马兜铃酸_肾毒性的实验研究

马兜铃酸Ⅰ肾毒性的实验研究

徐晓月,张陆勇,江振洲

(中国药科大学新药筛选中心,江苏南京210038)

　　摘　要:目的观察马兜铃酸Ⅰ对SD大鼠的肾毒性反应,并评价其安全性。方法马兜铃酸Ⅰ以30,15,5

mg/kg,ig,1次/d,连续14d。结果给药后高剂量组主要表现为体重减轻、活动减少、少尿或无尿;淋巴细胞计数、单

核细胞计数、红细胞计数、红细胞压积、总蛋白质、白蛋白、总胆固醇、K+和Na+等均显著低于对照组,而血小板计β数、中性粒细胞计数、葡萄糖、尿素氮、肌酐和乳酸脱氢酶等升高;尿中白蛋白、乳酸脱氢酶、2N2乙酰氨基葡萄糖苷酶等也显著升高,并有胆红素、白细胞和红细胞排出;肾脏脏器系数增大,肾小球出现红细胞堵塞,近曲小管上皮细胞变性较严重,伴有上皮细胞脱落,间质内可见较大面积的淤血、出血。结论在该试验条件下,马兜铃酸Ⅰ对SD大鼠的肾脏毒性反应较强,不仅作用于近曲小管,亦能损伤肾小球,其安全剂量小于5mg/kg。　　关键词:马兜铃酸Ⅰ;肾毒性;生化指标;SD大鼠;灌胃

　　中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:100521678(2006)0620336204

StudyonnephrotoxicityofaristolochicacidⅠinSDrat

XUXiao2yue,ZHANGLu2yong,JIANGZhen2zhou

(NationalDrugScreeningLaboratory,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210038,China)

　　Abstract:PurposeThestudyonnephrotoxicityofaristolochicacidⅠwasconductedinSDrattoevalu2

ateitssafety.MethodsAristolochicacidⅠwasadministeredtoratatoraldoseof30,15,5mg/kgoncedailyfor14days.ResultsGeneraltoxicsignswerebodyweightloss,actiondecrease,andoliguriaoranuriainthegrouptreatedwith30mg/kg.HematologicalandbloodchemicaltestsrevealeddecreaseinRBC,LY,Mon,HCT,TP,ALB,TC,K+andNa+,andincreaseinPLT,GLU,BUN,CreaandLDH.Urinalysistestsre2sultsshowedthatAlb,LDHandNAGwerenotablyincreased.BIL,WBCandRBCweredetectedinurinesi2multaneously.HistopathologicalexaminationshowedthatRBCobstructedinrenalglomerulusanddegenerationemergedinrenalproximalconvolutedtubulebesideskidneycoefficientaugmentedaccompaniessheddingofen2dothelialcell.Itisthusevidentthatalargeareacongestionandbleedinginrenaltubuleinterstitium.Conclu2sionSeriousnephrotoxicityreactionoccurredinSDratwitharistolochicacidⅠ,andnotonlyproximalconvo2lutedtubulebutalsoglomeruluswereinjuredunderthepresentconditions.Thesafe2doseofaristolochicacid

Ⅰwasestimatedtobebelow5mg/kg.

Keywords:aristolochicacidⅠ;nephrotoxicity;biochemicalindicator;Sprague2Dawleyrat;ig

　　马兜铃酸(aristolochicacid,AA)为3,42次甲二氧基2102硝基212菲酸的衍生物,主要存在于马兜铃属植物中。该属植物药得到鉴定的化学成分包括AA

类及其衍生物、生物碱类、萜类及甾体化合物、黄酮类、苯丙素酚类等,其中AA类为目前公认的毒性成分[1]。由于AA2Ⅰ在AA类成分中含量较高,外源性AA2Ⅰ确实具有直接肾毒性损伤作用,故目前一般认

收稿日期:2006202227;修回日期:2006204204

课题资助:有毒中药质量控制及有毒成分限量示范研究(国中医药科2004ZX05)

作者简介:徐晓月(19732),女,江苏泰州人,主要从事药理毒理学研究,E2mail:xiaoyuexu@hotmail.com;张陆勇(19622),男,通讯作者,研究员,博士生导师,研究方向为分子毒理学和药物筛选,电话:

