅胶柱,乙酸乙酯洗脱。搜集洗脱液,40󰀁浓缩,得到物质为样品3(Sam-ple3,S3)。

1.2.3󰀁比色法󰀁待测样品溶于二氯甲烷溶液,取1.4ml加入试管中,再加入香兰素乙醇溶液(0.02g/ml)0.4ml,用手振荡混合均匀,静置2min,分3次加入浓硫酸(98%)0.6ml,每次加入后迅速振荡10s。然后加入1.4ml甲醇溶液,注意小心振荡均匀,溶液变为蓝绿色的。静置10min后,用1cm比色杯测其光吸收值(577nm)。对照只加入等量的二氯甲烷;3

波长/nm

图1󰀁不同波长与光吸收值󰀁󰀂󰀁S2󰀁󰀁󰀂 󰀂AZ󰀁󰀁󰀂 󰀂S3

波长/nm

图2󰀁不同波长与光吸收值󰀁󰀂󰀁AZ󰀁󰀁󰀂 󰀂S3

2.2󰀁反应时间的选择

显色后,在测光吸收之前反应时间的长短对光吸收值有影响。在不同的反应时间下,溶液10min后光吸收值达最高,并保持稳定(图3)。所以选择10min的反应时间。反应时间与DaiJianmingetal所选择的5min有差异,这可能是溶液的体积增大所致。

反应时间/min图3󰀁反应时间与光吸收值

2.3󰀁香兰素浓度的选择

不同浓度的香兰素乙醇溶液,5mg/ml,15mg/152西󰀁南󰀁农󰀁业󰀁大󰀁学󰀁学󰀁报󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁2003年4月

而通过CCl4与石油醚混合溶液萃取除去提取物中弱极性物质,再通过硅胶柱层析分离强极性杂质成分,得到的样品3中AZRL的含量达81.35%。可见这种提取方法得到了种仁中大量的柠檬苦素类物质。

ml,20mg/ml,25mg/ml,40mg/ml,用上面的方法加入不同试剂,在577nm波长下测光吸收值。从图4看出,香兰素浓度在20mg/ml时有最大的光吸收值。

浓度/mg󰀁ml-1

图4󰀁香兰素浓度与光吸收值表1󰀁不同硫酸加入量溶液所呈现的颜色

硫酸加入量/ml

0.30.60.750.91.2

光吸收值0.0060.3950.5871.1191.552

溶液颜色淡绿色蓝绿色蓝绿色蓝绿色黄棕色

AZ浓度/mg󰀁ml-1

图6󰀁标准曲线(AZ浓度与光吸收值)

表2󰀁样品中AZRL的含量

样󰀁品Sample1Sample2Sample3

浓度/(mg󰀁ml-1)

2.386.890.593

光吸收值0.7440.8630.603

AZRL/%25.509.9081.35

2.4󰀁浓硫酸加入量的选择

加入浓硫酸的量能影响到显色,实验在选择不同的加入量的基础上,寻找合适的浓硫酸的量。从表1中可看出,不同硫酸浓度,样品的所显颜色有差异。加入0.3~0.9ml浓硫酸溶液呈蓝绿色,加入1.2ml浓硫酸溶液过度氧化呈现棕色。不同的硫酸加入量,溶液的光吸收值加大(图5)。选择0.9ml为适宜的硫酸加入量,这样溶液呈现蓝绿色,又能增加反应灵敏度。

3󰀁讨论

在薄层层析分离中,加入硫酸的香兰素乙醇溶液作为萜类物质的显色液。利用这种显色特性用比色的方法来检测印楝提取物中AZRL活性成分的含量是可行的。与DaiJianming方法比较,硫酸加入量及反应时间有所增加,反应溶液体积也增大了2倍,这样可以有足够量的溶液用于比色。由于在提取过程中对样品做了纯化,如用石油醚萃取去除残留的脂类成分,而且也去除样品中弱极性的萜类物质,包括除柠檬苦素类物质之外的一部分萜类,这样可避免AZRL之外的萜类物质的干扰。其实在种仁中,AZRL约为其他简单萜类的73倍,简单萜类所占比例很低,

硫酸量/ml

图5󰀁浓硫酸加入量与光吸收值

2.5󰀁绘标准曲线

AZ样品溶于二氯甲烷溶液,在0~0.8mg/ml浓度范围内,用这种比色法,绘得标准曲线如图6所示(R=0.9989),其中浓硫酸加入量为0.9ml,反应时间为10min。

2.6󰀁样品中AZRL含量的测定

用此比色方法测定了从印楝种仁中得到的3种提取物中的AZRL的含量,结果见表2。样品1与样品2中的AZRL含量经香兰素比色法测定分别为25.5%和9.9%,样品3为81.35%。可见在提取过程中种仁中的柠檬苦素类物质,大部分集中于二氯甲烷萃取液中,

2

干扰不大。但对印楝叶的提取物由于其中其他萜类物质所占比例很大,会造成干扰,影响测定结果。

这种比色法测印楝种仁提取物中AZRL的含量,由此可以估计样品的活性,比如杀虫活性。如果知道特定样品的AZRL中AZ含量,就可以用这种比色的方法快速的测定样品中AZ的含量。参考文献:

[1]󰀁JHButterworth,EDMorgan.Investigationofthelocustfeed-inginhibitionoftheseedsoftheneemtree(Azadirachtaindica)[J].InsectPhysiology,1971,(17):969-977.

