细胞荧光原位杂交方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 107312838 A(43)申请公布日 2017.11.03

(21)申请号 201710510841.0(22)申请日 2017.06.28

(71)申请人 广西大学

地址 530004 广西壮族自治区南宁市西乡

塘区大学路100号(72)发明人 张明　赵秀玲　左二伟　濮黎萍　

张鹏飞　陈富美　候振　徐壮壮　(74)专利代理机构 广西南宁公平知识产权代理

有限公司 45104

代理人 杨立华(51)Int.Cl.

C12Q 1/68(2006.01)

权利要求书1页 说明书7页 附图2页

()发明名称

细胞荧光原位杂交方法(57)摘要

本发明公开了一种细胞荧光原位杂交方法，包括预处理和杂交，预处理采用75％的低渗液进行低渗处理；杂交之前进行鱼精DNA的预杂交试验，预杂交时间为1-2h。实际使用表明，该法能够得到更为清晰、直观、准确的染色结果，实现了快速有效地对小鼠ES细胞进行荧光原位杂交，也适用于人iPS细胞染色体核型判断，和人21三体综合征的细胞核型进行分析，同时也为其他种类的细胞进行FISH染色提供了一种参考。因此，应用本发明在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子，为染色体或者基因完整性分析奠定了重要基础。

CN 107312838 ACN 107312838 A

权　利　要　求　书

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1.一种细胞荧光原位杂交方法，包括预处理和杂交，其特征在于：所述预处理采用75％的低渗液进行低渗处理；所述杂交之前进行鱼精DNA的预杂交试验，预杂交时间为1-2h。

2.根据权利要求1所述的细胞荧光原位杂交方法，其特征在于：所述杂交中加入探针后的杂交液置于75℃水浴变性10min，变性好的杂交液37℃孵育12-16h。

3.根据权利要求1所述的细胞荧光原位杂交方法，其特征在于：所述细胞为小鼠ES细胞、人HT29细胞、人iPS细胞。

4.根据权利要求1所述的细胞荧光原位杂交方法，其特征在于所述预处理包括以下操作：将体外培养的细胞用胰酶消化，1000r水平离心5min弃上层培养基，将所获得的细胞用75％的0.075％KCL的低渗液进行低渗处理；将进行过低渗处理的细胞用固定液进行两次固定；固定后的细胞，1000r水平离心4.5min，弃上清，轻轻弹起细胞涂到防脱载玻片上；将涂好的细胞片置于37℃过夜老化。

5.根据权利要求1所述的细胞荧光原位杂交方法，其特征在于所述预杂交包括以下操作：将老化过夜的细胞常温70％、95％、100％的梯度酒精脱水，自然晾干；将晾干的玻片置于75℃的变性液中进行变性10min，然后立即置于-20℃预冷的70％、95％、100％的梯度酒精中3min、1min、1min，自然晾干；将预杂交液鱼精DNA置于75℃水浴变性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min左右；将变性好的预杂交液按每张玻片10μL左右滴加到变性好的玻片上，37℃孵育1h。

6.根据权利要求1所述的细胞荧光原位杂交方法，其特征在于所述杂交包括以下操作：将预杂交后的玻片分别置于常温放置的70％、95％、100％的梯度酒精中漂洗各5min，自然晾干；将配置好的探针置于75℃水浴变性探针10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min左右；将探针按比例加入杂交液中，按照每张玻片滴加10μL左右的杂交液37℃孵育12-16h。

7.根据权利要求1所述的细胞荧光原位杂交方法，其特征在于还有杂交后漂洗和染色步骤。

8.根据权利要求7所述的细胞荧光原位杂交方法，其特征在于所述杂交后漂洗和染色包括以下操作：将杂交后的玻片置于50％的甲酰胺45℃洗涤2*5min，2XSSC，45℃洗涤玻片2*5min，自然晾干；将晾干的玻片用Hoechst-Antifade置于暗处染色10min左右，盖上盖玻片，指甲油封片，荧光显微镜观察。

