２０１７年７月 第３８卷第１３期 ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－６５２１．２０１７．１３．０１０ 食品研究与并发 Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ ＤｅｖｅｉｏＤｍｅｎｔ 分离提取 猪皮中胶原蛋白的提取与结构鉴定 纪倩，宿丹丹，应慧妍，陈敬华 （江南大学药剂学与药剂材料学研究室，江苏无锡２１４１２２） 摘要：以猪皮为原料，使用酶法提取胶原蛋白，对提取条件和过程进行筛选和优化，并对胶原产物的结构性质进行 表征。结果表明，胶原蛋白产物的提取率为６５－３３％；纯度为８７．３８％；热变性温度在ｌ１８．７９℃；紫外最大吸收波长为 ２０３ ｎｍ；相对分子质量为３．６３ｘ１０ ｇ／ｏｔｏｌ；红外光谱和圆二色谱结果显示，产物具有典型的胶原蛋白吸收峰，说明提取 出的胶原蛋白三螺旋结构保存完整；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｓｏｄｉｕＩｌｌ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅｐ０ｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）结果显示所得胶原产物主要由３种亚基组分组成。 关键词：猪皮；胶原蛋白；提取；纯化；结构鉴定 Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｉｇｓｋｉｎ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＪＩ Ｑｉａｎ，ＳＵ Ｄａｎ—ｄａｎ，ＹＩＮＧ Ｈｕｉ－ｙａｎ，ＣＨＥＮ Ｊｉｎｇ－ｈｕａ （Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２， Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｕｓｅｄ ｐｉｇｓｋｉｎ ａｓ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ，ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｅｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ６５．３３％ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｗａｓ ８７．３８％．Ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ １ １８．７９ ．Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ＵＶ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ２０３ ｎｍ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｗａｓ ３．６３ ｘ ｌＯ ｇ／ｍｏ１．Ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ ｒｏｕｎｄ ｔｗｏ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｈａｄ ａ ｔｙｐｉｃａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｅａｋ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｈｅｌｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗａｓ ｉｎｔａｃｔ；ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｍａｉｎｌｙ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓｕｂ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｉｇｓｋｉｎ；ｃｏｌｌａｇｅｎ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｉｃａｔｉｆｏｎ；ｓｔｕｃｔｕｒａｌｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ 胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，主要分布于 的条件，并对猪皮提取物的分子量、提取率、纯度、热稳 定温度、三股螺旋结构完整性、亚基组成进行测定，旨 哺乳动物的结缔组织中。三条 链缠绕成的螺旋结 构是胶原蛋白的最普遍结构特征，其独特的三重螺旋 结构使其分子结构非常稳定，而且免疫原性低，生物 相容性良好。胶原蛋白在猪皮蛋白质中的含量可达 ８７．８％【】１，但我国的猪皮多应用于皮革生产，因此，提取 猪皮中的胶原蛋白可以提高猪皮的利用价值。 在提高胶原蛋白品质，为猪皮中胶原蛋白的提取及结 构表征提供试验参考。 １试验材料、仪器 １．１材料与试剂 本文使用酶法提取猪皮中的胶原蛋白，通过筛选 脱脂条件，盐析方法与纯化方法，确定胶原蛋白提取 基金项目：江苏省产学研联合创新资金项目（ＢＹ２０１４０２３—１７） 作者简介：纪倩（１９８９一），女（汉），实验师，硕士，主要从事药剂学及 生物医用材料研究。 猪皮：无锡市周新农贸市场；过硫酸铵（ＡＰＳ）、四 甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、考马斯亮蓝、质量分数为３０％ 丙烯酰胺（丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺质量比为２９： １）、Ｔｒｉｓ、溴酚蓝（ＢＰＢ）：上海碧云天生物技术有限公 司；标准蛋白（分子量１０ ｋＤａ～２００ ｋＤａ）：美国Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｉｆｃ公司；胃蛋白酶（３ ０００ Ｕ／ｍｇ）：上海拓呖生物 通信作者：陈敬华（１９７１一），男（汉），教授，博士生导师，主要从事 药剂学与药物材料研究。 科技有限公司；羟脯氨酸：Ｂｉｏｓｈａｒｐ公司；氯化钠、冰醋 分离提取 纪倩，等：猪皮中胶原蛋白的提取与结构鉴定 酸、氢氧化钠、碳酸钠、乙醚、石油醚、甘氨酸 （Ｇｌｙｃｉｎｅ）、一水合柠檬酸、醋酸钠、正丙醇、氯胺Ｔ、对 二甲氨基苯甲醛、异丙醇、高氯酸、盐酸、二水合氯化亚 锡、甲醇、叠氮化钠、十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）：国药集团 化学试剂有限公司。 １．２仪器设备 ５８０４Ｒ离心机：艾本德中国有限公司；Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ Ｘ３Ｒ离心机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；ＢＳＡ １２４Ｓ分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司； ＡＬｌ０４电子天平、ＦＥ３０／ＥＬ３０实验室电导率仪：梅特 勒一托利多仪器（上海）有限公司；ＢＬ一２２００Ｈ电子天平、 ＵＶ一２５５０分光光度计：日本岛津公司；ＧＺＸ一９１４０ＭＢＥ 数显鼓风干燥箱：上海实业有限公司医疗设备厂； ＭＳ—Ｈ２８０一Ｐｒｏ恒温磁力搅拌器：美国赛洛捷克公司； Ｇｅｌ Ｄｏｅ ＸＲ伯乐凝胶成像仪：美国伯乐ＢＩＯ—ＲＡＤ公 司；ＦｒｅｅＺＯＮＥ冷冻干燥机：美国Ｌａｂｃｏｎｃｏ公司；ＪＹＬ— Ｃ０３Ｖ九阳切菜料理机：九阳股份有限公司。 ２试验方法 ２．