调节性T细胞在儿童过敏性紫癜发病机制中的作用初探

・411・

・免疫系统疾病・

调节性T细胞在儿童过敏性紫癜

发病机制中的作用初探

杨军　李成荣　祖莹　王国兵　李永柏

【摘要】　目的　系统观察过敏性紫癜(HSP)急性期调节性T细胞(Tr)亚群及辅助性T细胞亚　　

群(Th1/Th2)的变化,探讨HSP急性期免疫失衡的发病机制。方法　流式细胞术检测20例HSP急+性期患儿各种调节性T细胞亚群(CD4+CD25Tr、Tr1、Th3等)和辅助性T细胞亚群(Th1、Th2)的改变,

并采用逆转录聚合酶链反应(RT2PCR)和荧光定量聚合酶链反应(Real2timePCR)检测其外周血单个核细胞(PBMC)Foxp3mRNA的表达。同期20例同龄健康儿童作为对照。结果　HSP急性期

+-+

γ-ICD3CD8INF2L24(Th2)细胞显著增高(P<0105),Th1/Th2比值显著降低(P<0105)。各调节++-++

β+(Th3)细胞与正常对照组比较均显性T细胞亚群CD4+CD25Tr、CD4IL24IL210(Tr1)、CD4TGF2

著降低(P均<0105)。HSP组PBMCFoxp3mRNA的表达与正常对照组比较亦显著降低(0122±0105

vs166132±9125,P<01001)。结论　HSP急性期存在明显的免疫失衡,Th2优势明显;调节性T细胞

CD4CD25Tr、Tr1、Th3数量减少导致的免疫抑制效应不足可能是导致HSP免疫失衡的重要原因,而HSP患儿调节性T细胞减少与Foxp3表达降低有关。

++

【关键词】　紫癜,过敏性;　T淋巴细胞,辅助诱导;　T淋巴细胞亚群;　DNA结合蛋白质类

RoleofregulatoryTcellsinpathogenesisofHenoch2Schonleinpurpurainchildren　　YANGJun,LI

Cheng2rong,ZUYing,WANGGuo2bing,LIYong2bai.InstituteofPediatrics,ShenzhenChildren’sHospital,Shenzhen518026,China

【Abstract】　Objective　Henoch2Schonleinpurpura(HSP)isoneofthemostcommonsmallvesselformsofautoimmunevasculitisinchildren1ImmunologicderangementincludinghumoralandcellularimmunitydisequilibriumandproinflammatoryfactorsdysfunctionareinvolvedintheacutestageofHSP1RecentlydatarevealedthatregulatoryTcells(Tr)playapivotalroleinpreventingdevelopmentofautoimmuneandallergicdiseases1ThisstudyaimedtoexploretheroleofTrcellsinpathogenesisofHSPandthefactorsaffectingdevelopmentofTrcells1Methods　TwentypatientswithHSPand20age2matchedhealthychildrenwereenrolledintothisstudy1Flowcytometric(FCM)analysiswasperformedtodetectthe

++

percentageofregulatoryTcellssubpopulation(includingCD4CD25Tr,Tr1andTh3)andhelperTcellssubpopulation(Th1andTh2)1Reversetranscription2polymerasechainreaction(RT2PCR)andreal2timePCRwereusedtoanalyzeFoxp3expressioninperipheralbloodmononuclearcell(PBMC)1ResultsComparedwithhealthycontrolsubjects,theproportionsofTh2cellinpatientswithHSPweresignificantlyhigher(P<0105),andtheratioofTh1/Th2wasremarkablydecreased(P<0105)1Theproportionsofthree

++

subpopulationofregulatoryTcellsincludingCD4CD25Tr,Tr1,Th3inpatientswithHSPwereallsignificantlylowerthanthoseofcontrols(P<0105)1ThemRNAexpressionofFoxp3inpatientswithHSPshowedsimilartendency(P<01001)1Conclusions　ThedecreaseofthreesubpopulationsofregulatoryTcellsmightbeinvolvedinpathogenesisofHSPandassociatedwiththedecreasedexpressionofFoxp3gene1

