・44・ 中国奶牛・2010年第7期・科技 中草药制剂对泌乳奶牛机体免疫性能的影响 陈现伟 (临沂师范学院生命科学学院,临沂 276005) 中图分类号:¥823文献标识码:A文章编号:1004—4264(2010)07—0044—03 摘要:试验采用大青叶、大黄、党参等19味中草药分别组成内服和子宫灌注制剂治疗奶牛子宫内膜炎,并采集颈静 脉血测定淋巴细胞刺激指数(SI)和中性粒细胞吞噬力,以观察中草药制剂对奶牛免疫性能的影响 结果显示.中草 药制剂均可提高奶牛免疫力,内服中草药制剂应用效果优于子宫灌注制剂(P<0.05);复方制剂优于单味中草药制 剂(P<O.05):复方中草药内服制剂可使淋巴细胞刺激指数(SI)和中性粒细胞吞噬力分别提高53.76%和4.58%(P< 0.O1):复方子宫灌注制剂可使淋巴细胞刺激指数(SI)和中性粒细胞吞噬力分别提高39.58%和1.98%(P<O.01)。 关键词:中草药;淋巴细胞刺激指数(S1):中性粒细胞吞噬力 中医药是我国的传统医学.随着人们生活质量的提 1.1.3 中草药制剂的制取 高和消费者食品安全意识的增强.对牛奶(包括肉类) 将中草药按要求称量、混合。加水浸泡2h,使药液 中抗生素、激素、农药残留等正在受到广泛关注。中草 充分渗出,加水量以浸过中药以上3~5cm为适量.然后 药属于天然药物.具有明显的抗菌消炎、改善血液循环 用电炉煎煮3次.每次30miII,每次均将药液用纱布滤 和增强子宫收缩的效果,且在畜产品中无残留、无耐药 m,将各次煎制液混合,抽滤。将中草药的抽滤液加温浓 性、无“三致”反应。如经科学的配制,将对动物疫病的 缩,使每毫升药液中含生药1g。最后将药液用洗净的生 防治起到很大的作用 目前正在积极推广应用中草药 理盐水瓶分装,置于高压灭菌锅中高压灭菌(121.3 ̄C, 防治疾病并进行开发研究 为生产无公害食品提供技术 30min),冷却后取 .放人冰箱中保存备用。 措施 为进一步了解和探讨中草药制剂对泌乳奶牛机体 1.1.4试剂 免疫性能的影响和药物作用机理特进行本试验 淋巴细胞分离液:上海恒信化学试剂有限公司,生 1 材料方法 产批号:20061106;Hanks液;RPMI1640:USA,Cat.NO. 1.1材料 31800—022; 1.1.1试验动物 肝素:中国江苏万邦生化医药股份有限公司,生产 经临床和实验室诊断确诊为子宫内膜炎的患病奶 批号:2006022486; 牛160头.分别来自山东省四个大型奶牛场f分别记为 M rr(噻唑蓝):上海源智生化科技有限公司,生产 A场、B场、C场、D场),每场各40头。 批号:2006264765。 1.1.2试验药物 1.2 方法 方剂I为单味中草药黄连制剂 1.2.1药物的临床使用方法 方剂II为复方中草药子宫灌注液制剂,药物组方为: 方剂I、Ⅱ、药物Ⅳ分别用于奶牛子宫内冲洗。方法 大青叶、大黄、明矾、益母草、红花各60g,柴胡、苦参、蛇 是先将患病奶牛保定.用l%高锰酸钾溶液清洗患牛外 床子各45g,甘草30g。 阴部.用直肠把握法以温热的生理盐水(37cI=左右)冲洗 方剂11I为复方中草药内服制剂,方剂组方为:党参 患牛子宫.将子宫内分泌物冲洗干净后.用手从直肠按 50g,白术、白芍、车前子、白扁豆、柴胡各45g,补骨脂、 压患牛子宫壁,使子宫内的残余液体排出。将药液预温 芡实各50g,赤芍、益母草各60g,甘草30g。 至37℃左右.用灭菌注射器抽取lOOmL药液.用直肠 药物Ⅳ为0.1%碘液 把握法将药液注人奶牛子宫内.每2天冲洗一次.连续 收稿日期:2009一ll—l8 冲洗3次 作者简介:陈现伟(1971一),男,山东费县人,硕士,研究方向为动物微生 方剂Ⅲ为内服制剂.使用时先将患病奶牛保定.从 态与免疫 口腔插人胃导管.待确认导管插入胃后.将37℃左右预 中国奶牛・2010年第7期・科技 温的药液经胃导管灌入患牛胃内 每次灌注量为50Ora1. 每2天用1剂.连用3次 1.2.2样品的采集方法 在用药前和用药完成后的第3天、第6天分别自奶 牛颈静脉采集各组试验牛只的血液lOmL.用肝素抗凝, 放入0~4℃的保温箱中带回实验室进行淋巴细胞刺激 指数(SI)和中性粒细胞吞噬力测定。 1.2.3淋巴细胞刺激指数(SI)的测定方法l1 I取3mL颈静脉采集的抗凝血加入到3mL淋巴细 胞分离液中,离心使细胞分层:取淋巴细胞层,用Hanks 液洗涤3次.用RPMI1640完全培养液调细胞密度为 2x106/mL 试验分对照孑L和刀豆蛋白A(ConA)刺激孔。 各设平行孔3个.按MTT法(噻唑蓝法)具体处理,在 96E全自动酶标检测仪上测定.计算刺激指数(SI),测 定其OD值。按下式计算淋巴细胞刺激指数(SI): SI= 豆蛋白A刺激孔OD均值 寸照孔OD 1.2.4 中性粒细胞吞噬力测定方法『21 用葡萄球菌吞噬法 取3mL抗凝血加入到3mL淋 巴细胞分离液中,离心使细胞分层。