马兜铃酸肾毒性的临床特征、分子机制及治疗策略

涂玥;万毅刚;孙伟;吴薇;刘莹露;姚建

【摘 要】不同于马兜铃酸(Aristolochic acid,AA)突变指纹诱发肝癌,AA具有明确的肾毒性,并且会诱发3种不同类型的马兜铃酸肾病(Aristolochic acid

nephropathy,AAN).AA肾毒性的临床特征为缺乏特异性症状、少量肾小管性尿蛋白、进行性肾功能衰竭、贫血以及广泛的寡细胞性肾间质纤维化伴肾小管萎缩.AA肾毒性的分子机制主要是指AA通过影响微小RNA、内质网应激、氧化应激而直接或间接地诱导肾脏细胞凋亡;此外,肾组织炎症可能也可能是AA肾毒性的分子机制之一.AA肾毒性的治疗策略包括低剂量糖皮质激素、前列腺素E1、骨髓间充质干细胞以及中药复方及其提取物等.近年来,我国对含AA的中药材和中成药实施了严格管制,使得AA肾毒性事件和AAN发生率逐年减少.尽管如此,中药相关的药物性肾损伤(Drug-induced kidney injury,DKI)还是不容忽略的问题,其中,建立中药肾毒性的评价方法是认识其分子机制、探寻其治疗策略的关键所在.%It is reported that aristolochic acid(AA)not only has the definite nephrotoxicity but also causes the 3 different types of aristolochic acid

nephropathy(AAN),which is different from the mutational signature of AA in inducing hepatocellular carcinomas.The clinical features of AA-induced nephrotoxicity include the lack of specific symptoms,a small amount of tubular proteinuria,the progressive renal failure,anemia and the extensive renal interstitial fibrosis with few infiltrated cells,along with tubular atrophy.The molecular mechanisms of AA-indueed nephrotoxicity mainly refer to the induction of renal cellular apoptosis by affecting

microRNAs(miRNAs),endoplasmic reticulum stress and oxidative stress

directlyor indirectly.In addition,renal inflammation is probably related to the molecular mechanism of AA-induced nephrotoxicity.The therapeutic strategies of AA-induced nephrotoxicity contain the low-dosage of glucocorticoids,prostaglandin E1,bone marrow mesenchymal stem cells and Chinese herbal compound prescriptions and their extracts.Recently Chinese government has maintained strict controls on Chinese medicinal materials and Chinese traditional patent medicines containing AA,so that the incidences of AA-induced nephrotoxicity and AAN have been decreasing year by year.Nevertheless,Chinese herbal medicines (CHM) related drug-induced kidney injury(DKI)cannot be ignored,in

which,establishing the evaluation methods of nephrotoxicity of CHM is the key point to understand the molecular mechanisms and explore the therapeutic strategies.

【期刊名称】《南京中医药大学学报》 【年(卷),期】2018(034)001 【总页数】7页(P12-18)

【关键词】马兜铃酸肾毒性;马兜铃酸肾病;药物性肾损伤;分子机制;治疗策略 【作 者】涂玥;万毅刚;孙伟;吴薇;刘莹露;姚建

【作者单位】南京中医药大学第二临床医学院,江苏南京210023;南京大学医学院附属鼓楼医院,江苏南京210008;南京中医药大学肾病研究所,江苏南京210029;南京中医药大学肾病研究所,江苏南京210029;南京大学医学院附属鼓楼医院,江苏南

京210008;南京大学医学院附属鼓楼医院,江苏南京210008;日本山梨大学医学部尖端应用医学研究所分子信号教研室,日本409-38 【正文语种】中 文 【中图分类】R285.1

