包涵体的形成原因及其处理方法

包涵体的形成原因及其处理方法

邝爱丽　陈圆圆　彭志峰　郑鹿平　付仁一　徐　雪　郭伦涛　王川庆3

(河南农业大学牧医工程学院　河南郑州　450002)

　　20世纪90年代以来,基因重组技术得到很大的发展,越

来越多的工程菌(或工程细胞)被构建。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统。大肠杆菌由于遗传背景清楚,容易培养以及有大量可供选择的克隆载体与表达载

1〕

体,使之成为人们克隆表达外源基因的主要细菌〔。然而,在实践过程中,一个十分棘手的问题是许多外源基因在大肠杆菌、酵母等表达体系中表达时,往往以包涵体形式存在,高效表达的重组蛋白在细胞内凝集,形成不溶的、无活性的固体颗粒。一般含有50%(质量分数)以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白、环状或缺口的质粒DNA,以及脂体、脂多糖等,大小为0.5～1μm,具有很高的密度(约为1.3mg/ml),无定形,非水溶性,可溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。因此如何分离纯化这些工程菌所表达的重组蛋白则是基因工程技术产业化所面临的重要问题。这一工艺过程复杂,需要较高的技术和先进的设备条件,且无固定模式可以借鉴,主要靠经验和实践摸索,具有很高的挑战性。

防止水解酶作用的试剂,如酶的抑制剂、EDTA(乙二胺四乙酸)。破菌的方法很多,主要包括以下几种:(1)渗透破碎法:这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。(2)冷热交替法:把待碎样品投入90℃左右水中维持数分钟后取出投入冰浴内,可使大部分细胞破碎。可用于提取蛋白质和核酸。(3)反复冻融法:把待碎样品冷却到-20℃,冻固后取出,缓慢解冻,如此反复操作,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破导致部分细胞及胞内的颗粒破碎,但也可使生物活性物质失活。这种方法虽简单方便,但对温度变化敏感的蛋白质却不宜采用。(4)超声波法:使用超声波仪使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。根据不同待碎样品采用不同频率,不同时间;另外,超声波处理时溶液温度升高会使不耐热的物质失活,因此使用时为防止温度升高,除间歇开机外,还需人工

6〕

降温。避免溶液内存在气泡,这样会使蛋白质变性〔。(5)溶菌酶处理法:多用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。在每毫升含2亿个细胞的悬液中加100μg至1mg溶菌酶,37℃保温10min,或者室温作用30min,细胞就破坏了。

1　包涵体形成的原因(1)表达量过高,研究发现在低表达时很少形成包涵体,

表达量越高越容易形成包涵体〔2〕。原因可能是合成速度太快,以至于没有足够的时间进行折叠,二硫键不能正确配对,过多蛋白间的非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶解度等。(2)重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,真核糖蛋白无法糖基化使中间体溶解度下降,导致不溶解包涵体形成〔3〕。(3)重组蛋白分泌序列的存在阻碍折叠,导致错误折叠分子的产生。(4)重组蛋白的氨基酸组成,一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。(5)包涵体形成动力学研究表明,包涵体是由部分变性的中间体聚合而成。因此,任何影响中间体稳定的因素,如pH值(pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体)离子强度和温度都可以引起蛋白聚合反应。(6)在细菌分泌的某个阶段,蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。(7)有报道认为,丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达,当培养条件不佳时,容易形成包涵体〔4〕。

2.2　洗涤包涵体

洗涤包涵体前先8000r/min,4℃离心15min,可使大多数包涵体沉淀,与可溶性蛋白分离。为了除去包涵体上粘附的杂质,如膜蛋白或核酸,利用洗涤液洗涤包涵体沉淀,常用去污剂Tritonx-100或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂(如2mol/L尿素或盐酸胍等)洗涤以除去脂类,但过高浓度的尿

7〕

素或盐酸胍会使包涵体溶解〔。

2.3　溶解包涵体

包涵体一般只溶于强的变性剂如尿素、盐酸胍,它是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展,SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等去垢剂,可以破坏蛋白内的疏水键,溶解一些包涵体蛋白8〕质〔。另外,对于含有半胱氨酸的蛋白质,分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT),常用浓度2～10mM。

另外,尿素和盐酸胍属中强度变性剂,易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用,所需浓度尿素6～8M,盐酸胍5～7M。一般来讲,盐酸胍溶解力强于尿素,它能使尿素不能溶解的包涵体溶解,但缺点是容易使SDS-PAGE电泳条带变形〔9〕。尿素的溶解度为70%～90%,其分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化,特别是在碱性pH值下长期保温时,但用尿素溶解具有不电离,呈中性,成本低,蛋白质复性后除去尿素不会造成大量蛋白质沉淀,以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点,故目前已被广泛采用。

