荧光定量PCR技术在食品包装材料致病菌监测中的应用

山　东　化　工

ＳＨＡＮＤＯＮＧＣＨＥＭＩＣＡＬＩＮＤＵＳＴＲＹ　　　　　　　　　　　　２０１８年第４７卷

荧光定量ＰＣＲ技术在食品包装材料致病菌监测中的应用

雷　琼

（贵州省产品质量监督检验院，贵州贵阳　５５００１６）

摘要：建立一种新型检测食品包装材料致病菌的检测技术。采用荧光定量ＰＣＲ方法对致病菌的目的基因进行扩增，结果表明荧光定量

ＰＣＲ可以灵敏快速的检测出包装材料中的致病菌。该方法具有良好的检测特异性，可实现食品包装材料致病菌的快速检测，为食品安全检测提供了一种快速准确的新型检测技术。关键词：荧光定量ＰＣＲ；食品包装材料；致病菌中图分类号：Ｏ６５７．３　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００８－０２１Ｘ（２０１８）０９－００５６－０２

ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｆｏｒＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇＰａｔｈｏｇｅｎｓ

ｉｎＦｏｏｄＰａｃｋａｇｉｎｇｍａｔｅｒｉａｌｓ

ＬｅｉＱｉｏｎｇ

（ＧｕｉｚｈｏｕＰｒｏｖｉｎｃｅＰｒｏｄｕｃｔＱｕａｌｉｔｙＳｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎａｎｄＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ　５５００１６，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｉｓｐａｐｅｒｉｓｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｉｎｗｈｉｃｈＰａｔｈｏｇｅｎｓｃａｎｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｆｏｏｄｐａｃｋａｇｉｎｇ

ｍａｔｅｒｉａｌｓ．ＴｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｂａｃｔｅｒｉａｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｐａｔｈｏｇｅｎｓｃａｎｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｒａｐｉｄａｎｄＳｅｎｓｉｔｉｖｅｂｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ．Ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｅｄｍｅｔｈｏｄｉｓｖｅｒｙｓｐｅｃｉｆｉｃ，ａｎｄｃａｎａｃｈｉｅｖｅｔｈｅｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＰａｔｈｏｇｅｎｓｉｎｆｏｏｄｐａｃｋａｇｉｎｇｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｉｔｃｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｎｅｗｆｅａｓｉｂｌｅｔｅｃｈｎｉｃａｌｓｕｐｐｏｒｔｆｏｒｔｈｅｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅａｎｄｓａｆｅｇｕａｒｄｆｏｏｄｓａｆｅｔｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ；ｆｏｏｄｐａｃｋａｇｉｎｇｍａｔｅｒｉａｌｓ；ｐａｔｈｏｇｅｎ　　现今，食品安全问题在我国矛盾突出，食品问题层出不穷，严重影响国民的生活健康。为了进一步加强食品安全，找出影响食品安全的因素成为解决问题的关键。食品包装作为食品的外衣，污染物可通过扩散、溶解和分散进入到食品，食品包装

［１］

已成为影响食品安全性的主要因素。在我国食品安全突出的大环境下，建立一种快速安全的食品包装材检测方法至关重要。食品包装材料的安全性检测主要是通过化学物理等方法进行如气相色谱－质谱联用（ＧＣ－ＭＳ）、气相色谱（ＧＣ）、高效液相色谱（ＨＰＬＣ）、顶空气相色和高效液相色谱－质谱连用

［２］

（ＨＰＬＣ－ＭＳ）等。采用分子生物学方法进行包装材料致病菌检测就所查文献，尚未报到。

实时荧光ＰＣＲ（ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ）是在ＰＣＲ技术基础上建立的一种新型核酸定量技术，可进一步将荧光能量传递技术应用于常规的ＰＣＲ仪器中，现已成为微生物学诊断最

