植物异黄酮合酶及其基因的研究进展

作者：张必弦，朱延明，来永才，等 来源：《湖北农业科学》 2013年第2期

张必弦１，２a，朱延明１，来永才２a，2b，胡小梅１，李 炜2b，李 琬2b，毕影东2b，肖佳磊2b，张俐俐2c

（１．东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 １５００３０；２．黑龙江省农业科学院，a.博士后工作站；

b．耕作栽培研究所；c．生物技术研究所，哈尔滨 １５００８６）

摘要：异黄酮合酶（ＩＦＳ）具有催化黄烷酮的活性，同时也是异黄酮生物合成代谢途径中的关键酶。详细阐述了植物异黄酮合酶及其基因的研究进展。

关键词：异黄酮合酶（ＩＦＳ）；异黄酮合酶基因；植物

中图分类号：Ｑ９４６

文献标识码：Ａ

文章编号：0439－８114（２０13）02－0258-04

Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ （ＩＦＳ） ａｎｄ Iｔｓ Ｇｅｎｅ

ＺＨＡＮＧ Ｂｉ－ｘｉａｎ１，２a，ＺＨＵ Ｙａｎ－ｍｉｎｇ１，ＬＡＩ Ｙｏｎｇ－ｃａｉ2a，2b，ＨＵ Ｘｉａｏ－ｍｅｉ１，ＬＩ Ｗｅｉ2b，ＬＩ Ｗａｎ2b，ＢＩ Ｙｉｎｇ－ｄｏｎｇ2b，

ＸＩＡＯ Ｊｉａ－ｌｅｉ2b，ＺＨＡＮＧ Ｌｉ－ｌｉ2c

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００３０，Ｃｈｉｎａ； ２. Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，

a．Ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ；b．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｉｌｌａｇｅ ａｎｄ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ； c．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００８６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＩＦＳ） ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｈａｄ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ， ｂｕｔ ａｌｓｏ ｗａｓ ｔｈｅ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． Ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｇｅｎｅ was ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ ｄｅｔａｉｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： iｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＩＦＳ）； ＩＦＳ ｇｅｎｅ； ｐｌａｎｔ

异黄酮是由类黄酮生物合成代谢途径的中间产物黄烷酮在特定酶的作用下合成的，而催化黄烷酮进入异黄酮合成代谢途径的第一个反应的酶就是异黄酮合酶（Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＩＦＳ），同时也是异黄酮生物合成代谢途径的关键酶［１］。

１ 异黄酮合酶的研究进展

２０世纪６０年代，科学家应用放射性标记前体技术已经发现异黄酮的生物合成的实质是黄烷酮Ｂ环移位重排现象造成的。此反应具有一定的立体专一性，一般只有（２Ｓ）－黄烷酮才可生成异黄酮，其直接的作用前体是甘草素（Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ，７，４′—二羟基黄烷酮）和柚皮素（Ｎａｒｉｎｇｅｉｎ，５，７，４′—三羟基黄烷酮），产物是大豆苷元（Ｄａｉｄｚｅｉｎ，７，４′—二羟基异黄酮）或染料木素（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ，５，７，４′—三羟基异黄酮）［２］。ＩＦＳ催化此反应，但是在细胞中含量较低，且不稳定，１９８４年首次在大豆悬浮培养细胞微粒体中检测出ＩＦＳ可催化黄烷酮Ｂ环从Ｃ２位移位到Ｃ３位且有反应活性的现象，而酶反应主要依赖Ｏ２和ＮＡＤＰＨ，但真菌激发子（Ｅｌｉｃｉｔｏｒ）处理样品后其活性可提升７～１０倍［２］。之后，Ｋｏｃｈｓ等［３］和Ｈａｓｈｉｍ等［４］的研究发现，在大豆和三裂葛悬浮细胞微粒体中黄烷酮生成异黄酮进行了两步反应。第一步反应是在ＮＡＤＰＨ和Ｏ２的参与下，ＩＦＳ催化甘草素或柚皮素的Ｂ环移位生成２－羟基异黄酮；第二步反应是由异黄酮２－脱水酶催化脱水或２－羟基异黄酮自发生成大豆苷元或染料木素［５］，研究发现第一步反应中酶的活性可完全被不同的细胞色素Ｐ４５０蛋白抑制剂而抑制，ＮＡＤＰＨ：Ｐ４５０还原酶的体外重组体系和Ｐ４５０可将甘草素转化为２－羟基异黄酮［６］，表明ＩＦＳ是一种依赖于Ｐ４５０的单氧酶。现今，有两种关于ＩＦＳ可催化黄烷酮Ｂ环移位重排反应机制的解说，一种是黄烷酮１，２重排机制［４］，认为反应首先是在Ｃ３位发生脱氢现象，之后发生１，２重排，Ｂ环才从Ｃ２位迁移到Ｃ３位，而Ｃ２位羟基化生成了２－羟基异黄酮；另一种是离子机制［７］，认为Ｂ环的移位重排现象是通过形成烯醇式环氧化物而进行的。由于此离子机制涉及黄烷酮４′－羟基的去质子化和烯醇式环氧化物过渡分子４′－羟基的重新质子化两个反应，其疑问较大，因为更多的人倾向于第一种解说，但是反应的立体专一性有待进一步阐明。

