刺参酸性黏多糖对HepA荷瘤小鼠的增效作用及其机制研究

刺参酸性黏多糖对HepA荷瘤小鼠的增效作用及其机制研究

赵秀梅,冯文茹,高󰀁巍,胡人杰

*

(天津市医药科学研究所,天津󰀁300020)

摘要:目的探讨刺参酸性黏多糖(SJAMP)对化疗药物(CTX、DDP、5-Fu)的增效作用,并初步对其作用机制进行研究。

方法通过建立小鼠HepA实体瘤模型,观察SJAMP与化疗药合用对肿瘤生长的影响。采用高效液相色谱(HPLC)法,观察单用氟尿嘧啶及与SJAMP合用在肿瘤组织中的药物浓度变化。结果在相同的剂量下,化疗药物与SJAMP合用组和单独使用化疗药组相比,小鼠肿瘤的体积明显减小,低剂量合用组已经接近或超过单独使用化疗药的中剂量组的抑瘤率,而且中剂量合用组的抑瘤率与高剂量组的抑瘤率相比也非常接近。HPLC测定结果显示,与SJAMP合用肿瘤组织内5-Fu的含量低于单独给予氟尿嘧啶。结论SJAMP具有广谱增效作用。

关键词:刺参酸性黏多糖;󰀁肿瘤;󰀁增效;󰀁高效液相色谱法DOI标识:do:i10.3969/.jissn.1008󰀁0805.2010.12.012中图分类号:R285.5󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁文章编号:1008󰀁0805(2010)12󰀁3062󰀁02

SynergisticEffectofAcidMucopolysaccharideinStichopusjaponicusSelenkaonHepAinmiceanditsmechanism

iu󰀁me,iFENGWen󰀁ru,GAOWe,iHURen󰀁jie

(TianjinInstituteofMedicalandPharmacologicalScience,Tianjin300020,china)Abstract:ObjectiveToinvestigatethesynergisticeffectofacidmucopolysaccharideinStichopusjaponicusSelenka(SJAMP)in

ZHAOX

combinationwithchemotherapeutics(CTX,DDP,5-Fu)anditsmechanism.MethodsTheHepAmousetumormodelwases󰀁tablishedtoobservethetumorgrowthwhenSJAMPwasusedincombinationwithchemotherapeutics;theconcentrationof5-FuinsituationaloneorwithSJAMPinthetumorwasmeasuredbyHPLC.ResultsThetumorvolumesinmicecoadministeredwithSJAMPandchemotherapeuticswereobviouslysmallerthanthosewithchemotherapeuticsaloneunderthesameconcentration;theinhibitionrateoftumorgrowth(IR)inlowdosecomedicationgroupwassimilarto,evengreaterthanthatinmediumdoseantican󰀁ceragentsgroup,andtheIRinmediumdosecomedicationgroupwasquitesimilartothatinhighdoseanticanceragentsgroup.Theconcentrationof5-Fuinthetumorissueofcomedicationgroupwaslowerthanthatin5-Fuadministeredalonegroup,measuredbyHPLC.ConclusionSJAMPhasbroad-spectrumsynergisticeffectonchemotherapeutics.

AMP;󰀁Tumor;󰀁Synergisticeffect;󰀁HPLCKeywords:SJ󰀁󰀁刺参属棘皮动物海参纲刺参科,其学名为Stichopusjaponicus

Selenka,自古以来作为佐膳珍品。󰀂本草纲目拾遗 中载!刺参,辽海有之,其性温补,足敌人参∀。称其!补肾经、益精髓、消痰

[1]

涎、摄小便,生血、壮阳,治疗溃疡生疽∀。其所含的刺参酸性黏多糖(SJAMP)具有抗凝、抗肿瘤、抗转移、抗肿瘤血管生成、调

[2]

