分子标记的发展及分子标记辅助育种

分子标记的发展及分子标记辅助育种

分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection (MAS)或Marker Assisted Breeding)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记），在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择的育种技术。通过分子标记检测，将基因型与表现型相结合，应用于育种各个过程的选择和鉴定，可以显著提高育种选择工作的准确性，提高育种研究的效率。

分子标记辅助育种示意图

DNA分子标记相对同类技术来说具有很强的优越性：因为大部分标记为共显性，对隐性性状的选择十分有利；数量极多，应对极其丰富的基因组变异；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁等等。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术也有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴定、基因库构建、基因克隆等方面。

分子标记的类型

分子标记按技术特性可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指

纹技术；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。

分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不高，一般实验室均可进行。对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。

各种分子标记的原理和优缺点

第一代分子标记：RFLP

RFLP在20世纪70年代已被发现，是发现最早的一种分子标记。1980年，人类首先将其用于构建连锁图。

RFLP标记的原理：植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶(restriction enzymes，简称RE)酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因。对每一个DNA／RE组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA所特有的“指纹”。某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离，然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用放射性同位素(如P)或非放射性物质(如生物素、地高辛等)标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交(即Southern杂交)，若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针就结合在这个位置上。放射自显影或酶学检测后，即可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况。对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分子，通过合适的限制性内切酶酶切，电泳分析后有可能直接检测出DNA片段的差异，就不需Southern杂交。RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆、植物基因组克隆(Random Genome克隆，简称RG克隆)和PCR克隆。

优点: RFLP标记具有共显性的特点。共显性(co-dominant)标记指的是双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现。它已被广泛用于多种生物的遗传分析，特别是构建植物遗传图谱。

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缺点：RFLP分析的探针，必须是单拷贝或寡拷贝的，否则，杂交结果不能显示清晰可辨的带型，表现为弥散状，不易进行观察分析。RFLP标记所需DNA量大，检测步骤繁琐，需要的仪器、设备较多，周期长，检测少数几个探针时成本较高，用作探针的DNA克隆其制备与存放较麻烦；检测中要利用放射性同位素(通常为P)，易造成污染。尽管非放射性物质标记方法可用，但价格高，杂交信号相对较弱，灵敏度也较同位素标记低。目前，RFLP标记直接用于育种成本高，逐渐被第二代、第三代分子标记取代。

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第二代分子标记：基于PCR技术的RAPD/SCAR/AFLP/SSR

RAPD标记

由Williams等(1990)以DNA聚合酶链式反应为基础而提出。

RAPD标记的原理 RAPD标记是用随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物(长度为10个核苷酸)通过PCR扩增染色体组中的DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。RAPD标记的原理同PCR技术，但又有别于常规的PCR反应。主要表现在以下3个方面：①引物。常规的PCR反应所用的是一对引物，长度通常为20bp(碱基对)左右；RAPD所用的引物为一个，长度仅10bp。②反应条件。常规的PCR复性温度较高，一般为55—60℃，而RAPD的复性温度仅为36℃左右。③扩增产物。常规PCR产物为特异扩增，而RAPD产物为随机扩增。这样，RAPD反应在最初反应周期中，由于短的随机单引物，低的退火温度，一方面保证了核苷酸引物与模板的稳定配对，另一方面因引物中碱基的随机排列而又允许适当的错配，从而扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，提高了基因组DNA分析的效率。RAPD标记一般表现为显性遗传，极少数表现为共显性遗传。显性标记指的是F1的多态性片段与亲本之一完全一样，这样在杂交组合后代中扩增产物的记录可记为“有／无”，即把每一随机扩增多态性片段作为分子图谱的一个位点。

优点： RAPD引物长一般为10个碱基，人工合成成本低，一套引物可用于不同作物，建立一套不同作物标准指纹图谱。RAPD可以方便用于种质资源指纹档案建立，种内遗传多样性分析和品种纯度鉴定。由于使用DNA扩增仪，操作自动化程度高，分析量大，且免去了RFLP中的探针制备、同位素标记、Southern印迹等步骤，分析速度很快。RAPD分析所需DNA样品量少(一般5～10ng)，对DNA质量要求较RFLP低。同时，RAPD标记还可转化为RFLP探针，SCAR及STS等表现为共显性和显性的分子标记。

缺点：RAPD最大缺点是重复性较差。RAPD标记的实验条件摸索和引物的选择是十分关

键而艰巨的工作。为此研究人员要对不同物种做大量的探索工作，以确定每一物种的最佳反应程序包括模板DNA、引物、Mg浓度等。对实验条件标准化要求很高。 SCAR标记

在RAPD技术的基础上，1993年，Paran等提出了一种将RAPD标记转化成特异序列扩增区域标记，即SCAR标记。

原理：目标DNA经RAPD分析后，先将RAPD多态片段克隆然后对克隆片段两端测序再根据测序结果设计长为18～24bp的引物，一般引物前10个碱基应包括原来的RAPD扩增所用的引物。多态性片段克隆之前首先应从凝胶上回收该片段，由于Taq酶可使PCR产物3’末端带上A尾巴，人工设计的克隆载体5’末端有一个突出的T碱基，这样可使PCR产物高效地克隆到载体上。将连接产物经过转化大肠杆菌，涂平板，挑选重组克隆，测序分析、设计引物，PCR扩增，检测是否还能扩增出原来的多态性条带等一系列实验，检测转化成功的标记就称为SCAR标记。由于SCAR标记所用引物长，特异性扩增重复性好，可有效的用于分子育种。

