环境污染与防治第３３卷第７期２０１１年７月 聚乙烯醇优势降解酶的酶学特性分析＊ 郭雅妮 崔双科。 赵倩楠 （１．西安工程大学环境与化学工程学院，陕西西安７１００４８；２．陕西省现代建筑设计研究院，陕西西安７１００４８） 摘要 从前期筛选的能完全降解聚乙烯醇（ＰＶＡ）的混合菌系发酵液中提取粗酶液，并对其酶学性质进行分析，考察其在细胞 内外的分布及适宜的环境条件 结果表明：（１）混合菌系所产的ＰＶＡ降解酶胞内外都有分布，胞外ＰＶＡ降解酶所占比例较大，达 到５４ ；（２）混合菌系所产的ＰＶＡ降解酶的适宜ｐＨ为６．５左右，在ｐＨ为６～８时相对较稳定；（３）混合菌系所产的ＰＶＡ降解酶的 适宜温度为２５￣３５ ｕＣ，且在３ｏ℃时的酶活最大，ＰＶＡ降解酶在３Ｏ℃时的酶活相对稳定；（４）粗酶液对ＰＶＡ溶液有很好的降解作 用，反应１４ ｈ后，ＰＶＡ降解率为８０ 但彻底降解ＰＶＡ所需时间太长，可能是由于粗酶液酶活太低。 关键词 聚乙烯醇降解酶酶活ｐＨ温度 Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ＧＵＯ Ｙａｎｉ ，ｃｇＩ Ｓｈｕａｎｇｋｅ ，ＺＨＡＯ Ｑｉａｎ— ｎａｎ ．（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｘｉ’ａｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ Ｓｈａａｎｘｉ ７１００４８；２．Ｍｏｄｅｒｎ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｈａａｎｘｉ，Ｘ ’ａｎ Ｓｈａａｎｘｉ ７１００４８） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ（ＰＶＡ）ｄｅ— ｇｒａｄｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ＰＶＡ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｂｏｔｈ ｉｎｓｉｄｅ ａｎｄ ｏｕｔｓｉｄｅ ｔｈｅ ｃｅｌｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｒ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ５４ ．Ｔｈｅ ＰＶＡ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｓｔｅａｄｙ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ６．０ ｔＯ ８．０，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｐＨ ｗａｓ ６．５．Ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ＰＶＡ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ２５℃ｔＯ ３５℃。ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ａｔ ３５℃．Ｔｈｅ ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｐｅｒｆｅｃｔ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｆｏｒ ＰＶＡ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＶＡ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ａｒｒｉｖｅ ａｂｏｖｅ ８０ ａｆｔｅｒ １ ２ ｈ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｂｕｔ ｉｔ ｎｅｅｄ ｌｏｎｇ ｔｉｍｅ ｔＯ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｄｅｇｒａｄｅ ｔｈｅ ＰＶＡ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｅａｓｏｎ ｗａｓ ｔｈｅ ｌｏｗ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｏｌｙｖｉｎｙ１ ａｌｃｏｈｏｌ；ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ；ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ；ｐＨ；ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ 聚乙烯醇（ＰＶＡ）是一种人工合成的水溶性高分 适ｐＨ、温度及酶的ｐＨ和温度的稳定性，为工业化 子有机化合物，由于它具有较好的粘附性、浆膜强韧 性、耐磨性，被广泛应用于纺织、印染、化纤等行 酶制剂的应用提供理论依据。 １ 实验部分 １．１ 主要试剂 业［１］。但由于ＰＶＡ可生化性较差，其废水难以用常 规方法进行处理＿Ｌ２］。自２０世纪７Ｏ年代以来，国内 外分离出多株降解ＰＶＡ的微生物（其中假单胞菌属 较多），并研究了微生物降解ＰＶＡ机制、提取纯化和 相关的酶。 ＰＶＡ：化学纯，醇解度为９９．８ ～１００．０ 。其 他试剂均为分析纯。 种子培养基：ＰＶＡ １．０ ｇ、酵母膏１ ｇ、ＫＨ２ＰＯ ０．２０ ｇ、Ｋ２ ＨＰＯ４ １．６ ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ Ｏ ０．０５ ｇ、 ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ ｇ、ＣａＣ１２ ０．０５ ｇ、ＮａＣ１ ０．０２ ｇ、 ＰＶＡ降解酶是一种具有市场前途的纺织退浆 用酶，ＰＶＡ降解酶工业化的前提是能提取得到性能 良好、价格便宜的ＰＶＡ降解酶制剂。本实验室前期 筛选出了一个可完全降解ＰＶＡ的混合菌系 Ｊ，该混 合菌系能彻底降解培养基中的ＰＶＡ，并能产生具有 较高酶活的ＰＶＡ降解酶。笔者对此混合菌系所产 的ＰＶＡ降解酶的酶学性质进行了研究，确定了酶最 蒸馏水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．２。 发酵培养基：ＰＶＡ ２．０ ｇ、ＮＨ Ｃ１ ３．０ ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４ ０．２５ ｇ、Ｋ２ ＨＰＯ４ ２．０ ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ Ｏ ０．０６ ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ ｇ、ＣａＣ１２ ０．０５ ｇ、ＮａＣ１ ０．０２ ｇ、蒸馏水ｌ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．２。 第一作者：郭雅妮，女，１９７２年生，硕士，副教授，主要从事环境化学与监测方面的研究。 ＊陕西省科技厅科学技术研究发展计划项目（Ｎｏ．２０１０Ｋ０２—１０）。 ・ ６２ ・ 郭雅妮等 聚乙烯醇优势降解酶的酶学特性分析 １．２主要仪器 １０．０，于３Ｏ℃下保温１ ｈ，测定ＰＶＡ降解酶的酶活， ＹＸ２８ＯＢ型高压蒸汽灭菌锅、ＤＫＺ一２型电热恒 再将粗酶液调至最适ｐＨ，测定残留酶活。 温振荡槽、ＪＹ９２—２Ｄ超声破碎机、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８１０型 １．３．７ ＰＶＡ降解酶温度稳定性的实验方法 冷冻离心机、Ｖ一１１００可见分光光度计、ＨＨ－Ｓ４数显 将适量粗酶液用ｐＨ为６．５、ＰＶＡ为１．０ ｇ／Ｌ、 恒温水浴锅。 离子强度为０．１ ｍｏｌ／Ｌ的磷酸钾缓冲液稀释１倍， １．３ 实验方法 分别在３５、４Ｏ、４５、５Ｏ℃下保温不同时间，取样时间 ｌ＿３．