近几年，ＩＦＳ基因已被克隆，并在酵母中成功表达，从而实现了ＩＦＳ酶蛋白简单纯化，为进一步深入分析ＩＦＳ所参与的反应及其作用机理奠定基础［８］。Ｋｉｍ等［９］在酵母中表达了白三叶草ＩＦＳ，并催化不同，研究表明酶活性是依赖Ｃ２和Ｃ３的饱和键，而Ｃ３不被羟基化和Ｃ７－ＯＨ存在是进行酶反应的两个必需的条件。通过已知的Ｐ４５０蛋白Ｘ衍射结构信息分析发现，组成Ｐ４５０蛋白活性中心是高度保守α－螺旋和β－折叠的结构，借助计算机生物信息学方法模拟结构，Ｓａｗａｄａ等［８］对在酵母中表达的甘草ＩＦＳ进行了定点突变研究，结果表明酶蛋白活性中心的α－螺旋上的Ｓｅｒ３１０和β－折叠上的Ｌｙｓ３７５是酶活性所必需的结构， 黄烷酮Ｃ７－ＯＨ和Ｌｙｓ的ε－ＮＨ４＋反应锚定了底物，确保了黄烷酮生成异黄酮过程中Ｂ环的迁移，如果Ｌｙｓ突变为Ｔｈｒ，则失去活性，而Ｓｅｒ为Ｂ环从Ｃ２到Ｃ３的迁移提供了空间保证，测定出ＩＦＳ反应的最适ｐＨ为７～８，Kｍ约为８ μｍｏｌ／Ｌ。

２ 异黄酮合酶基因的研究进展

２．１ ＩＦＳ基因序列的研究

１９９７年，Ａｋａｓｈｉ等［１０］利用Ｐ４５０的保守序列的特性，首先采用ＰＣＲ方法从甘草的培养细胞中克隆出８个Ｐ４５０的ｃＤＮＡ片段（Ｇｅ－１到Ｇｅ－８）。之后对Ｇｅ－５全长ｃＤＮＡ的阳性克隆的研究表明，Ｇｅ－５可编码（２Ｓ）－黄烷酮－２－羟基化酶（Ｆ２Ｈ）［１１］。由于研究发现Ｆ２Ｈ和ＩＦＳ是作用同一黄烷酮底物且进行不同

分支代谢合成途径的２个酶，同时也发现了细胞微粒体膜上同时具有Ｆ２Ｈ和ＩＦＳ活性，Ａｋａｓｈｉ等［12］推测Ｆ２Ｈ和ＩＦＳ可属于同一Ｐ４５０家族。因为甘草Ｇｅ－５和Ｇｅ－８同属于ＣＹＰ９３家族，所以用Ｇｅ－８作为探针从已诱导了６～１２ ｈ的甘草细胞ｃＤＮＡ文库中克隆出了Ｇｅ－８全长ｃＤＮＡ （ＣＹＰ９３Ｃ２，ＡＢ０２３６３６），并在酵母中成功表达，试验证明了ＣＹＰ９３Ｃ２编码蛋白可催化柚皮素或甘草素生成染料木素或大豆苷元，同时发现ＣＹＰ９３Ｃ２蛋白是ＩＦＳ，同时Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹法表明了在甘草培养细胞中经ＹＥ诱导６ ｈ后ＩＦＳ基因表达水平达到最高峰，并检测到异黄酮的含量也随之开始增加直至１２ ｈ达到最高峰。利用ＰＣＲ技术，Ｋｉｍ等［９］克隆到白三叶草ＩＦＳ全长ｃＤＮＡ（ＡＹ２５３２８４）， Ｓｈｉｍａｄａ等［１３］克隆到百脉根的ＩＦＳ全长ｃＤＮＡ（ＬｊＣＹＰ－１，ＡＢ０２４９３１）。