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说　明　书细胞荧光原位杂交方法

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技术领域

[0001]本发明属于原位杂交技术领域，尤其涉及一种细胞荧光原位杂交方法。

背景技术

[0002]荧光原位杂交技术始于20世纪60年代末，是利用碱基互补配对的原则在染色体、间期细胞核和DNA纤维上进行DNA序列定位的一种有效手段，能对恶性肿瘤、神经呆滞及畸形病症中发生的部分染色体微小的畸变进行识别并进行定位。尽管传统的分子遗传学已经有了很大的进步，但是检查这些染色体和基因变化还是受到。染色体光谱虽然是全面分析这些情况的一个有效工具，但由于其样品制备的难度以及识别平衡的主观性太大等缺点，因而仍有一定的局限性。随着荧光原位杂交技术的不断改进和提高，其检测分辨率和灵敏性都得到了显著提高，目前，原位杂交技术广泛应用在基因物理定位、染色体识别、物理图谱的构建、亲缘关系研究和转基因检测等方面，在现代分子细胞遗传学领域有着举足轻重的作用。

[0003]胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ES细胞)是具有全向分化和无限增殖能力的一群细胞，一般是从囊胚的内胚团(ICM)或原始生殖细胞中分离培养而来。自从1981年首次从小鼠的囊胚中分离出可以连续培养的ES细胞以来，ES细胞的研究与应用得到很大的关注，在细胞生物学、遗传学、发育生物学、医学和神经生物学等领域的研究过程中也发挥越来越大的作用。采用荧光原位杂交的方法可以更清晰对特定染色体的差异分析，基因位点的碱基差异可更加清晰、简洁、直观的呈现出来。因此，摸索针对ES细胞有效的FISH方案对于ES细胞的分子遗传学方面的研究有重要意义。

发明内容

[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种染色结果更清晰、直观、准确的细胞荧光原位杂交方法。

[0005]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：细胞荧光原位杂交方法，包括预处理和杂交，预处理采用75％的低渗液进行低渗处理；杂交之前进行鱼精DNA的预杂交试验，预杂交时间为1-2h。[0006]杂交中加入探针后的杂交液置于75℃水浴变性10min，变性好的杂交液37℃孵育12-16h。

[0007]细胞为小鼠ES细胞、人HT29细胞、人iPS细胞。[0008]预处理包括以下操作：将体外培养的细胞用胰酶消化，1000r水平离心5min弃上层培养基，将所获得的细胞用75％的0.075％KCL的低渗液(即75％的0.075％KCL，25％的PBS，)进行低渗处理；将进行过低渗处理的细胞用固定液进行两次固定；固定后的细胞，1000r水平离心4.5min，弃上清，轻轻弹起细胞涂到防脱载玻片上；将涂好的细胞片置于37℃过夜老化。

[0009]预杂交包括以下操作：将老化过夜的细胞常温70％、95％、100％的梯度酒精脱水，

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自然晾干；将晾干的玻片置于75℃的变性液中进行变性10min，然后立即置于-20℃预冷的70％、95％、100％的梯度酒精中3min、1min、1min，自然晾干；将预杂交液鱼精DNA置于75℃水浴变性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min左右；将变性好的预杂交液按每张玻片10μL左右滴加到变性好的玻片上，37℃孵育1h。[0010]杂交包括以下操作：将预杂交后的玻片分别置于常温放置的70％、95％、100％的梯度酒精中漂洗各5min，自然晾干；将配置好的探针置于75℃水浴变性探针10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min左右；将探针按比例加入杂交液中，按照每张玻片滴加10μL左右的杂交液37℃孵育12-16h。