１菌种来源 为１ ｈ，反应时间为３ ｈ，然后迅速将其冷却，测定 从某棉纱厂的浆纱机底部水槽处取样品（黑色 ＰＶＡ降解酶的残留酶活。 块状）培养驯化后的混合菌系。 １．３．８粗酶液对ＰＶＡ溶液的降解 ｌ－３．２ ＰＶＡ降解酶粗酶液的制备 将粗酶液与底物（１．０ ｇ／Ｌ ＰＶＡ溶液溶于最适 取２ ｍＬ混合菌系菌种置于装有１００ ｍＬ种子 ｐＨ、离子强度为０．１ ｍｏｌ／Ｌ的磷酸钾缓冲液）等体 培养基的２５０ ｍＬ锥形瓶中培养发酵２４ ｈ。取１ ｍＬ 积混合，将此混合体系于３０℃水浴中反应，每１ ｈ 发酵液接入装有１００ ｍＬ发酵培养基的２５０ ｍＬ三 取样，测该混合液中的ＰＶＡ含量。每个样品均做２ 角瓶中，于３Ｏ℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ下振荡培养５ ｄ。之后 个平行样。 将发酵液于１２ ０００ ｒ／ｒａｉｎ下离心２０ ｒａｉｎ，得到的上 清液即为粗酶液；沉淀物溶于磷酸盐缓冲液（ｐＨ ２结果与讨论 ７．０，离子强度为０．１ ｔｏｏｌ／Ｌ），使体积与原发酵液相 ２．１ 混合菌系产ＰＶＡ降解酶的酶活分布 等，超声破碎（４℃，４００ Ｗ，工作１ ｓ，停２ Ｓ，工作时 取发酵５ ｄ的发酵液，分别测粗酶液（胞外）、破 间为１５ ｒａｉｎ），离心收集上清液备用，该部分上清液 碎上清液（胞内）和沉淀复溶液（胞内）的酶活，结果 称为破碎上清液；沉淀物再溶于磷酸盐缓冲液至原 见表１。由表１可以看出，混合菌系所产的ＰＶＡ降 体积，称为沉淀复溶液。 解酶胞内外都有分布，但在这３部分中胞外ＰＶＡ降 １．３．３ ＰＶＡ含量和降解酶酶活的测定 解酶所占比例较大，达到５４ ９／６。 通过比色法［４］测定ＰＶＡ含量。 表１酶活分布 在１００ ｍＬ碘量瓶中加入５ ｍＬ粗酶液和５ ｍＬ Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ 底物（１．０ ｇ ＰＶＡ溶于１ Ｌ ｐＨ为７．０、离子强度为 样品 酶活／（Ｕ・ｍＬ ） 粗酶液 ０．２３９ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ的磷酸钾缓冲液），将此混合体系于３０ 破碎上清液 ０．０６７ ℃的水浴中反应３ ｈ，取一定量显色后在６９０ ｎｍ处 沉淀复溶液 ０．１３６ 测定反应前后混和液的吸光度。每分钟吸光度下降 ２．２ 适宜ｐＨ和ｐＨ对ＰＶＡ降解酶稳定性的影响 ０．００１定义为一个酶活单位［５］。 由图１可知，在ｐＨ为６．５时，混合菌系所产的 １．３．４ ＰＶＡ降解酶适宜ｐＨ的实验方法 ＰＶＡ降解酶酶活最大；在ｐＨ为７．０时，酶活开始 配制一系列ｐＨ为３～１Ｏ、离子强度为０．１ 下降；当ｐＨ降至１０．０时，酶活降至０．１７７ Ｕ／ｍＬ。 ｍｏｌ／Ｌ的缓冲液，其中柠檬酸缓冲液ｐＨ为３～６，磷 由此可以得出，混合菌系所产的ＰＶＡ降解酶的适宜 酸钾缓冲液ｐＨ为７～８，碳酸钠缓冲液ｐＨ为９～ ＰＨ为６．５左右。 １Ｏ，将ＰＶＡ溶解于不同缓冲液中，配制成１．０ ｇ／Ｌ ＝．、 的ＰＶＡ溶液。按照ＰＶＡ降解酶测定方法测定其 吕 酶活，反应时间为３ ｈ。 邑 １．３．５ ＰＶＡ降解酶适宜温度的实验方法 烛 蹴 将ＰＶＡ降解酶和底物混合液分别置于２５、３０、 ３５、４０、４５、５０℃水浴中，然后测定ＰＶＡ降解酶酶 ｐＨ 活，反应时间为３ ｈ。 图１ ｐＨ对ＰＶＡ降解酶的影响 １．３．６ ＰＶＡ降解酶ｐＨ稳定性的实验方法 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ＰＶＡ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ 将粗酶液与不同ｐＨ的缓冲液等体积混合，分 从表２可以看出，混合菌系所产的ＰＶＡ降解酶 别调ｐＨ至３．０、４．０、５．０、６．０、６．５、７．０、８．０、９．０、 在ｐＨ为６～８时相对较稳定，在ｐＨ为６．５时酶活 ・ ６３ ・ 环境污染与防治第３３卷第７期２０１１年７月 们 。 损失最小。因此，实际中维持环境ｐＨ为６～８将有 利于ＰＶＡ降解酶的催化作用。 ２．