考马斯亮蓝

一、 标准曲线

一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

二、 蛋白质含量测定方法 1、 凯氏定氮法 2、 双缩脲法

3、 Folin-酚试剂法 4、 紫外吸收法 5、 考马斯亮蓝法

三、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 （一）、试剂：

1、 考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。

2、 标准蛋白质溶液：

纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。 （二）、器材：

1、722S型分光光度计使用及原理（）。 2、移液管使用（）。 （三）、标准曲线制作： 试管编号 0 1 2 3 4 5 6

100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5

摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色

2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。 1）、利用标准曲线查出回归方程。 2）、用公式计算回归方程。 3）、或用origin作图 ，测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。 4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 （四）、蛋白质含量的测定：

样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。

实验六 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G－250法）

一、目的

蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。

二、原理

考马斯亮蓝G－250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在0～1000μg范围内，蛋白质一色素结合物在 595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。

三、仪器、试剂和材料

1．仪器

（1）分析天平

（2）具塞刻度试管 10ml× 8 （3）吸管 0.lml×I，lml×Z，5ml×I （4）研钵 （5）漏斗

（6）离心管 10ml （7）容量瓶 10ml （8）离心机

（9）721型分光光度计 2．试剂

（1）标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成 100 pg／ml的原液。 （2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容到 1000ml。

此溶液在常温下可放置一个月。 3．材料 绿豆芽

四、操作步骤

1．标准曲线的制作 取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。 操作项目 标准蛋白质溶液(ml) 蒸馏水(ml) 管 号 1 2 3 4 5 6 0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 G-250试剂(ml) 蛋白质含量（μg） 各5 0 20 40 60 80 100

盖上塞子，摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在 l h内完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。

2．样品中蛋白质含量的测定

（1）准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定客至刻度。

（2）另取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G－250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。

五、结果处理

根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：

样品蛋白质含量（μg／g鲜重）＝（查得的蛋白质含量（μg）×提取液总体积（ml））／（样品鲜重（g）×测定时取用提取液的体积（ml））

六、注意事项

比色应在出现蓝色2 min～l h内完成。

七、思考题

1．考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？

2．如何正确使用分光光度计？

参考文献

鲁子贤。蛋白质化学。北京：科学出版社，1981

文树基。基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，1994 张龙翔．生物化学实验技术。北京：人民教育出版社，1981