据报道[1-2]，在地区的78例肝癌患者肝组织和血液样本中发现马兜铃酸(Aristolochic acid，AA)突变指纹，因此，AA被认为是诱发肝癌的重要因素。目前，尽管AA突变指纹与肝癌发病之间还缺乏直接的证据[3]，但是，自上世纪90年代以来，对于“AA肾毒性”以及“马兜铃酸肾病”(Aristolochic acid nephropathy，AAN)已经具备了明确的结论和较为深刻的认识[4]。1999年，比利时学者在《柳叶刀》杂志上首先报道了个别妇女因服用含“关木通”的减肥中草药茶而出现肾衰竭，而且，这些患者的肾损伤与中草药有明确的因果关系，所以，中草药相关的肾脏疾病被称为“中草药肾病”(Chinese herb nephropathy，CHN)[5]；2001年，Krumme等发现，CHN患者的肾损伤与含有AA的常用中草药(关木通、广防己、青木香、细辛、天仙藤、马兜铃等)有关[6]；同年，我国学者胡世林提出用AAN取代CHN[7]。至此，AAN作为药物性肾损伤(Drug-induced kidney injury，DKI)的病种而被国际肾脏病学界认可并沿用至今。研究表明，药物在肾脏的滤过量与血药浓度、蛋白结合率、肾小球滤过率密切相关[8]。像AA这样的大分子物质与血浆白蛋白结合后是不能经肾小球滤过的，其部分代谢产物经肾小管分泌、排泄，这一过程主要依赖于近端肾小管上皮细胞的转运功能，因此，AA诱发的DKI最易发生在近端肾小管，尤其是在肾功能减退时表现得更为明显[9]。此外，Arlt等发现，AA对于肾小管上皮细胞和尿道上皮细胞是有毒性的，AA主要毒性成分为AAI(C17H11NO7)和AAII(C16H9NO6)，其中，

AAI的毒性最强[10]。在硝基还原酶的催化下，AA一部分被还原为马兜铃内酰胺(Aristololactam，AL)，另一部分在还原过程中进一步与DNA作用而形成AA-DNA加合物(DNA adducts)[11-12]。国内外学者认为，对于AA诱发的AAN和泌尿系统移行细胞癌，检测AA-DNA加合物是有重要诊断价值的[13-15]。然而，令人遗憾的是，AA-DNA加合物检测必须在新鲜的肾组织中提取DNA才能实现，因此，目前AA肾毒性和AAN尚无特异性诊断标准。 1 马兜铃酸肾毒性的临床特征

在临床上，AAN大致分为3种类型。第1种类型是慢性马兜铃酸肾病(Chronic aristolochic acid nephropathy，CAAN)，这是由于患者长期服用常规剂量的含AA的中草药所导致的，临床表现为不同程度的进行性肾功能减退或慢性肾衰竭；早期患者可表现为夜尿增多，轻、中度血压升高，贫血等；尿检可见轻度蛋白尿、低渗透压尿、肾性糖尿、无菌性白细胞尿、微量红细胞以及尿酶异常等。其肾组织病理形态特征包括：肾间质呈多灶状或大片状寡细胞性纤维化，偶有少量淋巴及单核细胞散在浸润，近端肾小管细胞刷状缘消失，皮质区域从浅到深呈大片状萎缩，肾小球基底膜皱缩、折叠以及毛细血管襻塌陷[16]。第2种类型是急性马兜铃酸肾病(Acute aristolochic acid nephropathy，AAAN)，这是由于患者短期过量服用含AA的中草药所导致的，临床表现为少尿性或非少尿性急性肾衰竭，往往伴有水肿、血尿、蛋白尿、肾性糖尿及尿酶增高等。其肾组织病理形态特征包括：以肾小管间质损伤为标志的急性肾小管坏死(Acute tubular necrosis，ATN)，肾小管上皮细胞刷状缘脱落，上皮细胞肿胀、颗粒变性，甚至坏死、脱落，部分肾小管基膜裸露，肾间质水肿，偶有少量淋巴及单细胞散在浸润，小动脉内皮细胞肿胀，肾小球基本正常[17]。第3种类型是肾小管功能障碍型马兜铃酸肾病(Tubular dysfunction AAN)，这是由于患者间断服用少量含AA中草药所导致的，临床表现为肾小管近端、远端酸中毒，还可能出现氨基酸尿、尿酸盐尿、不完全或完全性