2　包涵体的处理

包涵体的形成具有有利的一面,也有不利的一面。有利的一面是包涵体的形成去除了几乎全部的细胞内可溶性蛋白质。同时,因包涵体形成避免了蛋白水解酶对表达产物的降解而大大提高产率,通常其表达量可占菌体总蛋白的10%～30%,甚至高达50%。不利的一面是溶解包涵体进行复性折叠的过程中需要加变性剂和去垢剂,而引起蛋白质的不可逆修饰以及性质改变,这些试剂价格昂贵,且复性的操作过程不好控制;另一方面复性过程常伴有蛋白质水解和沉淀,有些还形成异构体〔5〕。因此复性是蛋白质工程中最关键、最复杂的问题。包涵体的处理一般有如下几个步聚。

2.4　复性包涵体蛋白

由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性,加上剧烈的处理条件,使蛋白的高级结构破坏,因此重组蛋白的复性特别必要。通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂使二硫键正常形成〔10〕。一般在尿素浓度4M左右时复性开始,到2M左右时结束。对于盐酸胍而言,从4M开始,到1.5M时复性过程结束〔11〕。

包涵体蛋白的复性是一个非常复杂的过程,除与控制蛋白质复性的过程相关外,还在很大程度上与蛋白质本身的性

2.1　破碎细菌细胞

提取包涵体时,首先要裂解细菌,为了防止在裂解细菌的过程中目的蛋白质变性,常常采取一些保护措施:合适的缓冲体系,如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液;加入保护剂,如还原剂DDT(2-巯基苏糖醇)、2-巯基乙醇;加

　　3为通讯作者。

《上海畜牧兽医通讯》　2009年第1期・63・

禽痛风发生的原因及其防治措施

黄德军　(淮安生物工程高等职业学校　江苏淮安　223200)

　　禽痛风是由于蛋白质尤其核蛋白代谢障碍,产生大量尿

酸;或日粮中钙含量过高、维生素A缺乏以及其他因素损伤禽肾脏,尿酸及其尿酸盐排泄障碍,大量尿酸及其尿酸盐在家禽内脏器官、关节等处蓄积,导致家禽生产性能降低和家禽死亡,给养禽场(户)造成巨大的经济损失。

1.2　维生素A缺乏

维生素A缺乏时可使肾小管、集合管和输尿管发生角化与鳞状上皮化,粘液分泌减少,尿酸盐排出受阻形成栓塞物—尿酸盐结石,阻塞管腔,尿酸排泄障碍,血液尿酸可增加8～9倍,尿酸盐在体内发生蓄积〔1〕。

1　原因

引起家禽痛风的病因比较复杂,根据文献报道结合养禽生产的实际情况,我们认为禽痛风的发生主要与以下因素有关:

1.3　高钙日粮及钙磷比例失调

据候宗良报道雏鸡日粮钙的含量为2.96%(雏鸡正常需要量为0.8%～1.0%),钙磷比例为7.4∶1(正常比例2∶1),

〔5〕

雏鸡发生痛风;杨守湖等报道蛋鸡日粮的钙为4.41%引起蛋鸡痛风(蛋鸡产蛋率为70%)〔6〕;蒋龙飞等报道雏鹅日粮中钙的含量达3.1%(雏鹅正常需要量为0.8%～1.00%),同时钙磷比例失调达7.8∶1.0(正常比例1.0∶0.7),雏鹅发

〔7〕

生痛风。当饲喂高钙饲料时,家禽发生高钙血症,钙盐会在肾脏沉积并逐渐钙化,当肾小管上皮细胞脱落到肾小管腔内,逐渐聚合,形成肾结石;同时,由于肾单位不断遭到破坏,致使有机能活动的肾单位逐渐减少,不足以代偿全部肾脏功能,导致禽痛风的发生。

1.1　高蛋白饲料

高蛋白饲料尤其是核蛋白含量过高,如用动物的内脏(如胸腺、脾脏、肝脏、肾脏、胰腺等)、肉屑、肉骨粉、鱼粉、大豆粉、豌豆、莴苣、开花的白菜等长期多量饲喂都可导致痛〔1,2〕风。有试验结果表明,肉鸡日粮中蛋白质水平高出饲养标准20%时,鸡痛风症的发生率增加28%〔3〕。2005年,我们遇到一蛋鸡养殖户在标注日粮的基础上添加3%蚕蛹,一周后鸡群发生典型内脏型痛风。但是,有人在提高20%日粮蛋白质水平的同时在饲料中添加一定量的爱西特、别嘌呤醇、〔4〕苯溴马隆等药物可明显缓解痛风的发生。家禽的肝脏缺乏尿素合成酶—精氨酸酶,而不能将氨转变成尿素,只能转为尿酸,同时禽肾脏中也无谷氨酰合成酶,而不能使氨由谷胺酰携带,因而其蛋白质代谢产物氨只能通过嘌呤核苷酸合成与分解途径,以生成尿酸的形式而排泄。核蛋白在体内可分解成核酸和蛋白质,核酸进一步分解形成单核苷酸—腺嘌呤核苷—次黄嘌呤核苷—次黄嘌呤—嘌呤,最后以尿酸的形式排出体外。