３ 适宜温度和温度对ＰＶＡ降解酶稳定性的影响 由图２可知，混合菌系所产的ＰＶＡ降解酶在 ２５￣３５℃时的酶活基本可维持在０．２ Ｕ／ｍＬ左右； 在４０￣５０℃时的酶活只有０．１ Ｕ／ｍＬ左右。由此 可以得出，混合菌系所产的ＰＶＡ降解酶的适宜温 度为２５～３５℃，且在３Ｏ℃时的酶活最大。 ，后 已 媲 龌 温度／℃ 图２温度对ＰＶＡ降解酶的影响 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ＰＶＡ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ 从图３可以看出，ＰＶＡ降解酶在３０℃时的酶 活相对稳定，保温３ ｈ的酶活仍在０．４ Ｕ／ｍＬ以 上；在３５℃、保温１ ｈ时，酶活下降至０．４２０ Ｕ／ｍＬ，保温３ ｈ的酶活降为０．２４０ Ｕ／ｍＬ；在４Ｏ、 ４５℃时，ＰＶＡ降解酶迅速失活，保温１ ｈ的酶活均 降至０．４ Ｕ／ｍＬ以下，保温３ ｈ的酶活均降至０．２ Ｕ／ｍＬ以下。 昌 邑 媳 蹴 ０ ｌ ２ ３ 时间／ｈ 图３温度对ＰＶＡ降解酶稳定性的影响 Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｎ ＰＶＡ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ２．４粗酶液对ＰＶＡ的降解 由图４可知，粗酶液对ＰＶＡ溶液有很好的降 解作用，反应１４ ｈ后，ＰＶＡ质量浓度由初始的０．５ ｇ／Ｌ降至Ｏ．１ ｇ／Ｌ，降解率为８０ 。说明混合体系 中含有能高效降解ＰＶＡ的酶，但彻底降解ＰＶＡ所 ・ ６４ ・ 需时间太长，可能是由于粗酶液酶活太低。 时间／｝ｌ 图４粗酶液对ＰＶＡ的降解 Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＶＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３ 结 论 （１）混合菌系所产的ＰＶＡ降解酶胞内外都有 分布，胞外ＰＶＡ降解酶所占比例较大，达到５４ 。 （２）混合菌系所产的ＰＶＡ降解酶的适宜ｐＨ为 ６．５左右，且混合菌系所产ＰＶＡ降解酶在ｐＨ为６～ ８时相对较稳定，在ｐＨ为６．５时酶活损失最小。 （３）混合菌系所产的ＰＶＡ降解酶的适宜温度 为２５～３５℃，且在３Ｏ℃时的酶活最大。ＰＶＡ降解 酶在３Ｏ℃时的酶活相对稳定。 （４）粗酶液对ＰＶＡ溶液有很好的降解作用，反 应１４ ｈ后，ＰＶＡ降解率为８Ｏ 。说明混合体系中 含有能高效降解ＰＶＡ的酶，但彻底降解ＰＶＡ所需 时间太长，可能是由于粗酶液酶活太低。 参考文献： Ｅ１］ＳＨＩＭＡＯ Ｍ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｃｓ［Ｊ－］．Ｃｕｒｒｅｎｔ（）ｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１，１２（３）：２４２—２４７． ［２］郑金来，李君文．生物降解常见染料的研究进展［Ｊ］．环境污染 治理技术与设备，２０００，１（３）：３９—４３． Ｅ３］郭雅妮，赵倩楠，崔双科，等．降饵ＰＶＡ混合菌系的筛选及菌 株的分离纯化ＥＪ］．西安工程大学学报，２０１０，１０（４）：４４８—４５１． ［４］徐竞成，郑涛．分光光度法测定印染废水中聚乙烯醇含摄ｒＪ］． 化工环保，２００４，２４（Ｚ１）：３８７－３８８． ［５］ ＭＯＲＩ Ｔ，ｓＡＫＩＭＯＴＯ Ｍ，ＫＡＧＩ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃ— ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｄｅｇｒａｄｅｓ ｐｏｌｙ （ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏ１）［Ｊ＿．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｌ９９６。６０（２）：３３０—３３２． 编辑：黄 苇（ｉＳ改稿收到日期：２０１１—０３—２２）