【Keywords】　Purpura,schoenlein2henoch;　T2lymphocytes,helper2inducer;　T2lymphocytesubsets;　DNA2bindingproteins

　　过敏性紫癜(HSP)是儿童时期最常见的一种自身免疫性血管炎性疾病,大量研究表明HSP急性期存在明显的免疫功能异常,包括体液免疫紊乱、T细胞亚群功能失调及细胞因子异常分泌等,由于HSP

病因和发病机制十分复杂,导致其免疫失衡的具体

机制至今尚未阐明。最近研究发现的调节性T细胞(Tr)具有免疫抑制和免疫调节两大功能,是机体维持自身免疫耐受的重要组成部分,并与多种自身免疫性疾病和过敏性疾病的发病密切相关,目前国内外未见调节性T细胞与儿童HSP发病关系的研

作者单位:518026深圳市儿童医院儿科研究所

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中华儿科杂志2006年6月第44卷第6期　ChinJPediatr,June2006,Vol44,No16

究报道。本研究于2004年1月至2005年6月系统观察了HSP急性期调节性T细胞亚群(包括

++

CD4CD25Tr、Tr1、Th3等)及辅助性T细胞亚群(Th1/Th2)的变化,旨在进一步阐明HSP急性期免疫失衡的发病机制。

对象与方法

一、对象

11过敏性紫癜(HSP)组:2004年1月至2005

(451bp)P1:5′2TCCAGGACAGGCCACATTTC23′;P2:5′2AGCTGCTGCTCCAGAGACTGTAC23′。β2actin

(1bp)为内参照,P1:5′2GTCACCAACTGGGACGA2CA23′;P2:5′2GGAACCGCTCATTGCCAA23′(上海基康生物技术有限公司合成);(3)RT2PCR扩增:采

年6月在本院就诊的HSP急性发作期患儿20例,均符合1990年美国风湿病协会制定的HSP诊断标[1]

准。年龄3～12岁,其中男12例,女8例。所有受试者均为初次发病的患儿,近4周内未使用任何糖皮质激素或细胞毒性药物,采血前24h未使用任何药物。所有受试对象均知情同意。

21正常对照组:20例无过敏性疾病史的健康体检儿童,年龄3～12岁,其中男10例,女10例。

二、方法

11外周血单个核细胞(PBMC)的分离:无菌采集各组受试对象外周静脉血5ml,乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)抗凝,Ficoll(ρ=11077)密度梯度离心法分离PBMC备用。

21流式细胞术(BeckmancoulterEpics2XL4)检测辅助性T细胞亚群及调节性T细胞亚群:(1)Th1、Th2细胞:采用全血直接计数流式细胞仪内标法,外周血细胞体外刺激(PMA:25ng/ml,Ionomycin:250ng/ml),Monensin作蛋白转运抑制

剂,5%CO2孵箱37℃培养24h,CD32PC5、CD82

γ2FITC、ECD设门,固定破膜,细胞浆内INF2IL242PEγ染色阳性代表Th1避光染色15min,胞浆内INF2

++

细胞、IL24染色阳性代表Th2细胞;(2)CD4CD25Tr细胞检测:取未经任何刺激的外周血100μl,CD42FITC,CD252PC5避光染色15min,溶血15min,上机检测;(3)Tr1、Th3细胞检测:采用全血直接计数流式细胞仪内标法,外周血细胞体外刺激(PMA:25ng/ml,Ionomycin:250ng/ml),Monensin作蛋白转运抑制剂,5%CO2孵箱37℃培养12h,CD42ECD设门,固定破膜,胞浆内IL24染色阴性而IL210染色阳

β染色阳性者代表Th3细性者代表Tr1细胞,TGF2

胞。以上全部数据经EXPOS32ADC软件获取和分析。

3.逆转录2聚合酶链反应(RT2PCR)检测PBMCFoxp3mRNA的表达:(1)采用QIAamp试剂盒(美国Qiagen公司)提取上述分离的PBMC总RNA,紫外分光光度计测定RNA含量;(2)引物设计:Foxp3