１猪皮中胶原蛋白的提取 猪皮块一去脂一漂洗至中性一酸溶液中酶解一 盐析一纯化一冷冻干燥一胶原蛋白产物 ２．１．１前处理 将新鲜猪皮去毛，刮除表皮脂肪，水漂洗３次，将 猪皮切成５ ｍｍｘ５ ｍｍ方形小块，用料理机搅碎猪皮 ２０ ｇ，按照１：１０（ｇ／ｍＬ）的比例加人脱脂溶液，于磁力 搅拌器上搅拌脱脂数小时。脱脂结束后，除去碱溶液， 用清水洗涤猪皮至中性。 ２．１．２酶解 按照１：１０（ｇ／ｍＬ）的比例配制ｐＨ为２．５的醋酸溶 液，将脱脂的猪皮浸泡于酸溶液中，再按照酶：猪皮１： ５０（质量比）的比例加入胃蛋白酶（３ ０００ Ｕ／ａｒｇ），于４℃ 酶解２４ ｈ，每隔３ ｈ搅拌５ ｍｉｎ，酶解过程中用醋酸精 密调节ｐＨ在２。 ２．１．３盐析 对酶解液抽滤，取滤液。配制２．５ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ 溶液，逐滴加入滤液中，使滤液ｐＨ值升至７ ８，记 录滤液总体积。再加入一定量的ＮａＣ１，使ＮａＣ１的终 浓度为４ｍｏｌ／Ｌ，置于４℃盐析１ ｈ，盐析结束后于４℃， ８ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ。收集离心沉淀，即为胶原粗 产物。 ２．１．４纯化 配制ｐＨ ２．５的醋酸溶液，将上步得到的胶原蛋白 粗产物溶于少量醋酸溶液，６０００ｒ／ａｒｉｎ，４℃、离心１０ｍｉｎ， 取上清液，装入分子截留量为８ ０００ ｋＤａ～１４ ０００ ｋＤａ的 ４５＝＝＝－ 透析袋中，于ｐＨ ３．０的醋酸溶液中透析两天，去离子 水透析一天，冻干后即得纯化的胶原蛋白样品。 ２．２猪皮中胶原蛋白含量及胶原蛋白提取率测定 羟脯氨酸存在于胶原蛋白、伸展蛋白和弹性蛋白 中，其他蛋白质中不含有羟脯氨酸，其占胶原蛋白总 质量的１０％圆，因此可通过测定样品中羟脯氨酸的相 对含量来确定所提取的胶原蛋白的纯度。 ２．２．１羟脯氨酸标准曲线的测定 称取２．５ ｍｇ羟脯氨酸，溶于５００ ｍＬ去离子水中。 使用去离子水分别将羟脯氨酸浓度稀释为０．０．５、１．０、 １．５、２．０、２．５、５．０ ｔｚｇ／ｍＬ。参照张燕婉『３１的试验方法，分别 取４ ｍＬ上述溶液于２０ ｍＬ具塞试管中，先加入２ ｍＬ、 １４．１ ｍｇ／ｍＬ的氯胺Ｔ溶液，摇匀并静置２０ ｍｉｎ，使含有 吡咯环的氧化物生成，再加人２ ｍＬ对二甲氨基苯甲醛 溶液，与羟脯氨酸氧化物反应生成红色化合物，用紫 外分光光度计于５６１ ｎｍ波长处测定吸光度，绘制羟脯 氨酸标准曲线。 ２．２．２猪皮中胶原蛋白含量的测定 称取约４ ｇ猪皮，与０．５ ｇ二水合氯化亚锡同时溶 于１００ ｍＬ、６ ｍｏｌ／Ｌ的盐酸溶液中，１００℃冷凝回流 ２０ ｈ。提取液过０．４５ ｍ的水膜后，定容至２５０ｍＬ容 量瓶中，取２０ ｍＬ精密调节ｐＨ值至８，离心取上清液， 定容至２５０ ｍＬ，稀释１０倍后按照２．２．１的显色方法处 理猪皮提取液，测定羟脯氨酸的质量分数，并以１０．０ 的换算系数，按照下式计算胶原蛋白的含量： 羟脯胺酸／％＝ 胶原蛋白／％： 照壁 ×１００ ＩＩ＇１Ｕ￣Ｎ ．Ｕ 式中：ｃ为待测样的浓度，ｔ￣ｇ／ｍＬ；Ｍ为猪皮干重， ｇ； 为调节ｐＨ值前的体积，ｍＬ。 ２．２－３提取物中胶原蛋白含量的测定 称取５ ｍｇ的胶原蛋白样品，与０．５ ｇ二水合氯化 亚锡同时溶于１００ ｍＬ、６ ｍｏｌ／Ｌ的盐酸溶液中，１００℃ 冷凝回流２０ ｈ。提取液过０．４５ ｍ的水膜后，定容至 ２５０ ｍＬ容量瓶中，取６０ ｍＬ精密调节ｐＨ值至８左右， 离心取上清液，定容至１００ ｍＬ，稀释１０倍后按照２．２．１ 的显色方法处理样品提取液，按照下式计算胶原蛋白 的含量： 羟脯胺酸／％＝ 胶原蛋白／％：塑 ×１００ ｌＵ．Ｕ 式中：ｃ为待测样的浓度，ｔ￣ｇ／ｍＬ；Ｍ为胶原蛋白样 品重量，ｍｇ；Ｖ为调节ｐＨ前的体积，ｍＬ。 ・＝＝＝４６ 纪倩，等：猪皮中胶原蛋白的提取与结构鉴定 分离提取 ２．２．４提取率的计算 根据下式计算胶原蛋白的提取率： 提取莉％ 猪皮提取率× ｘｌＯ０ ２．３胶原蛋白的结构表征 ２．３．