(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 108676923 A(43)申请公布日 2018.10.19
(21)申请号 201810805799.X(22)申请日 2018.07.20
(71)申请人 联宠科技（北京）有限公司
地址 100000 北京市海淀区温泉镇中央档
案馆西侧(原温泉镇农业服务中心办公楼)265号(72)发明人 安娜 张伟伟 刘潇然 蒋勤军 (74)专利代理机构 北京超凡志成知识产权代理
事务所(普通合伙) 11371
代理人 侯小锋(51)Int.Cl.
C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01)
权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图2页
(54)发明名称
一种检测猫白血病病毒的引物对、引物组、试剂盒及应用(57)摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉
引物组、试及一种检测猫白血病病毒的引物对、
剂盒及应用。所述引物对以外源性FeLV保守的3’LTR核苷酸序列为扩增区域设计而成，具有灵敏度高、特异性好、方便检测等优点。所述引物组包括上述引物对及检测猫内源性白血病病毒的对照引物对，所述引物组能快速、方便、高效地检测外源和内源FeLV，特异性好，灵敏度高。对临床检测和流行病学调查的开展具有指导意义，为宠物市场的安全发展提供一定的保障。
CN 108676923 ACN 108676923 A
权 利 要 求 书
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1.一种检测猫外源性白血病病毒的引物对，其特征在于，所述引物对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和2所示。
2.一种检测猫白血病病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括权利要求1所述的引物对和对照引物对；
所述对照引物对为检测猫内源性白血病病毒的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和4所示。
3.一种检测猫白血病病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的检测猫白血病病毒的试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度均为8～12μmol/L；
优选地，所述引物的浓度均为10μmol/L。
5.根据权利要求3所述的检测猫白血病病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为除去所述猫外源性白血病病毒和所述猫内源性白血病病毒之外的其他种类的猫病毒的DNA或cDNA；
优选地，所述阴性对照为猫艾滋病病毒、猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫瘟病毒或猫冠状病毒中的一种或多种DNA或cDNA。
6.根据权利要求3所述的检测猫白血病病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为含有猫外源性白血病病毒和猫内源性白血病病毒的核酸模板。
7.根据权利要求3所述的检测猫白血病病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs、DNA聚合酶、ddH2O、上样缓冲液和DNA分子量内标中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的检测猫白血病病毒的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段。
9.根据权利要求8所述的检测猫白血病病毒的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。
10.权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的引物组或权利要求3～9任一项所述的试剂盒，在制备猫白血病病毒检测试剂中的应用。
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说 明 书
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一种检测猫白血病病毒的引物对、引物组、试剂盒及应用
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种检测猫白血病病毒的引物对、引物组、试剂盒及应用。背景技术
[0002]猫白血病病毒(FeLV)是肿瘤病毒亚科的一种反转录病毒，能导致猫白血病，持续感染可引起严重的免疫抑制、严重非再生性贫血及肿瘤等。FeLV有FeLV-A、FelV-B、FeLV-C和FeLV-T四个亚型。A型几乎存在于所有FeLV感染猫中，可以导致严重的免疫抑制。B型存在于大约50％FeLV感染猫中，可以引起肿瘤。C型仅存在于约1％FeLV感染猫中，可导致严重的贫血。若感染机体后不发生免疫反应，病毒可能会导致持续的病毒血症(40％)成为病毒的携带者。病毒血症通常在FeLV感染2～4周后出现，大约50％患持续病毒血症的猫感染FeLV后在1年内死亡。