节免疫等生物活性。我们在前期的实验研究中发现SJAMP对环磷酰胺抗动物移植性肿瘤具有增效作用。本项研究的目的是在确证SJAMP对环磷酰胺增效作用的基础上,进一步观察对其他抗肿瘤化疗药物有无增效作用,并初步对其作用机制进行探讨,以期为SJAMP的进一步应用研究提供实验依据。1󰀁材料与仪器

1.1󰀁动物和瘤株昆明种小鼠,SPF级,雌雄各半,体质量18~22g,购自北京大学医学部实验科学部。许可证号:SCXK(京):2002-0001。小鼠肝癌HepA腹水型,由本单位瘤源室传代保存。

1.2󰀁药物SJAMP为类白色、无臭、无味、无定型粉末,由本单位制备。

1.3󰀁试剂顺铂注射液(DDP,江苏豪森药业股份有限公司);5-氟尿嘧啶(5-Fu,天津泰和制药有限公司);环磷酰胺(CTX,江苏恒瑞医药股份有限公司)。使用前生理盐水配成相应浓度的药液。甲醇为色谱纯;乙酸乙酯为分析纯。

1.4󰀁仪器LC-2010A高效液相色谱仪(日本岛津SPD-10AVP检测器,class-VP工作站)。2󰀁方法

2.1󰀁小鼠实体瘤模型的建立[3]取接种HepA肿瘤7~10d状态良好的荷瘤(腹水型)动物,常规消毒后抽取腹水,以腹水与生理盐水之比为1#3比例稀释,制备成接种用的肿瘤细胞混悬液。按每只0.2ml接种于小鼠右侧腋窝皮下。

2.2󰀁SJAMP对化疗药物的体内增效实验[4]将接种肿瘤后的动物于次日按体质量随机分为7组,即对照组,SJAMP组,化疗药高、中、低剂量组,SJAMP+化疗药中剂量组,SJAMP+化疗药低剂量组。对照组给予等量生理盐水(NS),其他各组给予相应药物。SJAMP为肌肉注射(im)给药,化疗药物为腹腔注射给药(ip)。实验结束后,将小鼠断颈椎处死,剥离瘤体称重并计算抑瘤率。

抑瘤率(%)=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)∃100%

2.3󰀁SJAMP对5-Fu在肿瘤组织中含量影响的实验[5]

收稿日期:2010󰀁01󰀁01;󰀁修订日期:2010󰀁11󰀁30基金项目:天津市自然科学基金(No.013613611)

作者简介:赵秀梅(1975󰀁),女(汉族),河北黄骅人,现任天津市医药科学研究所助理研究员,硕士学位,主要从事中药药理、肿瘤药理的研究工作.

*

通讯作者简介:胡人杰(1955󰀁),男(汉族),天津人,现任天津市医药科

学研究所研究员,硕士生导师,学士学位,主要从事中药药理、肿瘤药理的研究工作.

%3062%

LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.12时珍国医国药2010年第21卷第12期

2.3.1󰀁色谱条件色谱柱为大连依利特HYPERSILC18柱(4.6mm∃250mm,5󰀁m);流动相为5%甲醇溶液;流速0.7ml/min;柱温25&;检测波长270nm;进样量10󰀁l。2.3.2󰀁5-Fu在肿瘤组织中含量测定选取接种HepA肿瘤7~10d的荷瘤小鼠为动物模型。动物共分为两组,单独给药组:ip5-Fu100mg/kg;合并用药组:预先imSJAMP100mg/kg,4h后再ip5-Fu100mg/kg。注射5-Fu后20min解剖取出肿瘤,用滤纸吸干肿瘤表面液体,称重,置研磨器中研磨成1#1的组织匀浆,3000r%min-1离心15min。取上清150󰀁,l加乙酸乙酯3m,l漩涡振荡4min,3000r%min-1离心15min,吸取上清,于40&水浴N2气吹干,加流动相600󰀁,l漩涡振荡,0.22󰀁m滤膜过滤后,进行HPLC分析。结果见表4。2.4󰀁统计学处理所有数据均以x󰀂∋s表示,采用单因素方差分析,判断组间差异,P<0.05有统计学意义。3󰀁结果