用美国MBI公司试剂盒,取2μg总RNA合成cDNA,反应体积为60μl;逆转录:70℃5min、37℃5min、42℃60min、70℃10min进行1次循环。取1μlcDNA为模板进行PCR扩增40循环;(4)RT2PCR产物鉴定:取Foxp3及β2actin扩增产物10μl在115%琼脂糖凝胶中电泳30min,RT2PCR产物纯化后测序,与Genbank基因序列(NM014009)比较完全一致;(5)RT2PCR产物半定量检测:将凝胶电泳图像输入凝胶成像系统,应用图像分析软件进行各条带平均灰度值分析,以同时扩

β2actin的灰度增的β2actin为内参照,用待测基因/

比值表示待测基因相对表达量。

41荧光定量PCR(Real2timePCR)检测PBMCFoxp3mRNA的表达:采用美国QIAGEN公司SYBRGreen试剂盒,使用罗氏LightCycler荧光定量PCR仪扩增检测,应用RelativeQuantificationSoftware110分析软件进行分析,结果以待测基因/β2actin的CT比值表示。具体操作参照试剂说明书。

三、统计学处理

所有实验数据经正态性检验以明确资料的总体分布类型,正态分布数据用均数±标准差表示(x󰁡±s),组间比较采用t检验;非正态分布数据用中位数(5百分位数,95百分位数)表示[Md(X5,X95)],组间比较采用Wilcoxon秩和检验。统计学处理采用SPSSV1010统计软件包完成。

结

果

+

-

11HSP组与对照组比较,HSP急性期CD3CD8

γIINF2L24

-+

(Th2)细胞明显增高,而CD3+CD8-

-γ+IINF2L24(Th1)细胞改变不明显,Th1/Th2比值明显降低,两组比较差异有统计学意义(表1)。

21HSP组与对照组比较,HSP急性期CD4CD25

+-++

β+Tr细胞、CD4IL24IL210细胞(Tr1)、CD4TGF2

细胞(Th3)数量均明显减少,两组比较差异有统计

++

学意义(表1)。

31半定量RT2PCR和Real2timePCR两种方法均检测到HSP组Foxp3mRNA的表达较对照组明显降低,两组比较差异有统计学意义(图1、2,表2)。

中华儿科杂志2006年6月第44卷第6期　ChinJPediatr,June2006,Vol44,No16

表1　HSP急性期PBMC流式细胞术检测结果[Md(X5,X95)]

+

Tr(%)分组例数CD4+CD25Tr1(%)Th3(%)

33

HSP组206.90(4.81,11.2)2.01(0.74,3.35)1.29(0.24,1.96)3正常对照组2010.92(6.83,15.42)5.97(0.90,8.33)3.52(1.16,7.18)

・413・

Th1(%)Th2(%)

3

Th1/Th2

13.81(5.10,27.58)3.21(0.,6.42)4.23(3.21,10.45)315.70(12.21,25.33)0.78(0.41,2.80)18.66(10.24,34.25)

　　注:与正常对照组比较3P<0.05

分泌。研究表明CD4CD25Tr主要通过细胞2细胞间直接接触的方式发挥免疫抑制效应,但亦可通过细

β等)介导[3]。此外,一些胞因子(如IL210、TGF2

A12A3:正常对照组Foxp3;A42A6:HSP组Foxp3B12B3:正常对照组β2actin;B42B6:HSP组β2actin

++

CD4T细胞经抗原或细胞因子刺激也可获得免疫抑制功能,目前称之为诱导型调节性T细胞(inducedregulatoryTcell),包括Ⅰ型调节性T细胞(TypeⅠregulatoryTcell,Tr1)和辅助性T细胞3(Th3)等两

+

图1　RT2PCR检测Foxp3mRNA的表达种

。Tr1免疫抑制功能的发挥主要依赖于分泌

β,但不分泌高水平的IL210和中等水平的TGF2

β,对Th1、IL24;而Th3主要分泌TGF2Th2类细胞均具有明显的抑制效应。上述3种调节性T细胞对于

维持机体的免疫自稳具有重要意义,目前越来越多的研究表明调节性T细胞与系统性红斑狼疮、炎症性肠病、移植排斥反应、支气管哮喘、自身免疫性脑脊髓炎等多种免疫相关性疾病的发病密切相关,并