[0003]FeLV存在内源和外源之分，多以“前病毒”形式存在，猫内源性白血病病毒在临床上不致病，功能上很大程度上未知。猫内源性白血病病毒对分子生物学检测FeLV感染存在很大的干扰，很容易出现误诊。至今为止我国未曾有可区分外源和内源FeLV的方法或试剂盒。
[0004]有鉴于此，特提出本发明。发明内容
[0005]本发明的第一目的在于提供一种检测猫外源性白血病病毒(FeLV)的引物对，以外源性FeLV保守的3'LTR核苷酸序列为扩增区域，设计出所述引物对，具有灵敏度高、特异性好、方便检测等优点。
[0006]本发明的第二目的在于提供一种检测猫白血病病毒的引物组，所述引物组包括上述引物对及检测猫内源性白血病病毒的对照引物对，所述引物组能快速、方便、高效地检测外源和内源FeLV，特异性好，灵敏度高。
[0007]本发明的第三目的在于提供一种检测猫白血病病毒的试剂盒，其包括如上所述的引物对或引物组，具有包装良好、使用方便的优点。
[0008]本发明的第四目的在于提供如上所述的引物对或引物组或试剂盒在制备猫白血病病毒检测试剂中的应用。
[0009]为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：[0010]一种检测猫外源性白血病病毒的引物对，所述引物对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和2所示。[0011]与现有技术相比，本发明的有益效果为：[0012](1)本发明所述的引物对或引物组通过了对该引物的特异性、敏感性和重复性的试验，证实此引物能用于快速、方便、高效地检测猫白血病病毒，且特异性好，灵敏度高。[0013](2)本发明发现猫白血病病毒的内源和外源序列在LTR上的碱基序列不同，内源和
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说 明 书
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外源FeLV均含有编码糖蛋白的gp70基因序列。通过参考与比对GenBank中所有FeLV的LTR和gp70基因序列，分别选择外源性FeLV特异性的3'LTR核苷酸序列和内源性FeLV gp70的保守序列作为扩增区域，设计了两对检测猫外源性和内源性白血病病毒的PCR引物。可减少猫内源性白血病病毒对分子生物学检测FeLV感染存在的干扰，从而降低误诊率。[0014](3)对于临床检测和流行病学调查的开展具有指导意义，为宠物市场的安全发展提供一定的保障。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0016]图1为一个实施方式中的猫白血病病毒PCR电泳结果图，泳道从左到右分别为M:2000DNA Marker，1：猫内源和外源白血病病毒阳性样品，2：猫外源性白血病病毒阳性样品，3：猫内源性白血病病毒阳性样品，4：空白对照；
[0017]图2为一个实施方式中的猫白血病病毒特异性检测电泳结果图，泳道从左到右分别为M：2000DNA Marker；1：猫内源和外源白血病病毒阳性样品，2：猫艾滋病病毒，3：猫疱疹病毒，4：猫杯状病毒，5：猫瘟病毒，6：猫冠状病毒；
[0018]图3为一个实施方式中的猫白血病病毒敏感性检测电泳结果图，泳道从左到右分别为M：2000DNA Marker，1-7代表10-1至10-7的模板稀释度。具体实施方式
[0019]一种检测猫外源性白血病病毒的引物对，所述引物对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和2所示。
[0020]以外源性FeLV保守的3'LTR核苷酸序列为扩增区域，设计出所述引物对，具有灵敏度高、特异性好、方便检测等优点。
[0021]一种检测猫白血病病毒的引物组，所述引物组包括如上所述的引物对和对照引物对；所述对照引物对为检测猫内源性白血病病毒的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和4所示。
[0022]本发明发现猫白血病病毒的内源和外源序列在LTR上的碱基序列不同，内源和外源FeLV均含有编码糖蛋白的gp70基因序列。通过参考与比对GenBank中所有FeLV的LTR和gp70基因序列，分别选择外源性FeLV特异性的3'LTR核苷酸序列和内源性FeLV gp70的保守序列作为扩增区域，设计了两对检测猫外源性和内源性白血病病毒的PCR引物,通过对该引物的特异性、敏感性和重复性进行试验，证实此引物能用于快速、方便、高效地检测猫白血病病毒，且特异性好，灵敏度高。
[0023]一种检测猫白血病病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物对或引物组。[0024]在一些实施方式中，所述引物的浓度均为8～12μmol/L。[0025]优选地，所述引物的浓度均为10μmol/L。[0026]引物在PCR反应体系中的浓度也为8～12μmol/L，优选为10μmol/L。如在一些实施
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例中，所述浓度还可以为8.5μmol/L、9μmol/L、11μmol/L、11.5μmol/L等，结果在该范围内基本一致。