[5]

(下转第156页)

156西󰀁南󰀁农󰀁业󰀁大󰀁学󰀁学󰀁报󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁2003年4月

及营养价值较高的食品资源。据报道,以鱼腥草为主要原料制成的鱼腥草茶、鱼腥草饮料、鱼腥草与茶相伍的复合饮料等保健食品可望在癌症治疗(尤其适用于放疗、化疗病者)、老年病防治、多种感染性疾病控制及健身美容保健方面发挥更大作用。因此,常吃鱼腥草等野菜和常喝鱼腥草天然饮料对人体健康大有裨益。特别是患高血压、糖尿病、气喘病的人多喝些鱼腥草饮料(配成低盐咸饮料更适合),对治病健身更有利。

4.2󰀁该产品通过2年的生产试验并投放到市场试销以来,一直受到消费者的喜爱。他们一致认为该产品口感好、清凉,老少皆宜,具有拓展出口外销市场和国内野菜饮料市场的潜力。目前正准备申报国家专利和申请卫生及食品部门审批,尽快产业化生产。相信这一成果的推广应用,将会产生较大的效益。参考文献:

[1]󰀁Xiaomei.󰀁STUDYONNUTRITIVEVALUEOFSOMEEDI-BLEWILDHERBSANDPROSPECTSFORPOPULARIZINGTHEHERBS-GROWING󰀁[J].InternationalConferenceonELEHLABSTACTS,1996,(5):39.

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[3]󰀁郭文场.野菜栽培与食用[M].北京:中国农业出版社,

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[6]󰀁徐怀德.新型饮料加工工艺与配方[M].北京:中国农业

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[7]󰀁龚玉荣.应用统计学[M].北京:中国铁道出版社,2000.

B(蔗糖)等4因素各水平差异显著,即A(澄清的鱼腥草汁)为感官鉴定的主要影响因素,它的不同量对鱼腥草饮料口感影响很大。表3看出配方6得91分为

最高,为茶色,具有一定量的抗菌成分和明显鱼腥草的风味,入口清爽、柔和协调、清香宜人。据R值(极差)可以看出影响感官鉴定的因素排列顺序为A>B>C>D>E,配方理想组合为A2B2C2D4E3,与配方6基本一致。因此,分析得出最佳配方为A2B2C2D4E3,即澄清的鱼腥草汁用量35%,蔗糖5%,蜂蜜2.2%,柠檬酸0.4%,柠檬酸钾0.3%,水为57.1%(上述百分比均为质量分数)。3.2󰀁稳定剂的选择

由于鱼腥草汁中含少量果胶质和其他植化成分(树脂、蜡质等),在存放过程中各粒子的垂直运动遵循Stokes理论,在受力的情况下,会发生沉降。饮料体系的稳定性主要受到各组分间密度差、粒子大小和介质粘度等因素影响。但实际上,体系中粒子在相互间的引力和表面张力的作用,有聚结变大的趋势。因此,体系的粒子强度、表面张力的大小也是影响其稳定的重要因素。为了改变影响饮料体系的各因素,提高产品的稳定性,需加入微量稳定剂。对加入稳定剂[4]

种类和用量进行小试,结果如表5。

表5󰀁不同稳定剂与用量对产品品质的影响/102(g󰀁ml-1)

序号12345

海藻酸钠k-卡拉胶

CMC

CMC+海藻酸钠0.12+0.03CMC+k-卡拉胶0.12+0.10

稳定剂

用量/%稳定性0.100.030.12较好较好

一般一般较好较好较差

流动性一般一般一般较好较好

透明度一般一般一般

󰀁󰀁由表5可以看出,稳定剂的种类与用量:0.12%CMC󰀁Na+0.10%海藻酸钠为最佳。

4󰀁鱼腥草天然饮料的应用前景

4.1󰀁鱼腥草既可食用,又可治病,为一种药用、保健

(上接第152页)

[2]󰀁HSchmutterer.Propertiesandpotentialofnaturalpesticides

fromtheneemtree,Azadirachaindica[J].AnnualReviewEntomology,1990,(35):271-297.

[3]󰀁DaiJianming,VAYaylayan,GSVijayaRaghavan,etal.Ex-tractionancolorimetricdeterminationofazadirachtin-relatedlimonoidsinneemseedkernel[J].AgriculturalFoodChem-istry,1999,(47):3738-3742.

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