[0011]上述细胞荧光原位杂交方法还有杂交后漂洗和染色步骤。[0012]杂交后漂洗和染色包括以下操作：将杂交后的玻片置于50％的甲酰胺(即50％的甲酰胺，50％的2xSSC)45℃洗涤2*5min，2XSSC(即稀释20xSSC得2xSSC，20xSSC配制：在800ml水中溶解175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/LNaOH溶解调节PH值至7.0，加水定容至1L)，45℃洗涤玻片2*5min，自然晾干；将晾干的玻片用Hoechst-Antifade置于暗处染色10min左右，盖上盖玻片，指甲油封片，荧光显微镜观察。[0013]针对现有荧光原位杂交技术存在的问题，发明人建立了一种细胞荧光原位杂交方法，包括预处理和杂交，预处理采用75％的低渗液进行低渗处理；杂交之前进行鱼精DNA的预杂交试验，预杂交时间为1-2h。实际使用表明，该法能够得到更为清晰、直观、准确的染色结果，实现了快速有效地对小鼠ES细胞进行荧光原位杂交，也适用于人iPS细胞染色体核型判断，和人21三体综合征的细胞核型进行分析，同时也为其他种类的细胞进行FISH染色提供了一种参考。因此，应用本发明在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子，为染色体或者基因完整性分析奠定了重要基础。

[0014]与传统的荧光原位杂交技术相比，本发明具有以下突出特点和优势：[0015]<1>通过75％的低渗液对细胞进行低渗处理，使细胞吸水膨胀，后期染色时，细胞处于一个层面，可以得到较为完整、清晰地染色结果。

[0016]<2>优选了75℃*10min作为玻片和探针变性的时间，12-16h为探针孵育时间，精确控制时间和温度对于细胞中DNA的完全变性和对探针中DNA的完全变性起到了很好的作用。[0017]<3>在探针杂交之前进行了一个鱼精DNA的预杂交试验，通过预杂交封闭了一些非特异性位点，降低了染色过程中的非特异性染色，降低了噪点，可以获得较为准确的染色结果，这一发现也为其他相关染色的相关实验提供一种借鉴。附图说明

[0018]图1是小鼠ES细胞未进行低渗处理X染色体红色点探针FISH染色的示意图(100 X)，图中：a Hoechst染色，b X染色体红色荧光标记点探针染色。

[0019]图2是人的HT29细胞未进行低渗处理21号染色体绿色点探针FISH染色的示意图(100 X)，图中：a Hoechst染色，b人21号染色体绿色荧光标记点探针染色。

[0020]图3是小鼠ES细胞未进行预杂交X染色体红色点探针FISH染色的示意图(100 X)，图中：a Hoechst染色，b小鼠X染色体红色荧光标记点探针染色。

[0021]图4是小鼠ES细胞进行低渗和预杂交处理后X染色体红色点探针FISH染色的示意图(100 X)，图中：a Hoechst染色，b X染色体红色荧光标记点探针染色。

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图5是小鼠ES细胞进行低渗和预杂交处理后XY染色体探针共染FISH染色的示意图

(100 X)，图中：a Hoechst染色，b Y染色体绿色荧光标记全染色体点探针染色，c X染色体红色荧光标记点探针染色。

[0023]图6是人的21三体综合征患者iPS细胞进行低渗和预杂交处理后21号染色体绿色点探针FISH染色的示意图(100 X)，图中：a Hoechst染色，b人21号染色体绿色荧光标记点探针染色。

具体实施方式[0024]实施例1 小鼠ES细胞未进行低渗处理X染色体红色点探针FISH染色方法[0025]首先，将体外无饲养层培养的ES细胞先用0.05％的胰酶进行消化，4500r水平离心10min，去除培养基，用手指轻弹管壁，使细胞重新悬浮，加入甲醇∶冰醋酸＝3∶1的固定液4℃固定1.5h；将固定好的细胞4500r离心10min，根据细胞量的多少弃上清，轻轻弹起管壁，使细胞重悬，将重悬好的细胞铺到防脱载玻片上，并进行标记，将标记好的玻片置于37℃烘箱过夜老化。