1.4　中毒性因素

1.4.1　滥用药物:在兽医临床上长期或大剂量使用磺胺类药物、喹乙醇、氨基糖类抗生素及碳酸氢钠等药物,这类药物具有肾毒作用,损伤肾脏,尿酸排泄障碍,导致禽痛风的发生。1.4.2　毒素中毒:如赭色曲霉毒素、黄曲霉毒素、桔青霉毒素和卵孢毒素等毒素可直接损伤肾脏,引起肾机能障碍导致痛风症的发生。1.4.3　某些重金属:如铬、镉、铊、铅等在肾脏中蓄积,引起肾脏机能和结构的损伤。

质有关,有些蛋白非常容易复性,在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上,而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法,很多蛋白的复性效率只有百分之几,一般

12〕

说来,蛋白质的复性效率在20%左右〔。

复性中常采用的方法有以下几种:(1)稀释复性法,直接加入水或缓冲液,放置过夜,缺点是体积增加较大,变性剂稀释速度太快,不易控制〔13〕。(2)透析复性法,好处是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度,有人称易形成沉淀,且不适合大规模操作,无法应用到生产规模〔14〕。(3)超滤复性,在生产中较多使用,规模较大,易于对透析速度进行控制,缺点是不适合样品量较少的情况,且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆地变性。(4)柱上复性,是最近研究较多并成功地在生产中应用的一种复性方法,常用于复性的层析方法有疏水层析(HIC)法、亲和层析(AFC)法〔15〕等。

3　展望

关于包涵体形成的具体因素一直是困扰学者的一个很重要的问题,尤其是包涵体的复性问题,不同的蛋白,不同的方法,没有一个具体统一的方法可以参考,已经成为生物制药的瓶颈,但相信随着生物技术的不断发展,新型设备的不断研制,对包涵体的形成原因、处理方法及蛋白重折叠机制等方面一定会取得更进一步的进展!

参考文献

〔1〕萨姆布鲁克DW.,拉萨尔.分子克隆实验指南第三版下册〔M〕.

科学出版社,2002,1215～1265〔2〕JohnWiley,Sons.Inc.PreparationandExtractionofInsoluble(In2

clusionBody)ProteinsfromEscherichiacoli〔J〕.CurrentProtocolsin

ProteinScience,2004,16(4):131～143〔3〕WilliamSelleck,SongTan.RecombinantProteinComplexExpression

inE.coli〔J〕.CurrentProtocolsinProteinScience,2008,21(5):324～321〔4〕PeiChingWu,etal.Expressionoftheporcinecircovirustype2cap2

sidproteinsubunitsandapplicationtoanindirectELISA〔J〕.JournalofBiotechnology,2008,133(23):58～64〔5〕纪剑飞,张成刚.包涵体重组蛋白的纯化及复性〔J〕.沈阳药科大

学学报,1998,23(4):303～307〔6〕JohnWiley,Sons,Inc.FoldingandPurificationofInsoluble(Inclu2

sionBody)ProteinsfromEscherichiacoli〔J〕.CurrentProtocolsinProteinScience,2000,36(5)217～317〔7〕SmithVR..Purificationandfoldingofrecombinantbovineoxoglu2

tarate/malatecarrierbyimmobilizedmetalionaffinitychromato2graphy〔J〕.ProteinScience,2003,29(2):209～216〔8〕王海林,高向阳.包涵体纯化技术〔J〕.生物技术通报,2007,14

(1):78～81〔9〕宁云山,李妍,王小宁.包涵体蛋白质的复性研究进展〔J〕.生物技

术通讯,2001,12(3):237～240〔10〕张少恩,孙晗笑,张光,等.大肠杆菌表达的vMIP-Ⅱ包涵体的

纯化与复性研究〔J〕.中国生物制品学杂志,2005,18(3):247～251〔11〕于文国,陶秀娥.包涵体蛋白复性及其影响因素〔J〕.生物技术通

报,2007,12(5):314～317〔12〕MingLi.,etal.Invitroproteinrefoldingbychromatographicproce2

dures〔J〕.ProteinExpressionandPurification,2004,(33)12:1～10〔13〕罗惠霞,李敏,王玉炯.包涵体蛋白复性的几种方法〔J〕.生物技

术通报,2007,25(5):96～99〔14〕麻晓庆,等.基因重组蛋白243诱导表达包涵体的变性、复性与

()纯化〔J〕.吉林医药学院学报,2007,281:1～3

〔15〕蓝贤勇,等.人类HBxAg蛋白反式激活基因5的原核表达及其

蛋白纯化〔J〕.西北农林科技大学报,2007,35(9):15～18