3.1󰀁SJAMP对化疗药物的体内增效实验从结果可以看出,在相同的剂量下,化疗药物与SJAMP合用组和单独使用化疗药组相比,肿瘤的体积明显减小,低剂量合用组已经达到或接近单独使用化疗药的中剂量组的抑瘤率,而且中剂量合用组的抑瘤率与高剂量组的抑瘤率相比也非常接近。经统计学检验,CTX中剂量合用组与高剂量组;DDP低剂量合用组与中剂量组;DDP中剂量合用组与高剂量组;5-Fu低剂量合用组与中剂量组,均无显著性差异(P>0.05)。此外,除了5-Fu高剂量组动物体重下降较多,其他各组的体重并没有发生明显的变化。说明SJAMP在增加化疗药物的抗癌效果的同时,并没有增加这些药物的毒性,这些结果共同说明SJAMP对CTX、DDP、5-Fu等3种不同类型的化疗药物均具有明显的增效作用,而且增效作用具有广谱性。结果见表1~3。

表1󰀁SJAMP与CTX合用对小鼠HepA实体瘤的影响(x󰀂∋s)

抑瘤率(%)

C/mg%

对照14/14-781.705-SJAMP10/10100∃1481.30921.24CTX12/1280∃1000.0a94.5CTX12/1240∃1930.055abc70.18

cCTX12/1220∃138120.69.448

SJAMP+100∃1+

10/1023.15∋2.47090.16.195∋0.140a

CTX40∃1SJAMP+100∃1+

10/1025.25∋1.460.861∋0.231a56.56

CTX20∃1󰀁󰀁a:与对照组相比,P<0.05;b:与低剂量的合用药组比较,P<0.05;c:与等剂量的合用药组比较,P<0.05

kg-1

组别

n

剂量

体质量

m/g29.∋3.28.10∋3.23.83∋2.23.88∋1.25.63∋3.

瘤重

m/g982∋0.561∋0.109∋0.591∋0.572∋0.

3.2󰀁SJAMP对5-Fu在肿瘤组织中含量影响的实验合并用

药组肿瘤组织中的5-Fu含量与单独用药组相比,稍稍降低(减少了11.51%),但二者经统计学检验不存在差异(P>0.05),结果见表4。

表4󰀁SJAMP与5-Fu合用对小鼠HepA实体瘤的影响(x󰀂∋s)

组别

n

剂量C/mg%

100100+100

kg-1

体质量m/g26.19∋4.1426.18∋3.11

瘤重

m/g1.948∋0.6862.104∋0.793

5-Fu浓度C/󰀁g%ml-1

25.71∋5.2322.75∋4.69

5-Fu13SJAMP+5-Fu14󰀁󰀁

表2󰀁SJAMP与DDP合用对小鼠HepA实体瘤的影响(x󰀂∋s)

剂量

C/mg%kg-1

对照14/13-SJAMP10/10100∃1DDP12/122∃2DDP10/102∃1DDP10/101∃1SJAMP+100∃1+

12/10

DDP2∃1SJAMP+100∃1+

12/12

DDP1∃1󰀁󰀁a:与对照组相比,P<0.05组别

n

剂量

体质量

m/g24.81∋2.25.15∋3.20.79∋0.22.20∋1.23.55∋2.

瘤重

m/g322∋0.052∋0.703∋0.912∋0.121∋0.

抑瘤率(%)368

456247a233229

-20.4246.8231.0115.2040.3931.99

08

349603021.1.0.0.1.