[0026]将老化过夜后的细胞常温下置于梯度酒精脱水(70％，95％，100％)，自然晾干，将晾干的玻片置于75℃的变性液(70％甲酰胺，20％水，10％-20XSSC)中进行变性10min，然后立即置于-20℃预冷的70％，95％，100％的梯度酒精中3min，1min，1min，自然晾干；将预杂交液(鱼精DNA)每张玻片大约10μL置于75℃水浴变性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；将变性好的预杂交液每张玻片10μL滴加到玻片上，盖上盖玻片并置于暗盒中，37℃孵育1h；

[0027]将预杂交后的玻片分别置于常温放置的70％，95％，100％的梯度酒精漂洗各5min，自然晾干；同时在避光条件下按照探针配制的比例，在6μL杂交液中加入1μL人的X染色体探针，充分混匀后，把配制好的杂交液置于75℃水浴变性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；将变性好的杂交液每张7μL滴加到玻片上，盖好盖玻片，置于暗盒内，37℃孵育12-16h；

[0028]提前在水浴锅中预热甲酰胺∶2XSSC＝1∶1两缸，2XSSC两缸；将上述过夜杂交后的玻片轻轻揭去盖玻片，然后置于甲酰胺∶2XSSC＝1∶1的漂洗液中洗涤两次各五分钟，2XSSC洗涤玻片两次各五分钟，自然晾干；然后配制Hoechst工作液，并加入等体积的抗荧光淬灭剂，每张玻片大约滴加10μL Hoechst-Antifade到玻片上置于暗处染色10min左右，盖上盖玻片，指甲油封片，荧光显微镜观察拍照。[0029]实施例2 人的HT29细胞未进行低渗处理21号染色体绿色点探针FISH染色方法[0030]首先，将体外培养的人的HT29细胞先用0.05％的胰酶进行消化，将消化好的细胞4500r水平离心10min，去除培养基，用手指轻弹管壁，使细胞重新悬浮，加入甲醇∶冰醋酸＝3∶1的固定液4℃固定1.5h；将固定好的细胞4500r离心10min，根据细胞量的多少弃上清，轻轻弹起管壁，使细胞重悬，将重悬好的细胞铺到防脱载玻片上，并进行标记，将标记好的玻片置于37℃烘箱过夜老化。

[0031]将老化过夜后的细胞常温下置于梯度酒精脱水(70％，95％，100％)，自然晾干，将晾干的玻片置于75℃的变性液(70％甲酰胺，20％水，10％-20XSSC)中进行变性10min，然后立即置于-20℃预冷的70％，95％，100％的梯度酒精中3min，1min，1min，自然晾干；将预杂

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交液(鱼精DNA)每张玻片大约10μL置于75℃水浴变性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；将变性好的预杂交液每张玻片10μL滴加到玻片上，盖上盖玻片并置于暗盒中，37℃孵育1h；

[0032]将预杂交后的玻片分别置于常温放置的70％，95％，100％的梯度酒精漂洗各5min，自然晾干；同时在避光条件下按照探针配制的比例，在6μL杂交液中加入1μL人的7号染色体探针，充分混匀后，把配制好的杂交液置于75℃水浴变性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；将变性好的杂交液每张7μL滴加到玻片上，盖好盖玻片，置于暗盒内，37℃孵育12-16h；