[628]

在上述疾病的治疗中具有良好的应用前景。既往研究证实HSP急性期存在多种免疫功能紊乱,有研究观察了例HSP,证实HSP急性期血浆IgA、IgE水平明显增高,而IgG、IgM水平并无异常改变,且发现IL24与IgE及IL25与IgA间存在正

[9]

相关。由于IL24促进IgE、IgG的分泌,IL25诱导IgA产生,因此推测HSP急性期IgA、IgE增高与IL24、IL25等Th2型细胞因子过度生成有关。既往研究亦证实HSP急性期Th2型细胞因子明显增高,Th2特异膜蛋白分子CD30表达也显著高于正常水平,

γ分泌减少[10]。本而Th1型细胞因子IL22及INF2

研究采用流式细胞内标记技术,发现HSP急性期Th2细胞比例明显增高,而Th1细胞改变不明显,Th1/Th2比值明显降低,结果与以往的报道基本一

[4,5]

A:正常对照组Foxp3;B:正常对照组β2actin;C:HSP组β2actin;D:HSP组Foxp3

图2　REALTIME2PCR检测Foxp3mRNA的表达

表2　HSP急性期PBMCFoxp3mRNA表达检测结果(x󰁡±s)

分组

HSP组

例数

2020

Foxp3的表达RT2PCR0.39±0.0832.37±0.59

Real2timePCR0.22±0.05#66.32±9.25

正常对照组

　　注:与正常对照组比较3P<0.01,#P<0.001

讨论

CD25(IL22受体α链)长期以来一直认为只表

达在活化的T细胞表面,是T细胞激活的特异性表

面标记之一。近年的研究发现体内有一类静息的CD4T细胞表面亦表达CD25分子,这类CD4CD25T

+

+

+

细胞具有免疫调节功能,并且在自身免疫耐受维持

++

中发挥重要作用。由于这类CD4CD25T细胞最先是从正常未经免疫的小鼠分离而来,故又称为CD4

+

++CD25天然调节性T细胞(naturallyoccurringCD4+[2]++

CD25regulatoryTcell)。CD4CD25调节性T细胞+

(CD4+CD25Tr)具有免疫性,在接受抗原刺激后

致,证实HSP急性期存在明显的免疫失衡,Th2优势

明显。进一步的研究发现HSP急性期调节性T细胞亚群CD4CD25Tr、Tr1、Th3数量均有明显降低,由于调节性T细胞的减少可直接导致具有免疫抑

++

制效应的细胞(如CD4CD25Tr)和细胞因子(如IL2

β)产生减少或者反应不足,从而导致炎症10、TGF2

反应失控并引起自身免疫损伤。本研究结果表明调

节性T细胞的减少并由此引起免疫抑制效应不足可能是HSP急性期免疫失衡的重要原因。

Foxp3是forkhead/winged2helix转录因子家族

+

+

既不增生也无IL22分泌等T细胞活化现象;同时

+++CD4CD25Tr还具有免疫抑制性,可抑制其他CD4和CD8T细胞亚群及B细胞的活化和细胞因子的

+

・414・

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4GruoxH.TypeIregulatoryTcells:theirroleinthecontrolofimmuneresponses.Transplantation,2003,15:8212.5ChenY,KuchrooVK,InobeJ,etal.RegulatoryTcellclonesinducedbyoraltolerance:suppressionofautoimmuneencephalomyelitis.Science,1994,265:123721240.6CaoD,MalmstromV,Baecher2AllanC,etal.Isolationand

++

functionalcharacterizationofregulatoryCD25CD4Tcellsfromthetargetorganofpatientswithrheumatoidarthritis.EurJImmunol,2003,33:2152223.

7CrispinJC,MartinezA,Alcocer2VarelaJ.QuantificationofregulatoryTcellsinpatientswithsystemiclupuserythematosus.JAutoimmun,2003,21:2732276.