[0027]在一些实施方式中，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为除去所述猫外源性白血病病毒和所述猫内源性白血病病毒之外的其他种类的猫病毒的DNA或cDNA。[0028]在一些实施方式中，所述阴性对照为猫艾滋病病毒、猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫瘟病毒或猫冠状病毒中的一种或多种DNA或cDNA。[0029]优选地，在进行检测时，使用PCR鉴定，PCR产物在相应大小的位置有发亮条带为携带此基因，为降低假阳性和提高检测精确度，增加阴性对照，即待检测基因在相应大小的位置有发亮条带且阴性对照无条带判断为待测样品中含有此基因。[0030]在一些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为含有猫外源性白血病病毒和猫内源性白血病病毒的核酸模板。[0031]阳性对照理论上必然会出现发亮条带，若扩增不出条带，表明此次操作失败，应分析原因再次实验，如模板DNA质量不好、仪器问题等问题。阳性对照的设置可用来排除其他实验情况对结果产生的影响，进一步增加检测的准确度。[0032]在一些实施方式中，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs、DNA聚合酶、ddH2O、上样缓冲液和DNA分子量内标中的一种或多种。[0033]dNTPs即dATP,dCTP,dGTP和dTTP。[0034]在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段。[0035]在一些实施方式中，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。[0036]上述的引物对或引物组或试剂盒，在制备猫白血病病毒检测试剂中的应用。[0037]一种检测鉴定猫外源性和内源性白血病病毒的方法，包括：[0038]提取待测样品中的DNA，用如上所述的引物组或试剂盒对DNA样品进行PCR反应，将扩增产物电泳检测，根据电泳结果判断待测样品中是否含有猫外源性或内源性白血病病毒；若PCR产物在177bp处出现条带，则表明待测样品中含有猫外源性白血病病毒；当PCR产物在892bp处出现条带，则表明待测样品中含有猫内源性白血病病毒；若PCR产物在177bp处和892bp处均出现条带，则表明待测样品中同时含有猫外源性和内源性白血病病毒。[0039]优选地，如上所述的应用或方法，所述PCR的反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，DNA模板2μL，各引物的浓度均为8～12μmol/L，ddH2O加至25.0μL。[0040]优选地，所述PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸5min。[0041]优选地，所述电泳的检测条件为：取6μL PCR扩增产物，加入含Golden View的1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳，在130V电压下电泳25min后使用紫外成像仪进行观察。[0042]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。[0043]实施例
[0044]1猫白血病病毒(FeLV)PCR引物的设计
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1.1引物的设计
[0046]本发明发现猫白血病病毒的内源和外源序列在LTR上的碱基序列不同，内源和外源FeLV均含有编码糖蛋白的gp70基因序列。通过参考与比对GenBank中所有FeLV的LTR和gp70基因序列，分别选择外源性FeLV特异性的核苷酸序列和gp70的保守序列作为扩增区域，设计了两对检测猫外源性和内源性白血病病毒的PCR引物；[0047]一对检测外源性FeLV的PCR引物，所述PCR上下游引物FeLV-1F/R的序列依次如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：2所示：[0048]上游引物FeLV-1F:5’-GTTCGACCTTCCGCCTCAT-3’(SEQ ID NO：1)；[0049]下游引物FeLV-1R:5’-ACGAGTCAGATGCAATCAGCA-3’(SEQ ID NO：2)；[0050]一对检测内源性FeLV的PCR引物，所述PCR上下游引物FeLV-2F/R的序列依次如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：4所示：[0051]上游引物FeLV-2F:5’-TCAGGAACCATTCCCAGGGT-3’(SEQ ID NO：3)；[0052]下游引物FeLV-2R:5’-AGGAACAGTCCCTATGCACG-3’(SEQ ID NO：4)。[0053]1.2引物的验证[0054]进行PCR验证，以猫白血病病毒的DNA为模板进行扩增。[0055]2.PCR检测猫白血病病毒样本[0056]2.1样本DNA的提取[0057]用适用的商品化试剂盒对待测样品进行DNA提取。[0058]2.2PCR扩增