肾性糖尿等。其肾组织病理形态特征包括：肾小管变性、萎缩，部分甚至崩解、脱落，肾小管管腔扩张，肾间质无明显病变或轻度水肿，肾小球基本正常[18]。此外，AA肾毒性还可诱发泌尿系统移行细胞癌(包括上尿路尿道上皮细胞癌、膀胱癌、肾细胞癌)以及胆管癌、肝细胞癌、胃癌和肺癌等[19]。 2 马兜铃酸肾毒性的分子机制 2.1 微小RNA

微小RNA(miRNAs)是长度约20～24个核苷酸的非编码RNA，通过碱基互补配对，作用于靶基因的3'非翻译区而诱导靶基因mRNA降解或抑制其翻译，在转录后水平对基因进行，从而抑制相关蛋白质的合成[20]。miRNAs可以作为触发RNA干扰的分子而参与细胞增殖、凋亡相关基因的表达，从而参与机体内多种病理、生理过程[21]。在不同的细胞类型或具体环境下，miRNAs可以发挥促进细胞凋亡或抑制细胞凋亡的不同作用[22-23]。张良等利用基因芯片技术研究AA肾毒性的分子机制与miRNAs的关系。作者在AAI诱导的肾毒性大鼠模型血清中发现5个miRNAs(miR-10a-3p、miR-207、miR-3594-3p、miR-874-3p和miR-9a-3p)高表达，并预测出Rhebl1、Usp10等16种基因可能为差异表达的miRNAs靶基因，这些靶基因可以在上游肾脏细胞凋亡；通过进一步的信号通路分析，作者还发现，AAI诱导的肾毒性与丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路密切相关[24]，而MAPK信号通路是可以影响肾脏细胞凋亡的。Lü等利用人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)在体外研究AA肾毒性的分子机制与miRNAs的关系。结果表明，有11个差异性表达的miRNAs(Differentially expressed miRNAs，DE-miRNAs)与AA肾毒性有关，其中，有6个DE-miRNAs是AAN的表型标志物，分别是has-miR-192、has-miR-194、has-miR-2-3p、has-miR-450a、has-miR-584和has-miR-33a。这里，只有has-miR-192参与AAN分子机制的明确报道；has-miR-194、has-

miR-2-3p和has-miR-450a是第一次被发现与AAN相关；而has-miR-584和has-miR-33a可能参与尿道肿瘤的形成[25]。简言之，miRNAs可能是在上游通过肾脏细胞凋亡而参与AA肾毒性的分子机制。 2.2 内质网应激

内质网是哺乳动物真核细胞内重要的膜性细胞器，其主要功能是参与蛋白质的折叠、修饰以及Ca2+的贮存、释放。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)表现为内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及Ca2+失衡，还可激活未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应以及凋亡通路[26]。适度的ERS具有细胞保护作用；而过度的ERS会诱导细胞凋亡[27]。Zhu等在体外利用HK-2细胞研究AA肾毒性的分子机制与ERS的关系。作者发现，具有肾毒性的AAI可以诱导HK-2细胞中真核细胞翻译启始子-2α(Eukaryotic initiation factor-2α，eIF2α)磷酸化，增加X-盒结合蛋白1 mRNA的剪接，上调葡萄糖调节蛋白78和增强子结合蛋白同源蛋白的表达；也就是说，对于HK-2细胞，AAI可以激活ERS相关信号通路，诱导细胞凋亡；若采用ERS抑制剂或eIF2α抑制剂预处理HK-2细胞，AAI诱导的细胞凋亡过程则会被明显抑制[28]。简言之，与miRNAs相似，ERS可能也是在上游通过肾脏细胞凋亡而参与AA肾毒性的分子机制。 2.3 氧化应激

机体内促氧化物质和抗氧化物质相互作用而保持平衡状态。一旦出现各种病理因素，促氧化物质产生增多和/或抗氧化物质减少以及抗氧化反应不充分都可导致活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)增加，其结果可使细胞、细胞膜、细胞器等生命基本物质被氧化而发生相应的结构和功能改变，这就是ROS诱导的氧化应激(Oxidative stress，OS)损伤。体内常见的OS产物和抗氧化物质包括丙二醛、抗过氧化氢酶、超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽过氧化物酶等[29-30]。张良等借助AAI诱导的肾毒性大鼠模型研究AA肾毒性的分子机制与OS的关系。作者发现，