［３］

ＮＡ模板的定量，还强有力的工具。该技术不仅实现了对Ｄ

００９具有高灵敏度、高特异性和高可靠性等优点。雷永良等在２

年将Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ技术运用于食品污染物监测中，并采用传统细菌培养法进行对比，结果表明荧光ＰＣＲ方法较传统的细菌

［４］

培养法具有更高的特异性和准确性。周丽民等在２００９年至２０１０年将实时荧光定量ＰＣＲ技术应用于临床快速筛查致病

５］

菌，认为该法是快速筛查致病菌的理想检测方法［。高涛等于２０１７年将免疫磁珠富集－实时荧ＰＣＲ技术应用于检测单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌３种致病菌，建立食

［６］

品微生物及其致病因子的监测新技术。张靖雯在２０１７年报道，荧光定量ＰＣＲ技术已经被应用于国内外的环境监测方面，

７］

有助于环境中微生物的检测及研究［。目前，荧光定量ＰＣＲ已广泛应用于食品、分子生物学、医学及环境等多研究等领域，但尚未应用于食品包装材料安全性检测中。

面对国内食品安全事件日益严峻，备受重点关注的现状，为了进一步保护消费者的切身利益，将荧光定量ＰＣＲ技术应用

于食品包装材料中致病菌的检测，建立一种新型快速简便的高

效检测方法，从分子生物学角度为食品安全性检测奠定基础。

１　材料与方法１．１　试验材料

材料：食品包装材料（空白及添加阳性菌）；试剂：基因组提取试剂盒（ＴａＫａＲａ，９７６３）；荧光定量试剂盒（深圳生科源）；琼

Ａｇａｒｏｓｅ）、无水乙醇、三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）等试剂均脂糖（为国产。

仪器：移液器量程覆盖０．１～１００Ｌ共５支（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）；μＣ１０００ＴＭＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＰＣＲ仪；ＧｅｌＤｏｃＸＲ凝胶成像系统（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）；２－１６ｋ高速冷冻离心机（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）；ＤＹＹ－４型电泳仪（北京六一仪器厂）。

１．２　实验方法

１．２．１　基因组提取

称取样品５．０ｇ与４５０ｍＬＰＢＳ缓冲液中，按照基因组提取

ＮＡ，加入０．７％琼脂糖凝胶电试剂盒说明书提取细菌基因组Ｄ

泳３０ｍｉｎ，利用凝胶成像系统检测ＤＮＡ纯度及完整度，核酸测定仪检测质量和浓度。１．２．２　荧光定量ＰＣＲ检测体系

表１　荧光定量ＰＣＲ反应体系

Ｔａｂｌｅ１　ｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ

步骤步骤１步骤２

反应条件／℃

９５９５６０

反应时间／ｓ

３０５３０

循环数１ｃｙｃｌｅ３９ｃｙｃｌｅ

　　根据荧光定量试剂盒说明书反应体系为２×ＳＹＢＲＰｒｉｍｅｘＥｘＴａｑ１２．５Ｌ、ＰＣＲｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ１Ｌ、ＰＣＲＲｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒμμＬ、ＤＮＡ模板２Ｌ、ｄｄＨＯ８．５Ｌ。反应体系见表１。１μμμ２

　　收稿日期：２０１８－０３－１９

作者简介：雷　琼（１９７１—），女，贵州贵阳人，大专，从事包装检测食包检测。

　第９期雷　琼：荧光定量ＰＣＲ技术在食品包装材料致病菌监测中的应用

·５７·

２　实验结果

２．１　基因组提取结果图

图１　细菌基因组

Ｆｉｇ．１　Ｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｏｍｅｓ

由图１可知，细菌基因组ＤＮＡ提取结果正确，条带单一且明亮整齐，无降解。点样孔没有亮点，表明提取的基因组ＤＮＡ纯度较高，没有蛋白质和ＲＮＡ污染。核酸测定仪结果显示，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０为１．８２及１．８０，满足ＰＣＲ反应要求。

