醇溶蛋白的提取 用25

醇溶蛋白的提取 用25%的2-氯乙醇进行三步法提取

取单粒小麦种子约0.03g，用电动粉碎机磨碎后，装入1.5mL离心管。先加入0.5mol/L的NaCl 0.3mL振荡混匀后室温下提取2h以上，4000r/min离心15min，通过该步骤去除盐溶性蛋白（包括清蛋白和球蛋白）。弃去上清液，加0.5mL蒸馏水，振荡混匀后室温下提取0.5h，4000r/min离心15min，弃上清液（该步骤重复两次）。加入25%的2-氯乙醇0.3mL，振荡混匀后室温下提取0.5h，10000r/min离心10min，所得上清液即为醇溶蛋白（邵锦震等，2003）。上清液按 1：4 体积比加入上样缓冲液（含质量分数40%的蔗糖和0.15%甲基绿，pH=5.0）。混匀后上样或于4℃保存，上样量10µl。

制备胶板

A 14ml凝胶Buffer，用冰醋酸调至pH 3.1

B 封底胶

2ml凝胶Buffer(pH3.1)加10μl H2O2(0.7%)

C 分离胶

12ml凝胶Buffer(pH3.1)加10μl H2O2 (0.7%)

D 封顶液

70%乙醇

E 浓缩胶

2ml凝胶Buffer加2ml ddH2O加10μl H2O2(0.7%)

加入浓缩胶后，选择合适的梳子，小心均匀用力将梳子插入（高居荣等，2003）。

2.2.2.3 恒压电泳

待胶凝固好后，小心拔出梳子，将胶板固定在电泳槽上，加入1×电极缓冲液。每孔加10μl蛋白提取液（醇溶蛋白上清液：上样缓冲液＝1：4），为消除边缘效应，两头的梳子孔加上样缓冲液。以电压100V，电流200mA的条件跑完浓缩胶部分，约30min。变换电压，调为300V，电流200mA，跑完分离胶，约1h。上述两个条件都是以甲基绿指示剂作为指示条件。待指示剂跑完分离胶后，继续跑两个半小时。

2.2.2.4 拆板染色、扫描

电泳后，小心的把胶板拆下来，用考马斯亮兰R-250染色，放在摇床上以使染色均匀，至少两小时。醇溶蛋白的提取 采用70%的乙醇进行三步法提取。

取单粒小麦种子约0.03g，用电动粉碎机磨碎后，装入1.5mL离心管。先加入0.5mol/L的NaCl 0.5mL振荡后室温下提取2h以上，4000r/min离心15min，通过该步骤去除盐溶性蛋白。去除上清液，用0.5mL蒸馏水溶解沉淀，振荡后室温下提取0.5h以上，4000r/min离心15min，弃上清液，通过该步骤去除水溶性蛋白（该步骤重复两次）。用70%乙醇0.5mL溶解沉淀，振荡后室温下提取0.5h以上，10000r/min离心10min，所得上清液即为可用于HPLC的醇溶蛋白。