[0033]提前在水浴锅中预热甲酰胺∶2XSSC＝1∶1两缸，2XSSC两缸；将上述杂交后的玻片轻轻揭去盖玻片，然后置于甲酰胺∶2XSSC＝1∶1的漂洗液中洗涤两次各五分钟，2XSSC洗涤玻片两次各五分钟，自然晾干；然后配制Hoechst工作液，并加入等体积的抗荧光淬灭剂，每张玻片大约滴加10μL Hoechst-Antifade到玻片上置于暗处染色10min左右，盖上盖玻片，指甲油封片，荧光显微镜观察拍照。[0034]实施例3 小鼠ES细胞未进行预杂交X染色体红色点探针FISH染色的方法[0035]首先，将体外无饲养层培养的小鼠ES细胞用0.05％的胰酶进行消化，将消化好的细胞1000r水平离心5min，去除培养基，用手指轻弹管壁，使细胞重新悬浮，加入75％的0.075％KCL的低渗液使细胞逐渐吸水膨胀，同时一边旋转离心管，直到细胞悬液看起来完全澄清，然后置于37℃水浴处理10min，加入几滴固定液进行预固定，1000r离心5min；弃去多余上清，轻弹管壁，使细胞重悬，缓缓加入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)一边加一边轻轻转动管壁，直到细胞澄清，4℃放置半小时对细胞进行第一次固定；1000r离心5min，去除上清；轻轻弹起细胞，缓缓加入固定液，一边加一边轻轻转动管壁，直到细胞澄清，对细胞进行第二次固定；1000r离心5min，弃去多余固定液，轻轻弹起管壁，使细胞重悬，将重悬好的细胞铺到防脱载玻片上，并进行标记，将标记好的玻片置于37℃烘箱过夜老化。[0036]将老化过夜后铺有ES细胞的玻片常温下置于梯度酒精脱水(70％，95％，100％)，自然晾干，将晾干的玻片置于75℃变性液(70％甲酰胺，20％水，10％-20XSSC)中变性10min，然后立即置于-20℃预冷的70％，95％，100％的梯度酒精中3min，1min，1min，自然晾干；

[0037]同时在避光条件下按照探针配制的比例，在6μL杂交液中加入1μL的X染色体探针，充分混匀后，把配制好的杂交液置于75℃水浴变性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；将变性好的杂交液每张7μL滴加到玻片上，盖好盖玻片，置于暗盒内，37℃孵育12-16h；

[0038]提前在水浴锅中预热甲酰胺∶2XSSC＝1∶1两缸，2XSSC两缸；将上述杂交后的玻片轻轻揭去盖玻片，然后置于甲酰胺∶2XSSC＝1∶1的漂洗液中洗涤两次各五分钟，2XSSC洗涤玻片两次各五分钟，自然晾干；然后配制Hoechst工作液，并加入等体积的抗荧光淬灭剂，每张玻片大约滴加10μL Hoechst-Antifade到玻片上置于暗处染色10min，盖上盖玻片，指甲油封片，荧光显微镜观察拍照。[0039]实施例4 小鼠ES细胞进行低渗和预杂交处理后X染色体红色点探针FISH染色方法[0040]首先，将体外无饲养层培养的小鼠ES细胞用0.05％的胰酶进行消化，将消化好的细胞1000r水平离心5min，去除培养基，用手指轻弹管壁，使细胞重新悬浮，加入75％的

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0.075％KCL的低渗液使细胞逐渐吸水膨胀，同时一边旋转离心管，直到细胞悬液看起来完全澄清，然后置于37℃水浴处理10min，加入几滴固定液进行预固定，1000r离心5min；弃去多余上清，轻弹管壁，使细胞重悬，缓缓加入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)一边加一边轻轻转动管壁，直到细胞澄清，4℃放置半小时对细胞进行第一次固定；1000r离心5min，去除上清；轻轻弹起细胞，缓缓加入固定液，一边加一边轻轻转动管壁，直到细胞澄清，对细胞进行第二次固定；1000r离心5min，弃去多余固定液，轻轻弹起管壁，使细胞重悬，将重悬好的细胞铺到防脱载玻片上，并进行标记，将标记好的玻片置于37℃烘箱过夜老化。[0041]将老化过夜后铺有ES细胞的玻片常温下置于梯度酒精脱水(70％，95％，100％)，自然晾干，将晾干的玻片置于75℃变性液(70％甲酰胺，20％水，10％-20XSSC)中变性10min，然后立即置于-20℃预冷的70％，95％，100％的梯度酒精中3min，1min，1min，自然晾干；将预杂交液(鱼精DNA)每张玻片大约配制10μL的量，置于75℃水浴变性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；将变性好的预杂交液每张玻片10μL滴加到玻片上，盖上盖玻片并置于暗盒中，37℃孵育1h；