１凝胶渗透色谱分析 凝胶渗透色谱（Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ＧＰＣ）是根据聚合物分子渗透进入和洗脱流出色谱柱 中多孑Ｌ材料的不同程度来分离的一种液相色谱。以 ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ ５．４的醋酸钠作为流动相和溶剂，使胶 原蛋白浓度处于千分之一至千分之五之间。使用ＧＰＣ 专用砂芯漏斗过滤醋酸钠溶液。接柱后设置流速为 ０．１ ｍＬ／ｍｉｎ，扫描样品并计算样品中胶原蛋白的相对分 子质量。 ２．３．２差示量热扫描分析 称取３ ｍｇ一５ ｍｇ样品，放置于４０ Ｌ专用坩埚内， 压盖，空白坩埚作为参比池。设置ＤＳＣ分析仪升温速 率为１０￣Ｃ／ｍｉｎ，温度扫描范围为２０℃～２００ ｏＣ，记录吸 冰、 鬻 热曲线。 ∞ ∞ ∞ ∞ 加 ０ ０ ２．３－３紫外光谱分析 以０．５ ｍｏｌ／Ｌ的醋酸溶液溶解胶原蛋白样品，醋酸 溶液作为空白对照，扫描波长设置为１９０ ｎｍ～３００ ｌｑｍ。 ２．３－４红外光谱分析 由于胶原蛋白不易与溴化钾共同研磨成细粉状， 因此取少量胶原蛋白样品，使用全反射法对样品进行 检测。在２５℃，４５０ ｃｍ－ｌ￣４ ０００ ｃｍ 的范围进行扫描。 ２．３．５圆二色谱分析 以０．５ ｍｏｌ／Ｌ的醋酸溶液为溶剂，配制浓度为 ０．１ ｍｇ／ｍＬ的胶原蛋白样品溶液１０ ｍＬ，充分溶解，平衡 １２ｈ，离心取上清液１４］。设置波长范围１９０ｎｍ～２４０ｎｍ，比 色皿光程１ ｍｍ，扫描速度０．５ ｎｍ／ｓ；检测环境２５℃，氮 气。以０．５ ｍｏｌ／Ｌ的醋酸溶液作为空白对照。 ２．３．６ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶电泳 溶解胶原蛋白样品，与上样缓冲液混合，于沸水 中水浴５ ａｒｉｎ，冷却。配制８％的分离胶，５％的浓缩胶。 将胶板放人电泳仪，上样量２０ Ｌ。设置电压８０ ｖ，观 察样品跑至分离胶上边缘，再调节电压到１２０ Ｖ。电泳 结束后，考马斯亮蓝染色，洗脱液洗净后进行电泳图 谱拍摄及分析。 ３试验结果分析 ３．１脱脂处理对胶原蛋白提取的影响 ３．１．１脱脂溶剂的选择 猪皮前处理，经过预试验，分别选用浓度为 ０．１ ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠溶液［５１、８％（ｇ／ｍＬ）的碳酸钠溶液同、 乙醚与石油醚（体积比１：１）用混合液脱脂４ ｈ，猪皮重 量：溶剂体积为１：１０（ｇ／ｍＬ），未经脱脂的猪皮作为空 白对照，烘干称重，用索氏提取法提取脂肪，分析不同 脱脂溶剂的去脂效果。０．１ ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠溶液浸泡 ４ ｈ，猪皮上的脂肪多半从真皮上脱落，并漂浮在溶液 中，少部分脂肪通过外力也易被刮除，溶剂对脱脂效 果的影响见图１。 图１溶剂对脱脂效果的影响 Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｇｒｅａｓｉｎｇ ｓｏｌｖｅｎｔｓ 如图１所示，０．１ ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠溶液的脱脂效 ∞ 舳 ∞ ∞ 加 ０ 果最好，因此选用氢氧化钠溶液对猪皮进行脱脂。 ３．１．２脱脂时间的选择 选取脱脂效果最好的０．１ ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠溶液 作时间的单因素试验，浸泡时间分别为：２、４、６、８ ｈ，烘 干称重，用索氏提取法提取脂肪，分析时间对脱脂效 果的影响。时间对脱脂效果的影响见图２。 磐 蛮 ２ ４ ６ ８ 脱脂时间／ｈ 图２时Ｉ司对脱脂效果的影响 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｄｅｇｒｅａｓｉｎｇ ｔｉｍｅ 如图２所示，随着脱脂时间的增长，脱脂效果也随 之增加，但脱脂时间超过６ ｈ后，脱脂率没有明显的提 高，而脱脂时间过长，会增加猪皮变性的程度。