025283241500,E2mail:lyonzhang@cpu.edu.cn。

为AA2Ⅰ可能是导致肾损害的主要毒性成分[224]。本文对大鼠给予AA2Ⅰ后出现的肾毒性反应作系统的观察和分析探讨,旨在加深对AA2Ⅰ肾毒性的理解,从而对临床安全使用含AA2Ⅰ的植物药提供帮助。1　材　料

AA2Ⅰ为黄色粉末,含量>98%,中国药品生物

中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2006年第27卷第6期337

制品检定所,批号:1107462200204,以0.5%羧甲基纤维素钠将其研磨成相应浓度的混悬液。

AUTOLAB血球自动分析仪,意大利AMS公司;Au800全自动生化分析仪,日本Olympus公司;Uritest2200尿液分析仪,桂林市医疗电子仪器厂;Safire2型微孔板测读仪,瑞士Tecan公司。

SD大鼠,清洁级,雌雄各半,250～350g,上海西

(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、总蛋白质(TP)、白蛋白(Alb)、总胆

固醇(TC)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)、尿酸(UA)、血钾(K+)、血钠(Na+)、血氯(Cl-)以及乳酸脱氢酶(LDH)。

2.5　尿液常规和尿液生化学检查

普尔2必凯实验动物有限公司,动物合格证号:医动

字第0224922号。2　方　法2.1　动物分组及给药方法末次给药后,动物代谢笼单笼饲养收取24h

尿,检测葡萄糖(GLU)、尿胆红素(BIL)、酮体(KET)、pH值、尿胆原(URO)、亚硝酸盐(NIT)、尿隐血(BLO)、比重、白细胞(WBC)以及尿白蛋白(Alb)、乳

β酸脱氢酶(LDH)、2N2乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG),

设3个剂量组:高剂量为30mg/(kg・d)(为给药

14d大鼠的最大耐受量),低剂量为5mg/(kg・d)(为大鼠不产生毒性反应的剂量),中剂量为15mg/(kg・d)(高剂量×低剂量)。

AA2Ⅰ以3mg/mL为高剂量浓度等比稀释,大

并记录尿量。

2.6　病理组织学检查

对肾脏进行肉眼检查,称重,计算脏器系数(脏器重量/体重),并用光镜进行组织学检查。2.7　统计方法

鼠按每100g体重灌胃给予受试药混悬液1mL,

1次/d,连续14d。对照组给予相同体积的0.5%CMC2Na溶液。末次给药后24h,放血处死动物,观察并检测各项指标。2.2　一般检查

计量数据在给药组与对照组间进行Student2t

检验,等级资料以Wilcoxon法检验。3　结　果3.1　一般情况观察高剂量组给药后排稀便、软便,粪便颜色呈深褐色;可见皮毛的清洁度较差,活动减少,精神萎靡;少尿或无尿,尿液颜色呈深黄色;体重与对照组相比明显减轻。中剂量组症状与高剂量组相似,但程度稍轻,尿量有所增加,体重增长缓慢。低剂量组未见明显异常。3.2　对大鼠血液学指标的影响

结果见表1。给药2周后,高、中剂量组PLT、NE显著升高,RBC、HCT、LY、Mon则显著降低,中剂量组指标变化程度低于高剂量组,其它指标与对照组相比无显著差异。低剂量所检各项指标与对照组相比均无显著差异。

每天观察动物的一般状况:如精神状态、反应、行为活动、排便情况、眼睛及孔道分泌物、毛色及清洁度等。体重变化情况每隔1d测定1次。2.3　血液学检查给药结束后分别检测下列指标:白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)、红细胞压积(HCT)、血小板计数(PLT)、中性粒细胞相对计数(NE)、淋巴细胞相对计数(LY)、单核细胞相对计数(Mon)。2.4　血液生化指标检查

给药结束后分别检测下列指标:丙氨酸转氨酶

表1　AA2Ⅰ连续ig给药2周对大鼠血液细胞学指标的影响(n=10,x±s)

Tab1　EffectofAA2Ⅰonbloodcellwithsuccessiveadministrationfortwoweeks(n=10,x±s)

(×109/L)对照组　14.03±3.13高剂量组12.28±3.29中剂量组12.73±3.12低剂量组13.40±2.22

WBC/

RBC/(×1012/L)

9.08±0.528.10±0.8618.40±0.7738.94±0.47

PLT/(×109/L)