[0042]将预杂交处理后的玻片分别置于常温放置的70％，95％，100％的梯度酒精各5min，自然晾干；同时在避光条件下按照探针配制的比例，在6μL杂交液中加入1μL的X染色体探针，充分混匀后，把配制好的杂交液置于75℃水浴变性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；将变性好的杂交液每张7μL滴加到玻片上，盖好盖玻片，置于暗盒内，37℃孵育12-16h；

[0043]提前在水浴锅中预热甲酰胺∶2XSSC＝1∶1两缸，2XSSC两缸；将上述杂交后的玻片轻轻揭去盖玻片，然后置于甲酰胺∶2XSSC＝1∶1的漂洗液中洗涤两次各五分钟，2XSSC洗涤玻片两次各五分钟，自然晾干；然后配制Hoechst工作液，并加入等体积的抗荧光淬灭剂，每张玻片大约滴加10μL Hoechst-Antifade到玻片上置于暗处染色10min，盖上盖玻片，指甲油封片，荧光显微镜观察拍照。[0044]实施例5 小鼠ES细胞进行低渗和预杂交处理后XY染色体探针共染FISH染色方法[0045]首先，将体外无饲养层培养的小鼠ES细胞用0.05％的胰酶进行消化，将消化好的细胞1000r水平离心5min，去除培养基，用手指轻弹管壁，使细胞重新悬浮，加入75％的0.075％KCL的低渗液使细胞逐渐吸水膨胀，同时一边旋转离心管，直到细胞悬液看起来完全澄清，然后置于37℃水浴处理10min，加入几滴固定液进行预固定，1000r离心5min；弃去多余上清，轻弹管壁，使细胞重悬，缓缓加入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)一边加一边轻轻转动管壁，直到细胞澄清，4℃放置半小时对细胞进行第一次固定；1000r离心5min，去除上清；轻轻弹起细胞，缓缓加入固定液，一边加一边轻轻转动管壁，直到细胞澄清，对细胞进行第二次固定；1000r离心5min，弃去多余固定液，轻轻弹起管壁，使细胞重悬，将重悬好的细胞铺到防脱载玻片上，并进行标记，将标记好的玻片置于37℃烘箱过夜老化。[0046]将老化过夜后铺有ES细胞的玻片常温下置于梯度酒精脱水(70％，95％，100％)，自然晾干，将晾干的玻片置于75℃变性液(70％甲酰胺，20％水，10％-20XSSC)中变性10min，然后立即置于-20℃预冷的70％，95％，100％的梯度酒精中3min，1min，1min，自然晾干；将预杂交液(鱼精DNA)每张玻片大约配制10μL的量置于75℃水浴变性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；将变性好的预杂交液每张玻片10μL滴加到玻片上，盖上盖玻片并置于暗盒中，37℃孵育1h；

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将预杂交处理后的玻片分别置于常温放置的70％，95％，100％的梯度酒精各

5min，自然晾干；同时在避光条件下按照探针配制的比例，在6μL杂交液中加入1μL的X染色体探针和0.1μL的Y染色体探针，充分混匀后，把配制好的杂交液置于75℃水浴变性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；将变性好的杂交液每张7μL滴加到玻片上，盖好盖玻片，置于暗盒内，37℃孵育12-16h；[0048]提前在水浴锅中预热甲酰胺∶2XSSC＝1∶1两缸，2XSSC两缸；将上述杂交后的玻片轻轻揭去盖玻片，然后置于甲酰胺∶2XSSC＝1∶1的漂洗液中洗涤两次各五分钟，2XSSC洗涤玻片两次各五分钟，自然晾干；然后配制Hoechst工作液，并加入等体积的抗荧光淬灭剂，每张玻片大约滴加10μL Hoechst-Antifade到玻片上置于暗处染色10min，盖上盖玻片，指甲油封片，荧光显微镜观察拍照。[0049]实施例6 人的21三体综合征患者iPS细胞进行低渗和预杂交处理后21号染色体绿色点探针FISH染色方法[0050]首先，将体外培养的人的21三体综合征患者iPS细胞用酶进行消化，将消化好的细胞1000r水平离心5min，去除培养基，用手指轻弹管壁，使细胞重新悬浮，加入75％的0.075％KCL的低渗液使细胞逐渐吸水膨胀，同时一边旋转离心管，直到细胞悬液看起来完全澄清，然后置于37℃水浴处理10min，加入几滴固定液进行预固定，1000r离心5min；弃去多余上清，轻弹管壁，使细胞重悬，缓缓加入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)一边加一边轻轻转动管壁，直到细胞澄清，4℃放置半小时对细胞进行第一次固定；1000r离心5min，去除上清；轻轻弹起细胞，缓缓加入固定液，一边加一边轻轻转动管壁，直到细胞澄清，对细胞进行第二次固定；1000r离心5min，弃去多余固定液，轻轻弹起管壁，使细胞重悬，将重悬好的细胞铺到防脱载玻片上，并进行标记，将标记好的玻片置于37℃烘箱过夜老化。