因此， 采用脱脂时间为６ ｈ，每间隔２ ｈ搅拌５ ａｒｉｎ。 ３．２盐析方式对盐析效果的影响 盐析步骤中氯化钠的加入方式对盐析效果有明 显影响，通过两种方式：一种是逐渐加入氯化钠固体 达到盐析浓度，另一种是使用所需盐浓度的氯化钠溶 液。试验结果表明，直接加入氯化钠固体会导致盐的 囝ｆ圈 纪倩，等：猪皮中胶原蛋白的提取与结构鉴定 ４７＝＝＝一 局部浓度过大，从而使得胶原蛋白局部大量析 ，影 响胶原蛋白品质（图３ｂ）；可以通过透析的方法避免这 种现象，但是透析所需要的盐质量和透析体积非常 大，而且必须考虑氯化钠的溶解度问题，所以此方法 乏 出 可行性不高；采用滴管逐滴加入溶解完全的氯化钠溶 液 ｉ，既能避免局部浓度过大的问题，也能控制溶液体 积，冻干后得到的胶原蛋白疏松均匀，外观良好（图 ３ａ）。因此，氯化钠的加入方式对胶原蛋白的提取有重 要影响 ０ ２０ ４０ 时Ｉ￣ｌ／ｍｉｎ 图４胶原蛋白的ＧＰＣ图谱 Ｆｉｇ．４ ＧＰＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ 时的温度Ｉ“ｌ。差示量热扫描（ＤＳＣ）不仅可以确定试样 的熔点，也能测定样品的纯度，样品用量少而且操作 简便。当物质含有杂质时，ＤＳＣ峰会变宽，熔点降低ｌｌ。Ｉ。 胶原蛋白的ＤＳＣ图谱见图５。 ａ为加入氯化钠溶液；ｂ为加入氯化钠阎体 Ｏ ０ ８ ０ Ｏ Ｏ Ｏ 图３冻干后的胶原蛋白形态 ６ ４ ２ ０ Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｆｔｅｒ ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｉｎｇ ＜ 蕞 ３．３胶原蛋白提取率的测定 ３．３．１羟脯氨酸标准曲线 在５６１ ｎｍ波长处测定羟脯氨酸标准溶液吸光度， 绘制标准曲线，得到公式ｙ＝０．１７５ ９ｘ＋０．０５９ ６ 为吸光 度， 为浓度 ｇ／ｍＬ，方差Ｒ。为０．９９９ ９，准确度高，可 用于计算样品中羟脯氨酸含量，再转换为胶原蛋白 含量。 图５胶原蟹臼的ＤＳＣ图谱 Ｆｉｇ．５ ＤＳＣ ｔｈｅｒｍｏｇｒａｍ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ 如图５所示，本试验中产物的热变性温度为 １ ｌ８．７９℃，比之前报道中的胶原蛋白热变性温度 ３．３．２猪皮中胶原蛋白的提取率 有报道指出蛋白质在猪皮中的含量约有３３％，其 中大部分为胶原蛋白，含量在８７．８％ｉ９１。本试验测出胶 原蛋白在猪皮中含量为４２．８０％，可能是由于选取了 （７７．２７℃）有所提高Ｉ ，说明胶原蛋白热稳定性良好，三 股螺旋结构保持较为完整。 ３。４．３紫外光谱分析结果 胶原蛋白的紫外图谱见图６。 ０．２５ 胶原含量较高的猪背脊皮肤作为原料的原因。提取的 胶原蛋白纯度达到８７．３８％，提取率为６５．３３％。 ３．４胶原蛋白结构鉴定 ３．４．１ ＧＰＣ ０．２０ 胶原蛋白的三股螺旋结构是由三条肽链组成的， 分子量约为３００ ｋＤｄ Ｏｌ。本试验中产物的分子量分布在 ｏ １５ ３００ ｋＤａ～４００ ｋＤａ之间，胶原蛋白的ＧＰＣ图谱见图４。 ０．１０ 如图４所示，符合胶原蛋白最普遍的结构特 征，通过计算得到胶原产物的相对分子质量为３．６３× １０ ｇ／ｍｏｌ。 ２２５ ２５０ ２７５ ３００ 波长／ｉｒｍ ３．４．２胶原蛋白的热稳定分析 通常胶原蛋白的热收缩温度（Ｔｓ）反映胶原蛋白的 热稳定性，指的是胶原纤维收缩到原来长度三分之一 图６胶原蛋白的紫外图谱 Ｆｉｇ．６ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ 如网６所示，胃蛋白酶法提取猪皮中胶原蛋白样 纪倩，等：猪皮中胶原蛋白的提取与结构鉴定 分离提取 ＝＝ ８ 品在２００ ｎｍ～３００ ｎｍ波长处的紫外吸收（Ａ），样品中 胶原蛋白的最大吸收峰在２０３ ｎｍ处，与文献报道胶原 特征。 ３．４．