与此同时，Ｓｔａｅｌｅ等［１４］利用功能基因组学的研究方法，根据Ｐ４５０的保守序列特性，在真菌诱导下的大豆下胚轴ＥＳＴ文库中筛选出１条序列，研究发现该序列属于ＣＹＰ９３家族的序列，并克隆出全长ｃＤＮＡ（ＣＹＰ９３ＣｌｖＺ，ＡＦ１３５４８４），序列分析发现ＣＹＰ９３ＣｌｖＺ与大豆ＣＹＰ９３ＣＩ基本相同，在ＯＲＦ中仅有３个氨基酸序列差异。将ＣＹＰ９３ＣｌｖＺ转入到昆虫细胞进行表达分析，分离出ＮＡＤＰＨ、甘草甜素与微粒体一起孵育，通过ＨＰＬＣ、ＧＣ－ＭＳ验证有２－羟基异黄酮生成，充分证实ＣＹＰ９３ＣｌｖＺ编码的蛋白是ＩＦＳ。２0世纪末，美国杜邦公司利用ＥＳＴ筛选技术，从诱导的栽培大豆叶片ｃＤＮＡ文库中克隆出了ＩＦＳ全长ｃＤＮＡ（ＡＦ１９５７９８），并以此ｃＤＮＡ序列设计引物，通过ＲＴ－ＰＣＲ技术分别从紫花首蓓（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ，ＡＦｌ９５８００，ＡＦ１９５８０１，ＡＦ１９５８０２）、毛苔子（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａ，ＡＦ１９５８０３）、小扁豆（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｙｓ，ＡＦ１９５８０４，ＡＦ１９５８０５）、绿豆（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ ，ＡＦ１９５８０６，ＡＦ１９５８０７，ＡＦ１９５８０８，ＡＦ１９５８０９）、红三叶草（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｐａｔｅｎｓｅ，ＡＦ１９５８１０，ＡＦ１９５８１１）、雪豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｍ，ＡＦ１９５８１２）、羽扇豆（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ，ＡＦ１９５８１３）、白三叶草（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｒｅｐｅｎｓ，ＡＦ１９５８１４，ＡＦ１９５８１５）等９种植物中克隆出ＩＦＳ全长ｃＤＮＡ［１５］。２００５年Ｃｏｏｐｅｒ等［１６］从昆虫诱导子处理后的雪豆的豆荚中克隆出了ＩＦＳ基因（ＣＹＰ９３Ｃ１８），Ｋｉｍ等［１７］比较分析了１８个不同类型的大豆栽培品种的ＩＦＳ基因结构。同年，罗建平等［１８］也从高含量合成异黄酮的豆科植物怀槐（Ｍａａｃｋｉａａｍｕｒｅｎｓｉｓ）中克隆出ＩＦＳ的ｃＤＮＡ片段，长度８００ ｂｐ，又进行了全长ｃＤＮＡ的克隆。

目前，根据已经克隆出的１５种豆科植物中ＩＦＳ的ｃＤＮＡ序列和功能分析（ｈｔｔｐｌ／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｄｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ），ＩＦＳ基因的拷贝数为１～３个［１３，１５］，编码区中含有１３５～２１８ ｂｐ的内含子［１５，１９］，不同植物中的该基因全长ｃＤＮＡ序列高度保守，在４００～６００ ｂｐ和８００～

１ ２００ ｂｐ两个区段完全相同，而由ｃＤＮＡ推测的蛋白氨分子质量约为５９ ｋu，ｐＩ约为８．９５，氨基酸序列的同源性在９２％～９７％之间［１５］。研究发现，所有异源表达的ＩＦＳ都具有催化合成异黄酮的功能，但来源不同的ＩＦＳ催化柚皮素或甘草素生成染料木素或大豆苷元的能力有所差异。２００４年，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ等［１９］分析了栽培大豆ＩＦＳ基因的启动子结构，发现在

－１２５ ｂｐ和－２６４ ｂｐ处存在ＴＡＴＡＢｏｘ和ＣＡＡＴＢｏｘ，而抑制子和增强子分别是在－５３７ ｂｐ和－８８７ｂｐ处，同时具有决定该基因在种子中特异表达的激发子响应序列ＥＩＲＥ（－５６５ ｂｐ）和ＳＥＦ４结合域（－６６５ ｂｐ），在非豆科的双子叶和单子叶植物中ＩＦＳ基因启动子可启动ＧＵＳ等基因的正常表达，具有组织专一性，并受茉莉酸甲酯、水杨酸、ＵＶ、固氮菌等因素的诱导。