AAI能明显升高模型鼠肾组织中丙二醛含量，降低抗过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性，同时，模型鼠肾组织内凋亡小体明显增多，凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、Bax表达水平以及Bax/Bcl-2比值升高，凋亡相关信号通路

p38MAPK激活[31]。此外，Wu等报道[32]，不同浓度的AA(5、20、100 μmol)在体外同样会增加NRK-52E细胞中过氧化氢水平，引起OS损伤和凋亡相关蛋白caspase-3的改变。简言之，OS可能还是通过影响肾脏细胞凋亡而参与AA肾毒性的分子机制。 2.4 细胞凋亡

细胞凋亡是由基因控制的细胞主动的程序性死亡，其途径包括死亡受体途径、线粒体途径以及ERS途径[33]。在不同的细胞类型或具体环境下，细胞凋亡对细胞所在的组织或器官可能是保护，也可能是损伤[33]。Shi等利用C57BL/6小鼠研究AA肾毒性的分子机制与细胞凋亡的关系。作者发现，与雄性C57BL/6小鼠相比，AA更容易诱导雌性C57BL/6小鼠发生肾毒性损伤；具体而言，AA不仅能升高模型鼠血清肌酐，还能上调肾组织磷酸化p53(Ser15)、p53以及cleaved-caspase-3的表达，引起肾小管上皮细胞凋亡；作者推测，AA通过激活p53信号通路而诱导肾小管上皮细胞凋亡可能是AA肾毒性的分子机制之一[34]。Pozdzik等利用Wistar大鼠也得出了类似的结论。作者发现，AA引起模型鼠近端肾小管细胞凋亡、上皮细胞转分化以及肾脏纤维化，这可能是AA肾毒性的病理形态特征[35]。与此不同的是，孙骅等发现，高浓度AA(40 μg/mL)在体外能直接诱导HK-2细胞凋亡和增值抑制；低浓度AA(20 μg/mL)对HK-2细胞的影响主要体现在一过性急性肾小管损伤标志物的改变上，这些改变包括中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白和肾损伤因子-1在基因和蛋白水平上的异常表达[36]。简言之，AA直接或间接诱导的肾脏细胞凋亡可能是AA肾毒性的主要分子机制。 2.5 炎症

炎症是具有血管系统的活体组织对损伤的防御性反应。在炎症过程中，一方面，炎症因子可以直接或间接地造成细胞、组织损伤；另一方面，组织、细胞对炎症的相应反应又可使其得以修复和再生[37]。杨召聪等在AAI诱导的肾毒性大鼠模型中发现，除外肾功能减退，模型鼠肾组织有明显的炎症性改变，包括巨噬细胞浸润，白介素-6、肿瘤坏死因子-α等炎症因子高表达以及经典的炎症信号通路核因子(Nuclear factor，NF)-κB活化；作者推测，AAI可能通过激活NF-κB信号通路而诱发炎症性肾损伤[38]。Pozdzik等在终末期AAN患者的肾脏中发现，除外肾小管/间质纤维化损伤外，也有大量的炎症细胞(巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞)在肾皮质和肾髓质浸润[39]。简言之，除外AA诱导的肾脏细胞凋亡，肾组织炎症可能也可能是AA肾毒性的分子机制之一。 3 马兜铃酸肾毒性的治疗策略 3.1 低剂量糖皮质激素

2016年，我国学者Ma等收集了北京协和医院和新乡医学院第一附属医院在1998年11月-2013年10月期间治疗的43例CAAN患者的相关资料，并且，报道了相关结果。作者将这些患者分为2组，分别为泼尼松组(n=25)和对照组(n=18)；2组患者在药物干预前的基线血清生化指标(肝、肾功能、电解质等)差异无统计学意义；泼尼松组患者给予基础治疗和低剂量泼尼松治疗，对照组患者仅给予基础治疗；具体而言，基础治疗包括低蛋白饮食、补充铁剂和促红细胞生成素、控制血压和血脂、纠正钙/磷代谢紊乱和酸中毒、维持水/盐代谢平衡等；低剂量泼尼松治疗为每天口服泼尼松0.5 mg/kg，治疗1～3月后，逐月减少泼尼松0.05 mg/kg，撤减至每天口服10 mg泼尼松后，维持最低剂量泼尼松治疗1年。在药物干预治疗后的第3、6、9、12月时，观察2组患者血清肌酐，在第6月和第12月时，观察2组患者的其它血清生化指标、血压、血红蛋白以及类固醇副作用，并且，检测尿液中巨噬细胞趋化蛋白-1(Macrophage chemoattractant protein-