23.08∋1.9224.17∋2.65

0.788∋0.267a0.9∋0.408a

4󰀁讨论

SJAMP为中药刺参中提取的有效成分,我们在实验设计时参照了󰀂中药新药研究指南 中󰀂治疗恶性肿瘤中药的药效学研究 关于中药对化疗药物增效作用的实验方法,同时结合实验具体需要,分别设立生理盐水对照组,化疗药物的高、中、低剂量组和化疗药物中、低剂量与SJAMP合用组和SJAMP单独用药组。将合用组与单独用药组进行比较,比较中剂量合用组的药效(肿瘤的重量和肿瘤生长抑制率)是否达到或接近单独使用化疗药的高剂量的效果,低剂量合用组的药效能否达到或接近单独使用化疗药的中剂量的效果,并作统计学处理。本实验研究发现,SJAMP对CTX、DDP、5-Fu3种不同类型的化疗药物均具有明显的增效作用,说明其增效作用有广谱性。以往的研究证实SJAMP本身即具有抗肿瘤效果,如今又发现它对化疗药物有增效作用。即在与化疗药物结合使用时,能减少化疗药物的使用量,而不会降低其疗效。因此,SJAMP作为化疗辅助药物进行开发应具有很好的应用前景。

我们在前期的实验中证实SJAMP可以提高小鼠肿瘤组织的血流量,据此推测SJAMP与化疗药物合用能够提高其抗肿瘤疗效与SJAMP提高肿瘤组织的化疗药物浓度有关。为此,我们想通过实验加以证实。体内增效实验中选用的3种化疗药物以5-Fu的测定方法较为成熟,所以本实验选用5-Fu进行测定肿瘤组织中的药物浓度。我们在先期实验中测定了小鼠腹腔注射5-Fu后血药浓度变化,发现血液中5-Fu浓度峰值约在给药后20min出现,90~120min时含量急剧降少到几乎测不到。同期实验中还发现肌肉注射100mg/kgSJAMP后,1~8h小鼠凝血时间明显延长,4h已接近最高值。根据以上实验结果,综合设计了SJAMP对5-Fu在肿瘤组织中含量影响实验的给药方案。但实验结果显示,合用药组肿瘤组织中的5-Fu含量低于单独用药组,这种结果与最初的推测正好相反。SJAMP能够增加肿瘤组织中血流量,却不能使其中的药物含量增加,推测原因可能是由于SJAMP具有肝素样的抗凝血作用,对5-Fu的代谢产生了影响,使其药动学参数发生了变化。或是SJAMP在抗凝作用产生的同时会诱导一过性的血小板聚集,所以很可能抗凝的产生与肿瘤组织中血流量的增加并不同步,比如在采集肿瘤组织时尚处于血小板聚集期,尽管此时抗凝作用明显,很可能肿瘤组织中的血流量并不增加。因此,关于SJAMP可以增加肿瘤组织化疗药物5-Fu含量的研究,还有待于我们进一步实验才能确定。

参考文献:

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民卫生出版社,2002:1757.

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[5]󰀁张󰀁奇,邓英杰,罗.HPLC研究5-FU长循环脂质体大鼠体

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表3󰀁SJAMP与5-Fu合用对小鼠HepA实体瘤的影响(x󰀂∋s)

体质量瘤重

抑瘤率(%)

C/mg%kg-1m/gm/g

对照14/14-26.96∋3.951.596∋0.477-SJAMP10/10100∃125.25∋2.401.215∋0.48623.87

ab5-Fu10/940∃417.94∋1.680.133∋0.08691.67

5-Fu10/1025∃421.10∋2.760.909∋0.431a43.055-Fu10/1015∃424.45∋2.111.288∋0.43719.30SJAMP+100∃1+

12/1220.45∋2.0.519∋0.269a67.48

5-Fu25∃4SJAMP+100∃1+

12/1224.63∋1.320.960∋0.369a39.85

5-Fu15∃4󰀁󰀁a:与对照组相比,P<0.05;b:与低剂量的合用药组比较,P<0.05组别

n

%3063%