２．２ ＩＦＳ基因表达调控的研究

ＩＦＳ基因结构的研究及其克隆为利用分子生物学手段修饰豆科植物异黄酮合成代谢途径和使非豆科植物能够合成适量的异黄酮奠定了研究的理论基础。２０００年，美国杜邦公司首次把栽培大豆的ＩＦＳ基因转入到自身不能合成异黄酮的模式植物拟南芥中，并在转基因阳性植株的茎和叶片中检测到ＩＦＳ基因表达的ｍＲＮＡ，而染料木素含量可达２ μｇ／ｇ［１５］。因为在所有的植物中都有合成异黄酮所需的底物柚皮素和甘草素，同时它们是类苯丙烷合成代谢途径的中间产物，所以转基因植株中的异源ＩＦＳ同样利用这些物质作为底物合成异黄酮。

由于转基因植株中合成的异黄酮含量较低，进一步深入研究分析用转栽培大豆ＩＦＳ基因的烟草、拟南芥和玉米细胞系对影响合成异黄酮含量高低的因子。在转基因烟草中，通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ、Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹和微粒体酶活性体外试验检测，结果都表明在叶片和花中都有ＩＦＳ基因的表达产物，但只有在花中可检测出染料木素的积累，而叶片中无异黄酮的合成［２０］。研究发现烟草花中花青苷（Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ）的含量是叶片的１３０多倍，表明不是异源表达的ＩＦＳ活性自身限制了染料木素的合成，而是底物的获得应该是转基因植株能否促使异黄酮合成的制约因素，这是因为烟草花中花青素合成代谢途径中组织特异性的激活，可使已表达的ＩＦＳ竞争代谢中间物柚皮素从而合成染料木素成为一种可能。在转基因拟南芥中，研究发现ＵＶ可增强类苯丙烷途径中合成花青苷且同时合成异黄酮的能力，同样证明了上述结论的正确性［２０］。在转基因玉米的悬浮细胞中，也发现并证实转基因植物中ＩＦＳ可依赖增强以提供中间代谢物或类苯丙烷途径的激活从而有效合成异黄酮。

由于玉米细胞中缺乏转录因子Ｒ（ｍｙｃ－ｔｙｐｅ） 和Ｃ１（ｍｙｂ－ｔｙｐｅ）而不能合成花青苷，当在Ｃ１的ＤＮＡ激活区和结合区之间插入Ｒ构成融合转录因子ＣＲＣ后，再将其转入到不能合成异黄酮的转ＩＦＳ基因玉米细胞中，该转基因细胞不仅可合成花青苷，而且还可合成异黄酮［１６，２０］。而提高转基因植株合成较高含量异黄酮的另一个策略是切断与ＩＦＳ竞争共同底物的分支途径。二羟基黄酮醇还原酶（ＤＦＲ） 和黄烷酮－３－羟化酶（Ｆ３Ｈ）是与ＩＦＳ竞争相同底物柚皮素分别合成黄烷醇和花青苷的分支酶。Ｌｉｕ等［２１］将栽培大豆的ＩＦＳ基因转入到拟南芥ＤＦＲ和Ｆ３Ｈ的双突变体ｔｔ３／ｔｔ６中，因为２个分支途径被阻断，所以转基因植株中染料木素含量可提高５～３０倍。Ｙｕ等［２２］对栽培大豆ＤＦＲ的活性进行了抑制，同样也获得相似的促进效果。

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［２０］ ＹＵ Ｏ， ＪＵＮＧ Ｗ， ＳＨＩ Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ ｇｅｎｉａｔｅｉｎ ａｎｄ ｄａｉｄｚｅｉｎ ｉｎ ｎｏｎ－ｌｅｇｕｍｅ ｄｉｃｏｔ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｏｔ ｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，１２４（２）：７８１－７９３．

［２１］ ＬＩＵ Ｃ Ｊ，ＢＬＯＵＮＴ Ｊ Ｗ，ＳＴＥＥＬＳ Ｃ Ｌ， ｅｔ ａｌ．Ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋｓ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｉｓｏｆｌ

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［２２］ ＹＵ Ｏ，ＳＨＩ Ｊ，ＨＥＳＳＩＯＮ Ａ Ｏ， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｓｅｅｄ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｅｔｒｙ，２００３，６３（７）：７５３－７６３．