1，MCP-1)和转化生长因子(Transforming growth factor，TGF)-β1含量。结果显示，对照组患者的血清肌酐水平与其基线值相比，明显升高；而泼尼松组患者在治疗3～6月后，血清肌酐水平显著降低，与对照组比较，有统计学意义(P<0.05)；2组患者的其它血清生化指标、血压和血红蛋白稳定，而且，没有明显的类固醇副作用。此外，作者发现，2组患者尿液中MCP-1和TGF-β1浓度与血清肌酐呈正相关；泼尼松组患者尿液中MCP-1和TGF-β1浓度明显降低。因此，作者认为，低剂量糖皮质激素可以有效地治疗AA诱导的慢性肾损伤，延缓其肾功能减退；这些作用可能与其抑制肾组织炎症因子活性有关[40]。 3.2 前列腺素E1

2011年，Sun等借助动物模型而发现前列腺素E1(Prostaglandin E1，PGE1)对AAAN肾脏微血管损伤有保护作用。作者将72只SD大鼠随机均分为PGE1组、模型组和正常组；先用浓度为2 g/mL的关木通(Caulis Aristolochia

manshuriensis，CAM)煎液(60 g/kg)给PGE1组和模型组大鼠灌胃，每日2次，连续5 d，建立AAAN动物模型；在造模前，每天经尾静脉分别给予PGE1组、模型组大鼠前列地尔注射液(4 μg/kg)和相同剂量的生理盐水，连续7 d，而正常组大鼠每天仅用相同剂量的生理盐水灌胃；在造模后第3、5、7天分别处死各组大鼠，处死前收集大鼠血清和尿液，检测血清尿素氮、血清肌酐以及24 h尿蛋白排泄率；同时，分别评估模型鼠微血管密度、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)活性以及肾小管/间质缺氧程度；结果显示，与正常组相比，CAM诱导模型鼠出现明显的急性肾损伤，除外肾功能降低和24 h尿蛋白排泄率增加，其肾组织中VEGF表达和微血管密度显著降低，组织缺氧标志物——缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)显著增加；经PGE1干预后，模型鼠肾组织微血管密度、VEGF活性、缺氧程度以及肾功能都得到不同程度的改善。因此，作者认为，针对AA诱导的急性肾脏微血管损伤，

PGE1可能有一定的治疗作用[41]。 3.3 骨髓间充质干细胞

2012年，Li等借助动物模型而发现骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)移植可以改善CAAN模型鼠肾损伤。作者将30只雌性Wistar大鼠分为正常组、模型组和MSC组，每组10只；模型组和MSC组大鼠接受浓度为2 g/mL的CAM煎液(20 g/kg)灌胃，每日2次，每周5 d，连续12周，而正常组大鼠给予相同剂量的生理盐水；造模成功后，经尾静脉注射给予MSC组大鼠含有2×107骨髓MSCs的磷酸盐缓冲液1 mL(来源于同种雄性Wistar大鼠骨髓)，而正常组大鼠经尾静脉注射给予1 mL生理盐水，8周后处死全部大鼠，并检测体质量以及血清、尿液和肾组织相应指标；结果显示，与正常组相比，模型鼠经CAM灌胃12周后，其肾间质纤维化明显加重，并且，血清尿素氮、血清肌酐和24 h尿蛋白定量明显增加，血红蛋白明显降低，而上述改变经骨髓MSCs干预后得到明显改善；此外，骨髓MSCs还可以改善模型鼠肾组织中TGF-β1和肝细胞生长因子(Hepatic growth factor，HGF)核酸和蛋白的表达水平。因此，作者认为，对于AA诱导的慢性肾损伤，骨髓间充质干细胞有治疗肾间质纤维化的作用，其机制可能与其在核酸和蛋白水平干预肾组织TGF-β1和HGF表达有关[42]。 3.4 中药复方及其提取物