8MottetC,UhligHH,PowrieF.Cuttingedge:cureofcolitisby

+

CD4+CD25regulatoryTcells.JImmunol,2003,170:393923943.9李秋,杨锡强,李永柏,等.过敏性紫癜T淋巴细胞功能状态的研究.中华儿科杂志,2001,39:1572159.10DelPreteG,DeCarliM,AlmerigognaF,etal.Preferential

expressionofCD30byhumanCD4+Tcellsproducingth22typecytokines.FASEBJ,1995,9:81286.

11BennettCL,ChristieJ,RamsdellF,etal.Theimmune

dysregulation,polyendocrinopathy,enteropathy,X2linkedsyndrome(IPEX)iscausedbymutationsofFOXP3.NatGenet,2001,27:20221.

12Horis,NomuraT,SakaguchiS.ControlofregulatoryTcells

developmentbythetranscriptionfactorFoxp3.Science,2003,299:105721061.

13FontenotJD,GavinMA,RudenskyAY.Foxp3programthe

++

developmentandfunctionofCD25CD4regulatoryTcells.NatImmunol,2003,4:3302336.

14WalkerMR,KasprowiczDJ,GersukVH,etal.InductionofFoxP3

andacquisitionofTregulatoryactivitybystimulatedhuman

-CD4+CD25Tcells.JClinInvest,2003,112:143721443.

(收稿日期:2005210218)

中的一个新成员,人类Foxp3基因突变可引起X连

锁的自身免疫2变态反应失调综合征(X2Linked

[11]

autoimmunity2allergicdysregulationsyndrome,XLAAD)。新近研究表明Foxp3不仅是天然产生的CD4CD25Tr细胞发育的关键因子,诱导产生的调节性T细胞

[12214]

同样也可表达Foxp3。本研究进一步观察了HSP急性期Foxp3mRNA的表达,试图更深层次的阐明HSP免疫失衡的具体机制,结果发现HSP急性期Foxp3表达明显降低,推测HSP急性期调节性T细胞的减少可能与Foxp3表达降低有密切关系。我们以往对20例支气管哮喘的患儿的研究中同样发++

现CD4CD25Tr数量减少及Foxp3表达降低,且二者呈正相关。自身免疫性疾病和过敏性疾病患儿Foxp3的异常表达是否与自身遗传背景有关,还是

+

+

受环境因素的影响,尚待进一步深入研究。

参

考

文

献

1MillsJA,MichelBA,BlochDA,etal.TheAmericanCollegeofRheumatology1990criteriaforTheclassificationofHenoch2Schonleinpurpura.ArthritisRheum,1990,33:111421121.2SakaguchiS,SakaguchiN,AsanoM,etal.Immunologicself2tolerancemaintainedbyactivatedTcellsexpressingIL22receptoralpha2chains(CD25).Breakdownofasinglemechanismofself2tolerancecausesvariousautoimmunediseases.JImmunol,1995,155:1151211.

3ShevachEM.Certifiedprofessionals:CD4(+)CD25(+)suppressorTcells.JExpMed,2001,193:41246.

(本文编辑:关卫屏)

专家点评　过敏性紫癜的发病机制还不清楚,该文从调节性T细胞的角度观察其发病机制,具有新意。但是

过敏性紫癜的发病机制可能并非单一因素,遗传体质、环境刺激等多因素可能参与其发病。为了阐明调节性T细胞功能下降与过敏性紫癜的因果关系,最好有一组自身免疫性疾病(如川崎病)和非自身免疫性炎症性

+

疾病(如肺炎或扁桃体炎)作为对照。若只有HSP组T调节细胞(Foxp3)下降,提示其特异性和可能的因果关系。若三者均为下降,则不能说明任何问题,只是炎症的一种表现。若HSP组、自身免疫性疾病组T调

+

节细胞下降,而非自身免疫性炎症性疾病组不下降,则可能提示T调节细胞(Foxp3)低下者,是易发生炎症

+

和自身免疫性疾病的易受损人群,是其遗传学背景,或许T调节细胞(Foxp3)表达程度可作为这些炎症易损人群的预测指标。

重庆医科大学附属儿童医院(400014)

杨锡强