附录1：实验程序及所用溶液配方
实验程序1：DNA小量提取法（SDS小量提取法）
1. 取每个水稻样本新鲜叶片2cm左右于1.5 eppondorf管中，加入液氮磨碎。
2. 加入700ul已预热至650C 的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水中，温浴30min。
3. 加入200ul 5MKAc混合液，颠倒充分混匀，冰浴30min后，40C 8000转离心5min，将上层液倒入另一新的1.5ml eppondorf管中。
4. 加入等体积的异丙醇，置于-200C 30min，40C 10000转离心4min。
5. 弃上清，加入70% 乙醇清洗，晾干。
6. 将风干的DNA溶于100ul TE溶液中，存于40C备用。
实验程序2：DNA大量提取法（SDS大量提取法）
1.准备工作：将DNA提取液放于650C的水浴锅中预热，将异丙醇放于-200C冰箱中预冷，选好50 ml的离心管灭菌。
2.每个水稻样本新鲜叶片取1-3g，剪碎，放入研钵，加入液氮磨碎。
3.将研磨好的叶片转于50ml的离心管中，加入20ml已预热至650C 的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水中，温浴20min，以使反应充分完全。
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4.取出离心管，加入5 ml 5MKAc混合液，颠倒充分混匀，冰浴20min，冰浴期间要将离心管上下颠倒数次。
5.加入15ml氯仿，嫩叶片会起泡沫，老叶片则变成墨绿或变黑。室温下以3000（10000 rmp的速度离心 3min），将上层液倒入另一新的50 ml离心管中。
6.加入等体积的异丙醇，轻轻摇晃直至形成DNA絮状沉淀。
7.待DNA结块，用玻棒挑出DNA，用75%乙醇清洗两次，将乙醇到掉，晾干。8. 将风干的DNA溶于500ul TE溶液中，存于40C备用。
SDS抽提液
1M Tris-Hcl 100ml Ph 8.0
0.5MEDTA 100ml pH 8.0
5MNaCl 100ml
10%SDS （十二烷基硫酸钠）） 125ml
加蒸馏水定容至1000ml。
5MNaCl 100ml
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在80ml水中溶解29.22gNaCl加水定容至100ml，分装后高压灭菌
10%SDS （十二烷基硫酸钠）） 1000ml
在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的PH值至7.2，加水定容至1000ml，分装备用。
5M KAC混合液（100ml）
60ml 5M 醋酸钾
11.5ml 冰醋酸
28.5ml H2O
5M 醋酸钾 1000ml
将491g醋酸钾（1M为98.2g）溶解于90ml纯水（Mill-Q水或相当级别的水）中，用2mol/L乙酸调节PH值至7.5后加入纯水定容到1L，保存于-20℃。
TE (pH 8.0) 100ml
10 mM Tris-HCl ( pH 8.0) 1ml (1M, ph 8.0)
1mM EDTA (pH 8.0) 0.2ml (0.5M, ph 8.0)
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加蒸馏水定容至100ml,高温灭菌。
0.5M EDTA (pH 8.0)
18.61g Na2EDTA-2H2O 溶于80mlH2O中，用NaOH 调pH至8.0，定容至100ml， 高温灭菌，室温保存。
1M Tri-HCl (pH 8.0)
在800ml 水中溶解121.1g Tris碱，加入浓HCl调节pH值至所需值。（参《分子克隆》，金冬雁等，1996）
实验程序4：PCR扩增
（一）PCR 反应体系
20ul 体系
终浓度
Primer pair (4uM) 2ul 0.4 uM
10×buffer 2ul 1×buffer
Mg2+(25mM) 2ul 2.5uM
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dNTPs(10mM) 0.3ul 133ul
Taq酶（4u/ul） 0.25ul 1U/20ul
DNA(20ng/ul) 2ul 1.5ng/ul
Sterile water 11.45ul
(二) PCR 反应程序
SSR
94℃,5min →94℃,1min → 53℃,1min →72℃,10min→ 4℃,保存
↘ ↙
72，1.5min (35个循环)
实验程序5： 聚丙烯酰胺凝胶电泳
（一） 制胶
30% acrylamide (丙烯酰胺)胶贮存液
acrylamide 290g
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bis-acrylamide(双叉丙烯酰胺) 10g
先溶于总体积为600ml的水中，加热至37℃溶解，定容至1000ml。 4℃保存于棕色瓶中。
10%过硫酸铵（ammonium persulphate）
超纯过硫酸铵 2g
超纯水 18ml
10×TBE buffer
Tris base 54g
Boric acid(硼酸) 27.5g
0.5M EDTA(ph 8.0) 18.625ml
搅拌溶化，定容至500ml.
40％的蔗糖上样缓冲液（100ml）
蔗糖40g+60ml水+0.025g二甲苯蓝+0.025g溴酚蓝
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
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A凝胶的灌制
（1）玻璃板的清洗：用洗涤灵或洗衣粉把玻璃板反复擦洗干净，用蒸馏水冲洗干净，放置干燥备用。（酒精擦洗）操作中，防止两玻璃板相互污染，彻底干燥后再进行玻璃板组装、灌胶。
（2）玻璃板的组装：将玻璃板组装好，有缝隙的一边用2.0%的琼脂糖（2 g琼脂糖+98ml水）封住，将封好的玻璃板组装在电泳槽上待用。
（3）电泳凝胶的配置（用6％的非变性凝胶）
组分 用量
30％丙稀酰胺 8ml
1×TBE 32ml
10%过硫酸铵 270µl
TEMED 25µl
终体积 40ml
按以上顺序加入各组分（TEMED一定要最后加入），充分摇匀后将配好的胶轻轻灌入两玻璃板之间，当胶加到上部时，在灌胶口插入梳子，并防止梳子底部产生气泡。（要根据胶框选取合适的梳子，以防产生胶膜，影响点样）若有漏出应及时补加聚丙烯酰胺溶液。
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置于室温让其聚合30min以上。
B扩增产物的电泳
(1)电泳缓冲液：待凝胶聚合后，在电泳槽中加入1×TBE的电泳缓冲液。
(2)预电泳：将梳子轻轻拔出，200V预电泳10～30min。
(3)上样：预电泳后，将PCR产物4µl和40％的蔗糖上样缓冲液0.5µl混合，用移液枪吸取混合液轻轻加入点样孔，尽量缩短加样时间。
(4)电泳条件：接上电源，电泳。参数为恒压200V，电泳1.5h(视DNA分子量大小及带型差异的可辨程度，调整电泳时间)。电泳结束后，切断电源，倒去电泳缓冲液，卸去玻璃板，去掉琼脂糖封胶，准备染色。
C扩增产物的快速银染法
(1)固定：10％的乙醇＋500µl冰乙酸，摇匀后加入凝胶，摇3～5min。
(2)染色：1ml 20%AgNO3后平行摇5～8min。
(3)漂洗：倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗2～3次，洗净后倒掉蒸馏水。
(4)显色：100ml 3％NaOH+500µl甲醛，迅速振荡，使显影液均匀作用，平行摇动，直至显影。
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(5)洗涤：显影后，倒掉显影液，加入蒸馏水洗凝胶1～2次，彻底去掉显影液，以免保存时变色。
(6)用蒸馏水冲洗干净，吸干水，上面盖上保鲜膜，统计带型，并照相或扫描。
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