Shui等报道[43]，大黄附子汤能改善AAN模型鼠蛋白尿、肾功能和肾间质病理性损伤，还能降低其肾组织中Ⅲ型和Ⅰ型胶原的蛋白表达水平以及线粒体DNA拷贝数、线粒体膜电位、三磷酸腺苷和ROS。因此，作者推测，大黄附子汤可以通过调节AAN模型鼠线粒体功能而治疗AA诱导的肾损伤。王雪等报道[44]，AA肾毒性可诱导斑马鱼血清肌酐升高、肾组织炎症相关因子表达增加，而大黄酸有相应的改善作用。因此，作者推测，大黄酸对AA诱导的斑马鱼肾损伤可能有一定的治疗作用。Wang等报道[45]，在AAI诱导的小鼠肾毒性损伤模型中，黄芩苷能通

过芳香烃受体增加肝脏中细胞色素P450 1A(Cytochrome P450 1A，CYP1A)的表达，减轻AAI肾毒性，改善肾功能。Feng等报道[46]，作为CYP1A的强激动剂，丹参酮I可以通过增强肝脏CYP1A的表达而促进AAI在肝脏和肾脏中的代谢，减轻AAI肾毒性损伤。此外，维生素C[32]、还原型谷胱甘肽[47]、17β-雌二醇[34]、L-精氨酸[48]和三七总皂苷[49]等对AA肾毒性也有一定的治疗作用。 4 讨论

综上所述，不同于AA突变指纹诱发肝癌，近30年来，国际肾脏病学界对AA肾毒性和AAN的结论和认识是明确而较为深刻的。其肾毒性的临床特征为缺乏特异性症状、少量肾小管性尿蛋白、进行性肾功能衰竭、贫血以及广泛的寡细胞性肾间质纤维化伴肾小管萎缩。其肾毒性的分子机制主要是指AA通过影响微小RNA、内质网应激、氧化应激而直接或间接地诱导肾脏细胞凋亡；此外，肾组织炎症也可能是AA肾毒性的分子机制之一(图1)。其肾毒性的治疗策略包括低剂量糖皮质激素、前列腺素E1、骨髓间充质干细胞以及中药复方及其提取物；这里，必须注意的是，迄今为止，还没有AA肾毒性或AAN临床治疗的随机双盲对照试验，因此，有关AA肾毒性的治疗措施均来源于小样本临床报道或动物实验。 图1 马兜铃酸肾毒性的分子机制

研究表明，富含AA的中药(关木通、广防己、青木香、细辛等)在我国已有上千年的临床使用历史。目前，收载于中国药典、部颁标准以及地方药材标准的马兜铃科中药材有24种、含马兜铃属中药材的中成药口服制剂有47种[3]。自2003年以来，我国药物监督行政部门对含AA的中药材和中成药实施了严格管制，并制定了《含毒性药材及其他安全性问题中药品种的处理原则》。因此，AA肾毒性事件和AAN发生率逐年减少[3]。值得关注的是，通过中药炮制、配伍等传统方法也可以不同程度地减轻AA的毒性。严建业等报道[50]，不同的炮制方法(酒制、醋制、蜜制、碱制、碱醋制、盐制、姜制、甘草制、炒焦、米泔水制等)能够影响细辛生

药中AAI的含量，其中，“炒焦”祛除细辛所含AAI效能最优；作者发现，细辛生药中AAI的含量为1.08 μg/g，经炒焦后，AAI的含量降到0.39 μg/g，祛除率高达63%以上。王勇等报道[51]，与关木通单煎液相比，丹皮与关木通(配伍药对)共煎液中AAI的含量明显降低。尽管如此，笔者认为，以AA肾毒性为警示，中药相关性DKI[52]以及中药本身的安全性问题还是不容忽略的。其关键所在是基于肾脏细胞模型而建立中药肾毒性的评价方法[53]。 参考文献:

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