优点：SCAR标记是共显性遗传，待检 DNA 间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。结果稳定性好，重现性高。

缺点：操作步骤较多。 AFLP

AFLP是荷兰Keygene公司科学家Marc ＆ Pieter l993年创造发明的一种DNA分子标记。该技术是对限制性酶切片段的选择性扩增，又称基于PCR的RFLP。鉴于AFLP标记的多态性强，一次可检测到100—150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及遗传多样性的研究。

AFLP标记的原理：首先对基因组的DNA进行双酶切，其中一种为酶切频率较高的限制性内切酶(frequent cutter)，另一种为酶切频率较低的酶(rare cutter)。用酶切频率较高的限制性内切酶消化基因组DNA是为了产生易于扩增的，且可在测序胶上能较好分离出大小合适的短DNA片段；用后者消化基因组DNA是限制用于扩增的模板DNA片段的数量。AFLP扩增数量是由酶切频率较低的限制内切酶在基因组中的酶切位点数量决定的。将酶切片段和含有与其黏性末端相同的人工接头连接，连接后的接头序列及临近内切酶识别位点就作为以后PCR反应的引物结合位点，通过选择在末端上分别添加1～3个选择性碱基的不同引物，选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合，从而实现特异性扩增，最后用变性聚

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丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。为了避免AFLP分析中的同位素操作，目前已发展了AFLP荧光标记、银染等新的检测扩增产物的手段。

优点：AFLP技术结合了RFLP稳定性和PCR技术高效性的优点，不需要预先知道DNA序列的信息，因而可以用于任何动植物的基因组研究。另外，AFLP多态性远远超过其他分子标记，利用放射性同位素在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳可检测到50—100条AFLP扩增产物，一次PCR反应可以同时检测多个遗传位点，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。AFLP标记多数具有共显性表达、无复等位效应等优点，并且表现稳定的遗传性。 缺点：该技术受专利保护，目前用于分析的试剂盒价格较贵，分析成本高；对DNA的纯度及内切酶质量要求也比较高，这也是它的不足之处。 SSR

1987年，Nakamura发现生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列，他们在生物体内多态性水平极高，一般称为可变数目串联重复序列，简称VNTR(Variable number tandem repeat)。VNTR标记包括小卫星(minisatellites)和微卫星(microsatellites)标记两种。微卫星标记，即SSR标记，是一类由1～6个碱基组成的基序(motif)串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置这类序列的重复长度具有高度变异性。对SSR的研究最早始于动物基因组，特别是人类和哺乳动物基因组研究。目前植物SSR研究也非常活跃。

SSR标记的原理：尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置上，但其两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。一般地，同一类微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，通过其重复次数的不同以及重叠程度的不完全而造成每个座位的多态性。SSR标记多态性丰富，重复性好，其标记呈共显性，分散分布于基因组中。

优点：SSR的检测是依据其两侧特定的引物进行PCR扩增，因此是基于全基因组DNA扩增其微卫星区域。检测到的一般是一个单一的复等位基因位点。SSR标记为共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；重复性高，稳定可靠。为了提高分辨率，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳它可检测出单拷贝差异。它兼具PCR反应的优点，所需DNA样品量少，对DNA质量要求不太高。

缺点：使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列。这可以在其他种的

DNA数据库中查询，但更多的是必须针对每个染色体座位的微卫星，从其基因组文库中发现可用的克隆，进行测序，以其两端的单拷贝序列设计引物，因此微卫星标记的开发成本高。

第三代分子标记

SNP（Single nucleotide polymorphism ）是指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。随着人类基因组计划研究的深入，人类基因组单核苷酸多态性标记（SNP）的研究应运而生，并且得到异常迅猛的发展。单核苷酸多态性标记（SNP）被称为“第三代DNA遗传标记”，这种遗传标记的特点是单个碱基的置换。SNP广泛分布于基因组范围内，具有变异来源丰富、潜在数量巨大等优点，被认为是应用前景最好的遗传标记物。

优点：SNP数量多，分布广泛；高通量，适于快速、规模化筛查；SNP等位基因频率的容易估计；易于基因分型。

缺点：由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被检测到。

三代分子标记比较

纵观整个分子标记的发展史，对三种分子标记总结如下： 分子标记类型 第一代分子标记 代表种类 RFLP 原理 以酶切为基础 技术特点 检测步骤多，周期长，密度低 第二代分子标记 SSR等 以PCR反应为基础 周期长、密度中等 第三代分子标记 SNP 以序列为基础 周期短、密度高 通过比较发现第三代分子标记更适合现代大规模的分子育种研究，而且随着测序技术的发展，SNP检测的效率得到大大的提高，成本也越来越低。通过高通量测序，大规模的SNP标记被发掘出来并在育种中得到了广泛应用，如构建遗传图谱，挖掘功能基因，对核心种质资源进行进化选择分析等。