４红外光谱分析 蛋白最大紫外吸收在２２５ ＲＩＴＩ有差异圈，但也符合胶原 胶原蛋白的红外图谱见图７。 褂 图７胶原蛋白的红外图谱 Ｆｉｇ．７ Ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ 如图７所示，３ ２００ ｃｍ－ｌ￣３ ６００ ｃｍ 代表酰胺Ａ带 的Ｎ—Ｈ伸缩振动（氢键）峰㈣；２ ９２９ ｃｍ 代表酰胺Ｂ 图见图８。 带Ｎ—Ｈ和ｃ—Ｈ伸缩振动吸收峰，二者都表明肽键间 氢键的存在㈣；１ ６３０ ＣＩＴＩ 代表酰胺Ｉ带，是形成三股 螺旋内氢链的Ｃ＝Ｏ基团的伸缩振动强峰，表征胶原三 螺旋结构的存在；１ ５４９ ｃｍ 代表酰胺Ⅱ带的１ＪＮ—Ｈ弯 曲振动、１Ｊ Ｃ—Ｎ伸缩振动吸收峰；１ ４６３ ｃｍ 处的吸收 峰表征了肽键的顺式构型，说明胶原蛋白分子中含有 大量脯氨酸和羟脯氨酸。因为脯氨酸残基的肽单位之 １９０ ２００ ２１０ ２２０ ２３０ ２４０ ２５０ 吕 蛆］ １ １ 固 外，绝大多数多肽链中肽单位的Ｎ—Ｈ和Ｃ＝Ｏ都是反 式排列；１ ３３８ ｃｍ 代表酰胺Ⅳ带ｃ—Ｈ伸缩，Ｎ—Ｈ变形 波长／ｎｍ 或ＮＨ 摇摆峰；１ ２３８ ｃｍ 代表酰胺Ⅲ带的Ｎ—Ｈ变形 峰；１ ０８１ ｃｍ 是Ｃ—Ｏ或ｃ—Ｈ—Ｃ伸缩振动峰。其中， １ ４５０ ｃｍ－ｌ￣１ ２３０ ｃｍ 附近存在吸收峰，表明样品中胶 原蛋白的二三股螺旋结构保存完整［１５Ｊ。 ３．４．５圆二色谱 图８胶原蛋白的圆二色光谱图 Ｆｉｇ．８ Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ 如图８所示，１９３ ａｍ处存在一个负峰，２２０ ａｍ处 存在一个正峰，正负峰强度比值为０．１４２，说明胶原蛋 白三股螺旋结构保持得较好，符合胶原蛋白三股螺旋 在蛋白质中，氨基酸的 一碳原子是不对称碳原 子，具有光学活性，蛋白质的肽链走向也是不对称的 结构的典型特征圆二色谱峰型 。 ３．４．６胶原蛋白的亚基组成 结构，也具有光学活性，当平面圆偏振光通过这些光 活性的生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的 左右圆偏振光的吸收不相同，产生了吸收差值，由于 这种吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圆 偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质的圆二色 Ｉ型胶原蛋白有两条０ｌ 链，一条仅：链；Ⅲ型胶原 蛋白有三条Ｏｔ 链；仅 链是Ｉ型胶原蛋白的特征链，所 以 链的存在说明Ｉ型胶原蛋白的存在嗍。胶原蛋白 ＳＤＳ—ＰＡＧＥ图见图９。 如图９所示，明显的０【：链表明Ｉ型胶原蛋白的存 在；位于１２０ ｋＤａ附近的是Ｉ型胶原蛋白的 、Ｏｔ 链； 性。一般蛋白质的圆二色光谱分成两段，波长范围在 １８５ ｎｌＴｌ～２４５ ｎｍ称为远紫外区，２４５ ｎｍ～３２０ ｎｍ称为近 紫外区。远紫外区是蛋白质肽链的吸收峰，反映了主 链的构象。 位于２００ ｋＤａ附近的是０ｃ链的一种二聚体一Ｂ链；位于 ２００ ｋＤａ上方的是 链的三聚体一 链。１２０ ｋＤａ以下 并没有其他条带，说明胶原蛋白的结构保存较好，没 有被分解成多肽，也没有小分子水解胶原的生成 。 猪皮中提取的胶原蛋白在远紫外区的圆二色谱 分离提取 纪倩，等：猪皮中胶原蛋白的提取与结构鉴定 ４９＝＝＝一 ２００１，１８（５）：３０２—３０４ ［３】张燕婉．肉和肉制品中羟脯氨酸含量的测定ｆＪ１．食品科学，１９９０ （１１）：４９—５１ ２ｏ０ ｋＤａ １５０ｋＤａ １２０ ｋＤａ ５１ Ｏｔ２ ［４］于玮，王雪蒙，马良，等．猪皮胶原蛋白提取过程中酶解条件优化 及其结构鉴定［ＪＪ．２０１５，３７（￣：１０６—１ １３ 【５］张玲，芮汉明，张立彦．酶法提取猪皮胶原及产物性质分析［ＪＪ．食 品科学，２０１３，３４（１９）：１２３—１２７ ［６】胡二坤，郭兴凤，谭凤艳，等．猪皮中胶原蛋白的提取【Ｊ】．