[0051]将老化过夜铺有人的21三体综合征患者iPS细胞的玻片常温下置于梯度酒精脱水(70％，95％，100％)，自然晾干，将晾干的玻片置于75℃变性液(70％甲酰胺，20％水，10％-20XSSC)中变性10min，然后立即置于-20℃预冷的70％，95％，100％的梯度酒精中3min，1min，1min，自然晾干；将预杂交液(鱼精DNA)每张玻片大约配制10μL的量置于75℃水浴变性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；将变性好的预杂交液每张玻片10μL滴加到玻片上，盖上盖玻片并置于暗盒中，37℃孵育1h；

[0052]将预杂交处理后的玻片分别置于常温放置的70％，95％，100％的梯度酒精各5min，自然晾干；同时在避光条件下按照探针配制的比例，在6μL杂交液中加入1μL人的21号染色体探针，充分混匀后，把配制好的杂交液置于75℃水浴变性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；将变性好的杂交液每张7μL滴加到玻片上，盖好盖玻片，置于暗盒内，37℃孵育12-16h；

[0053]提前在水浴锅中预热甲酰胺∶2XSSC＝1∶1两缸，2XSSC两缸；将上述杂交后的玻片轻轻揭去盖玻片，然后置于甲酰胺∶2XSSC＝1∶1的漂洗液中洗涤两次各五分钟，2XSSC洗涤玻片两次各五分钟，自然晾干；然后配制Hoechst工作液，并加入等体积的抗荧光淬灭剂，每张玻片大约滴加10μL Hoechst-Antifade到玻片上置于暗处染色10min，盖上盖玻片，指甲油封片，荧光显微镜观察拍照。

[00]实施例1至6的结果如图1-6所示，将实施例1、实施例2的染色结果与实施例4进行对比发现，没有经过低渗处理而直接进行后期FISH染色会造成染色效果不均匀，不利于对

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阳性染色体进行计数和完整性分析。出现这种情况的原因在于，细胞未经过低渗处理，直接进行贴片，导致很多细胞的细胞核不在同一个焦平面，普通显微镜观察拍照的时候不能进行多个层面的扫描，会影响对染色特核型的判断，而经过低渗这一处理后就能明显的改善这一现象，获得更清晰直观的结果。而作为ES细胞，和实施例4中的一致，用75％的低渗液处理得到的染色效果是比较好的。

[0055]将实施例3和实施例4的染色结果进行比较发现，如果对低渗处理后的玻片不进行预杂交处理，会有很多的非特异性染色的出现，影响观察结果。如果在探针杂交之前用鱼精DNA进行1-2h的预杂交能很明显的改善这种情况，获得较为特异、清晰的染色结果。[0056]对于很多较为难得或者需要对照染色的样本，可能需要两个或者多个探针共染的情况，如图5所示，应用本发明进行两个探针共染也能得到很好的染色结果。[0057]如图6所示，发明人对人的21三体综合征患者的iPS细胞中21号染色体进行染色，结果发现通过小鼠ES细胞探索的FISH方案同样适用于人的iPS细胞，这为21三体综合征的医学诊断也提供了一种更加简单可靠的方法。

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