[0059]使用1中的引物进行PCR扩增。[0060]PCR扩增反应的总体积为25.0μL，其各种成分分别为：2×Taq Master Mix 12.5μL，DNA模板2μL，10μmol/L上游引物FeLV-1F 1μL，10μmol/L下游引物FeLV-1R 1μL，10μmol/L上游引物FeLV-2F 1μL，10μmol/L下游引物FeLV-2R 1μL；ddH2O加至25.0μL。[0061]2×Taq Master Mix所含成分浓度为：Taq DNA Polymerase(recobinant)：0.05units/μL；MgCl2:4mM；dNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP):0.4mM。[0062]PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。[0063]2.3扩增产物鉴定[0064]取6μLPCR扩增产物，加入含Golden View的1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为130V，25min。利用紫外成像仪观察PCR产物在177bp处有明显发亮条带，且阴性对照无条带，则显示为猫外源性白血病病毒呈阳性反应；在892bp处有明显发亮条带，且阴性对照无条带，则显示为猫内源性白血病病毒呈阳性反应。[0065]2.4基因测序
[0066]回收阳性条带后将样品送至基因测序公司进行产物基因测序，根据测序反馈结果与NCBI上的序列进行BLAST分析比对，确定样品中含猫白血病病毒。[0067]实验例1
[0068]猫白血病病毒PCR引物的验证。[0069]参考实施例中的步骤进行实验，其中1号为既含有猫外源性又含有内源性白血病病毒的样本，2号为仅含有猫外源性白血病病毒的样本，3号为仅含有猫内源性白血病病毒
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的样本，4号为空白对照。[0070]结果如图1所示。1号样本PCR产物在177bp和892bp处有明显发亮条带，且阴性对照(4号)无条带，表明1号样本含有猫外源性和内源性白血病病毒；2号样本PCR产物在177bp处有明显发亮条带，且阴性对照无条带，表明2号样本仅含有猫外源性白血病病毒不含有猫内源性白血病病毒；3号样本PCR产物在892bp处有明显发亮条带，且阴性对照无条带，表明3号样本仅含有猫内源性白血病病毒不含有猫外源性白血病病毒。以上结果表明，本发明设计的引物可准确检测猫外源性和/或内源性白血病病毒，且电泳结果显示清晰。[0071]实验例2
[0072]猫白血病病毒PCR引物的特异性验证。[0073]参考实施例中的步骤进行实验，以猫白血病病毒、猫艾滋病病毒、猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫瘟病毒和猫冠状病毒的基因组DNA或cDNA为模板，用本申请所述引物进行PCR检测。
[0074]结果如图2所示，只有1号猫内源和外源白血病病毒阳性样品在177bp和892bp有明亮清晰条带，其他组样品均无条带。结果表明本发明设计的猫白血病病毒PCR引物具有高度的特异性，只有猫内源和外源性白血病病毒呈阳性反应，而猫艾滋病病毒、猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫瘟病毒和猫冠状病毒均呈阴性反应。[0075]实验例3
[0076]猫白血病病毒PCR引物的灵敏度验证。[0077]参考实施例中的步骤进行实验，提取猫白血病病毒DNA后，用ddH2O将样品DNA模板按照10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7进行倍比稀释，并进行PCR检测。[0078]电泳结果如图3所示，结果表明PCR引物在10-3的模板稀释度上仍然呈阳性反应，其敏感性较高。同时，本发明引物最低检测模板浓度为10.78ng/μL。[0079]实验例4
[0080]猫白血病病毒PCR引物的应用。
[0081]收集来自北京8个动物医院共30份疑似病猫样品，参考实施例的方法进行猫白血病病毒PCR检测。
[0082]试验结果表明，30份样品中有1份外源和内源FeLV均呈阳性反应，28份样品仅内源性FeLV呈阳性反应，说明北京地区大部分猫均携带内源性猫白血病病毒，感染外源性猫白血病病毒的猫较少。
[0083]本发明所述的引物对或引物组通过了对该引物的特异性、敏感性和重复性的试验，证实此引物能用于快速、方便、高效地检测猫白血病病毒，且特异性好，灵敏度高。[0084]最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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SEQUENCE LISTING<110> 联宠科技（北京）有限公司<120> 一种检测猫白血病病毒的引物对、引物组、试剂盒及应用<130> 20180710<160> 4<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 19<212> DNA<213> 人工合成<400> 1gttcgacctt ccgcctcat 19<210> 2<211> 21<212> DNA<213> 人工合成<400> 2acgagtcaga tgcaatcagc a 21<210> 3<211> 20<212> DNA<213> 人工合成<400> 3tcaggaacca ttcccagggt 20<210> 4<211> 20<212> DNA<213> 人工合成<400> 4aggaacagtc cctatgcacg 20
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