河南工业 大学学报，２００６，２７（１）：５０—５３ ｌｏｏ ｋＤａ ８５ ｋＤａ ７０ｋＤａ ６０ｋＤａ ５０ ｋＤａ 【７】雪洋．猪皮胶原蛋白提取及理化特性的研究［Ｄ】．重庆：西南大 学，２０１０ ［８】Ｍｉｌｌｅｒ Ｅ Ｊ，Ｇａｙ Ｓ．Ｃｏｌｌａｇｅｎ：Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １９８２，８２：３－７ 标记胶原蛋白 图９胶原蛋白ＳＤＳ—ＰＡＧＥ图 Ｆｉｇ．９ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ 【９］李开雄，赵志远，刘霞．猪皮中胶原蛋白的提取及其应用［Ｊ］＿肉类 研究，１９９６（４）：４３—４６，４８ ［１Ｏ］王丽娜，黄素珍．胶原蛋白的研究进展［Ｊ】．肉类研究，２０１０（１）：１６～ ４结论 ２２ 确定猪皮中胶原蛋白提取的工艺：按照１：１０（ｇ／ ｍＥ）的比例加入０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液浸泡除脂６ ｈ，酶 解２４ ｈ后，逐滴加入溶解完全的氯化钠溶液盐析，采 用醋酸溶液透析的方法纯化胶原蛋白粗品，去离子水 透析后冻干即得胶原蛋白样品。结构鉴定表明，本试 验提取的样品符合胶原蛋白的紫外、红外、圆二色谱 ［１ ｉ】杨霞，王珊珊，赵芙钗，等．驴皮中胶原蛋白的提取及其特性ｆＪ】．精 细化工，２０１ １，２８（９）：８８３—８８６ 【１２］孙凤霞．仪器分析（第二版）【Ｍ】．北京：化学工业出版社，２０１１：３０５ 【１３】Ｌｉ Ｄ Ｆ，Ｍｕ Ｃ Ｄ，Ｃａｉ Ｓ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆｃｏｌｌａｇｅｎ［Ｊ］．Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ ｓｏｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，１６（５）： ６０５－６０９ ［１４］Ｍｕｙｏｎｇａ Ｊ Ｈ，Ｃｏｌｅ Ｃ Ｇ Ｂ，Ｄｕｏｄｕ Ｋ Ｇ．Ｆｏｕｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ 吸收特征，三股螺旋结构保持完整；其由Ｏ／．，Ｂ和＾ｙ三 种亚基组分组成；热变性温度高达１１８．７９ ｏＣ，热稳定 性好；分子量在３００ ｋＤａ～４００ ｋＤａ之间；样品纯度高， 提取率好。因此，本研究提取的猪皮胶原蛋白具有高 质量高纯度，适用于生物医用材料。 参考文献： ［１ 蒋挺大，］张春萍．胶原与胶原蛋白［Ｍ】．北京：化学工业出版社，２００６： １７－１９ （ＦｒＩＲ）ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｔｕｄｙ ｆ ｏａｃｉｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ｇｅｌａｔｉｎ ｆｒｏｍ ｓｋｉｎｓ ａｎｄ ｂｏｎｅｓ ｏｆ ｙｏｕｎｇ ｎｄ ａｄｕｌａｔ Ｎｉｌｅ ｐｅｒｃｈ（Ｌａｔｅｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）ｆＪ］． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，８６（３）：３２５－３３２ 【ｌ５］荆煦瑛，陈式隶．红外光谱使用指南［Ｍ］．天津：天津科学技术出版 社，１９９２ ［１６］唐兰兰，陈书霖，郝更新，等．三种淡水鱼皮胶原蛋白膜机械性能 和ａ 链～级结构的相关性研究［Ｊ］．现代食品科技，２０１５，３ｌ（６）： ５９—６６．１６３ ［１７】刘苏锐，王坤余，琚海燕．猪皮Ｉ型胶原蛋白的提取及其结构表 征［Ｊ】．中国皮革，２００７，３６（７）：４３—４６，４９ 收稿日期：２０１７—０３—３１ ［２】金勇，徐社阳，刘宗惠，等．猪皮提取胶原的研究［Ｊ］．精细化工， 汲取中国智慧、弘扬中国精神、传播中国价值， 传承发展中华优秀传统文化。