２．２　荧光定量ＰＣＲ结果图

构建标准曲线，由图２可知扩增效率为１０１．５％，Ｒ２

为０．９９。溶解峰峰型单一，无杂峰，说明无非特异性扩增。标准曲线及溶解峰结果均满足荧光定量ＰＣＲ要求，数据可信。

图２　溶解曲线及溶解峰

Ｆｉｇ．２　Ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎｃｕｒｖｅａｎｄｐｅａｋｍｅｌｔｉｎｇ荧光定量ＰＣＲ结果见图３，５～８常规样品，其扩增曲线为

直线，无Ｃ

ｔ值，无扩增效率，表明没有致病菌存在；１～４号添加标准菌株的样品，其Ｃｔ≤３５，出现明显的扩增曲线，根据试剂盒说明书判定结果为阳性，实验结果与实验设计完全一致。

图３　荧光定量ＰＣＲ结果图

Ｆｉｇ．３　ＲｅｓｕｌｔｏｆＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ

３　结果与分析

试验表明，实时荧光ＰＣＲ测定食品包装材料中致病菌的结

果为阳性，与预期结果一致。证明荧光定量Ｐ

ＣＲ技术可用于食品包装材料致病菌检测。实验结果可知，本方法具有准确度高、过程简单安全、节省人力及实验耗材、重复性好等特点，能够快速高效地测定批量的样品。

近年来，食品安全事件频发，目前检测病原细菌的方法主要是细菌学培养法，要经过富集培养、生理生化鉴定、形态观察

等。赵琢等在２

０１３年采用多重ＰＣＲ的方法对食品包装材料中对沙门氏菌的检测，取得了较为满意的检测灵敏度［８］

。本研究建立的荧光定量ＰＣＲ方法可完成对多种致病菌的检测，与传统

的细菌学培养法及普通Ｐ

ＣＲ技术相比较，步骤简单，具有更高的特异性和灵敏度，更加简便经济，具有更高的应用价值，为食品包装材料中致病菌检测提供了一种分子生物学技术，对于提升食源性致病菌的综合检测能力，满足国家食品包装及食品检验中心的建设需求具有重要意义，为今后食品包装材料的安全

性检测科研数据等奠定基础［９］

。

参考文献

［１］唐　玉，张峻岭．食品包装安全分析［Ｊ］．食品界，２０１６（６）：

２６－２７．［２］秦　蓓．塑料食品包装材料安全性研究现状［Ｊ］．包装工程，

２０１１（１９）：３３－３７．［３］ＳａｃｈｓｅＫ．ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｄｉａｇｎｏｓｔｉｃＰＣＲａｓｓａｙｓ

［Ｊ］．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００３，２１６（２１６）：３－２９．［４］雷永良，王晓光，叶碧峰，等．实时荧光定量ＰＣＲ技术在食

品污染物监测中的应用［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２００９（４）：８２８－８３０．［５］周丽民，雷永良，王小光，等．实时荧光定量ＰＣＲ技术在致

病菌检测中的应用［Ｊ］．标记免疫分析与临床，２０１２，１９（５）：２９６－２９９．［６］高　涛，张丽萍，魏　雯，等．免疫磁珠富集－实时荧光ＰＣＲ

技术在食源性致病菌监测中的应用研究［Ｊ］．医学动物防制，２０１７（１）：１８－２０．［７］张靖雯．荧光定量ＰＣＲ技术在环境微生物检测中的应用研

究［Ｊ］．智库时代，２０１７（５）：４３－４５．［８］赵　琢，栗建永，贾晓川，等．食品接触材料中沙门氏菌的多

重ＰＣＲ检测方法［Ｊ］．食品研究与开发，２０１３（２４）：１９３－１９６．［９］左泽彦，孙端方．实时荧光ＰＣＲ检测食品中牛及猪源性成

分［Ｊ］．贵州农业科学，２０１６，４４（４）：１３０－１３２．（本文文献格式：雷　琼．荧光定量ＰＣＲ技术在食品包装材料致

病菌监测中的应用［Ｊ］．山东化工，２０１８，４７（９）：５６－５７．）