710.57±87.79812.63±65.703780.60±54.063724.10±42.04

组别HGB/(g/L)172.00±9.40

178.13±17.90172.50±13.84173.70±10.23

HCT/%0.46±0.02

0.40±0.0420.42±0.0310.45±0.03

NE/%12.44±2.90

59.58±10.68244.50±5.84214.67±2.61

LY/%75.23±4.87

36.34±8.95247.12±4.54272.46±6.19

Mon/%12.33±2.69

4.09±2.3328.38±2.81112.87±5.58

　　与对照组比较:1P<0.01,2P<0.001,3P<0.05　　vscontrol:1P<0.01,2P<0.001,3P<0.05

3.3　对大鼠血液生化指标的影响

结果见表2。给药2周后,高、中剂量组GLU、

BUN、Crea均显著高于对照组,血清LDH亦显著高

于对照组,而TP、Alb、TC、K+、Na+均显著低于对照

组。中剂量组的指标变化程度较高剂量组轻,其TC、Na+值已恢复正常。高、中、低剂量组的其它所

338中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2006年第27卷第6期

检指标与对照组相比均无显著差异。

表2　AA2Ⅰ连续ig给药2周对大鼠血液生化指标的影响(n=10,x±s)

Tab2　EffectofAA2Ⅰonbloodbiochemicalindicatorwithsuccessiveadministrationfortwoweeks(n=10,x±s)

组　别

对照组　高剂量组中剂量组低剂量组组　别对照组　高剂量组中剂量组低剂量组组　别对照组　高剂量组中剂量组低剂量组

ALT/(U/L)63.29±9.6678.29±23.8767.29±11.9762.57±8.52Alb/(g/L)21.29±1.2511.86±1.21116.00±2.58119.00±2.83AST/(U/L)127.71±19.33183.57±72.26147.14±18.04133.29±10.40TC/(mmol/L)1.56±0.221.20±0.2921.60±0.271.55±0.32K+/(mmol/L)7.24±0.654.96±1.20

1

ALP/(U/L)211.00±60.66162.00±75.82200.00±41.74208.57±19.93GLU/(mmol/L)6.74±0.8324.97±5.35114.60±3.0137.26±1.05Na+/(mmol/L)144.90±3.59138.86±4.26

2

μTBIL/(mol/L)

5.05±1.794.74±1.665.10±1.124.99±0.57BUN/(mmol/L)3.91±0.5814.54±4.3017.40±2.2024.33±1.00Cl-/(mmol/L)107.79±3.85107.99±4.75107.91±4.85108.40±3.44

TP/(g/L)63.71±2.4338.86±4.56154.86±6.87360.14±6.26

μCrea/(mol/L)

54.00±6.38101.67±43.76276.71±14.91358.00±8.74LDH/(U/L)4563.94±237.046655.02±1095.9915610.48±902.3135064.63±827.37

μUA/(mol/L)153.43±23.04153.86±48.81148.57±23.82150.86±13.66

5.88±0.7437.15±1.21

140.53±5.90147.03±10.39

　　　　　　与对照组比较:1P<0.001,2P<0.05,3P<0.01

　　　　vscontrol:1P<0.001,2P<0.05,3P<0.01

3.4　对大鼠尿液的影响

现,人们对AA的毒性越发地关注。现有研究资料表明,其毒性机制主要是导致肾小管上皮细胞的变性、坏死和凋亡,加速肾间质纤维化进程等[5]。

肾脏的主要功能是生成和排泄尿,从而调节内环境的酸、碱和水、电解质平衡。少尿和无尿为极严重的症状,各种肾实质疾病都可致尿量减少,包括肾小球、肾小管、肾实质及肾血管的病变,此外,尿白细胞明显增多也提示泌尿系统出现了炎症,并引起PLT和NE继发性增多。病理组织学检查显示肾脏

尿常规结果表明,高、中剂量组蛋白质、BIL显

著增加,中剂量组升高程度低于高剂量组;BLO、WBC随剂量升高而升高,这些变化应与肾小球的滤过率增加和肾小管重吸收功能障碍有关。其余各项指标与对照组相比均无显著差异。尿生化指标结果表明,高、中剂量组Alb、LDH、NAG都显著升高,其它指标与对照组相比均无显著差异。此外,高剂量组尿量显著减少,个别动物甚至出现无尿,中剂量组尿量亦低于对照组,低剂量组尿量正常。3.5　尸检和病理组织学检查高剂量组动物的肾脏经肉眼观察可见有明显的瘀血、肿大,脏器系数显著高于对照组,中剂量组肾脏病变程度相对稍轻,脏器系数亦显著高于对照组,低剂量组脏器系数与对照组相比无显著性差异。组织学检查表明,高剂量组肾小球内可见红细胞堵塞,系膜细胞增生较明显,近曲小管上皮细胞变性较严重,较多上皮细胞脱落于管腔内,间质内可见较大面积的淤血、出血,中剂量组病变程度稍轻,低剂量组肾脏未见上述病理改变。4　讨　论

AA是关木通、广防己、马兜铃等10余种马兜铃

近曲小管上皮细胞变性严重,并有较多上皮细胞脱落于管腔内,提示肾小管出现病变,这一结果与文献报道一致,但本文未观察到肾小管有坏死,这可能与给药时间相对较短有关。肾小管上皮细胞受损后,出现重吸收障碍,导致血钠、血钾浓度显著降低,有文献报道AA可引起低血钾性瘫痪[6]。

血清Cr升高,提示有严重肾小球损害,血清BUN升高可见于较严重肾小球滤过功能损害,本实

验中Cr和BUN均显著升高,说明AA2Ⅰ除可引起肾小管损伤外,还可损害肾小球,使肾小球滤膜通透性增加,红细胞滤出,导致血液中红细胞数减少、HCT

降低,尿中出现隐血。而Alb(肾小球功能障碍敏感指标)作为血浆中主要蛋白质,接近肾小球滤膜的孔径屏障,虽部分可经肾小球滤过,但几乎全部被近端肾小管重吸收,AA2Ⅰ造成肾小球滤过屏障损伤后,大量Alb滤出,同时病变的近曲小管对Alb的重吸

科马兜铃属植物中的一类菲类化合物,主要由AA2A

(Ⅰ)、B、C、D、E等及其衍生物组成。近年来随着因服用含有AA的植物药而导致肾损害的报道不断出

中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2006年第27卷第6期339

收又大为减少,从而导致了重度蛋白尿的出现。Alb的丢失,进一步引起血清Alb和TP的严重下降,可导致氨基酸代谢紊乱。肾小球疾病中,蛋白尿与肾小管间质病变之间的关系已被公认,蛋白尿可以刺激肾小管细胞产生某些炎症因子和血管活性物质,如内皮素21、单核细胞趋化蛋白21等,引发了肾小管间质的炎症作用和纤维化过程[7]。

本实验还检测了2个反映肾脏损害的敏感指标乳酸脱氢酶(LDH)和β2N2乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)。LDH在肾脏中含量丰富,LDH酶活力升高即为急慢性肾小球炎的1个指标。本实验中,血清和尿液中的LDH都异常升高(P<0.01),从另1个方面说明了AA2Ⅰ确实对肾小球也有损害。NAG是1种存在于泌尿系统的溶酶体酶,正常情况下肾小管上皮细胞以胞吐形式向尿液中分泌少量的NAG酶,尿液中含量极微。当肾小管细胞受损时,NAG酶大量从肾小管上皮细胞释放,使尿液中的NAG酶显著增加,尿NAG酶[8]作为肾小管间质损伤的标记物已广泛应用于临床,可同时反映肾小管功能状态和形态损伤。AA2Ⅰ引起大鼠尿NAG酶的异常升高,高度提示肾小管功能下降,有肾小管间质的形态学改变[9]。

综上分析,AA2Ⅰ主要毒性器官在肾脏,除损伤肾小管外,对肾小球也能造成严重损害,同时可引起其他一些全身性毒性反应。AA2Ⅰ导致血糖含量显著升高,胆红素代谢异常,出现胆红素尿,这些毒性

机制还有待进一步研究。此外,AA2Ⅰ连续ig给药

2周后,存在一定的量毒关系,30mg/kg剂量下出现了严重的毒性反应,15mg/kg剂量下也出现了明显的毒性反应,而5mg/kg剂量下各项指标未见有明显异常,故可以认为在本试验条件下,中毒剂量为15mg/kg,安全剂量为5mg/kg。

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