取粒细胞层0.5mL, 加入葡萄球菌液O.1mL,摇匀,37℃孵育40rain,每隔lOmin 振荡一次 取上清液推片.姬姆萨染色,油镜下计数100 个中性粒细胞,计算其吞噬率 吞噬率 吞噬的中性粒细胞数 +未吞噬 1.3试验分组及处理 将各场供试验用奶牛分别随机分为四组.分别记 为l、2、3、4组,每组各10头,各组分别用方剂I、Ⅱ、 Ⅲ、药物Ⅳ治疗子宫内膜炎。 1.4试验数据的统计与分析 在试验过程中对试验数据进行记录,试验结束后按 统计学方法对数据进行统计分析 2试验结果与分析 2.1 淋巴细胞刺激指数(SI)的测定结果 在对患牛在用药前1天、3次用药治疗完成后的第 3天、第6天采集颈静脉血进行淋巴细胞刺激指数(si) 的测定.测定结果见表1。 由表1可知3种方剂及药物Ⅳ在用药后的3d和 6d都可以使奶牛淋巴细胞刺激指数(SI)增加。方剂I 在用药后3d、6d使奶牛淋巴细胞刺激指数分别提高了 l1.34%和19.59%(P<O.05):方剂Ⅱ在用药后3d、6d比 用药前奶牛淋巴细胞刺激指数分别提高了32.29%和 39.58%(P(0.O1):方剂Ⅲ在用药后3d、6d使奶牛淋巴细 胞刺激指数分别提高了45.83%和53.76%(P<0.O1)。通过 方剂间的比较,以方剂Ⅲ对SI提高最为明显(P<O.05), ・45・ 表1 四场奶牛淋巴细胞刺激指数(S1)的测定结果 场别 A场 B场 C场 D场 平均 方 用药前0.89 ̄0.14 0.91 ̄0.16 1.11 ̄0.15 0.96±0.13 0.97 ̄0.15 剂用药后3d 1.01 ̄0.17 1.05 ̄0.21 1.08 ̄0.19 1.18 ̄0.20 1.08 ̄0.19 I 用药后6d 1.12 ̄0.19 1.14 ̄0.22 1.16 ̄0.23 1.21 ̄0.21 1.16 ̄0.21 方 用药前0.90 ̄0.15 0.89 ̄0.18 0.99 ̄0.20 1.04 ̄0.17 0.96 ̄0.18 剂用药后3d 1.23 ̄0.20 1.25 ̄0.19 1.31 ̄0.22 1.30 ̄0.18 1.27 ̄0.20 Ⅱ用药后6d 1.29 ̄0.26 1.3l±O.28 1.36 ̄0.31 1.40 ̄0.36 1.34 ̄0.30 方 用药前0.89 ̄0.19 0.91 ̄0.21 1.01 ̄0.19 0.92 ̄0.20 0.93 ̄0.20 剂用药后3d 1.30 ̄0.23 1.37 ̄0.21 1.41 ̄0.25 1.39 ̄0.19 1.37 ̄0.22 Ⅲ用药后6d 1.36 ̄0.25 1.45 ̄0.27 1.51 ̄0.30 1.40 ̄0.22 1.43 ̄0.26 药 用药前0.88 ̄0.18 0.93 ̄0.19 0.91 ̄0.17 0.98 ̄0.18 0.93 ̄0.13 物用药后3d 0.90 ̄0.23 1.12 ̄0.19 1.13 ̄0.21 1.16 ̄0.26 1.08 ̄0.22 Ⅳ用药后6d 0.91-+0.17 1.20 ̄0.19 1.26= ̄0.22 1.31 ̄0.23 1.17 ̄0.20 注:表中肩标为 者表示与用药前差异显著,为 者表示与用药前差异 极显著.下同 其次为方剂Ⅱ(P<O.O5)。经统计分析,各奶牛场间所使 用方剂的效果无显著性差异(P>0.05)。 2.2 中性粒细胞吞噬力测定结果 在测定奶牛淋巴细胞刺激指数的同时根据试验方 法测定中性粒细胞吞噬力,测定结果见表2。 表2四场奶牛中性粒细胞吞噬力测定结果 单位:% 场别 A场 B场 C场 D场 平均 方 用药前86.12 ̄4.82 86.59 ̄4.60 86.98 ̄3.82 86.89±4.15 86.65 ̄4.35 剂用药后3d 87.01 ̄4.13 86.64 ̄3.82 87.86 ̄5.O1 87.51 ̄4.63 87.26 ̄4.39 I用药后6d 87.64±3.76 86.51±4.15 87.07 ̄4.79 87.48±3.95 87.18 ̄4.16 方 用药前86.86 ̄3.98 86.4l+4.43 87.25 ̄4.35 88.1±4.55 87.16 ̄4.33 剂用药后3d 88.24 ̄4.18 87.15 ̄4.72 89.76 ̄4.50 88.69±5.21 88.46 ̄4.65‘ Ⅱ用药后6d 89.37 ̄4.11 88.67 ̄4.64 89.07 ̄5.37 89.46±4.8l 89.14 ̄4.73“ 方 用药前 86.91±4.46 87.O1±3.76 87.3l±4.O6 87.22 ̄4.79 87.1 1±4.27 剂用药后3d 88.87 ̄5.03 90.23 ̄4.55 90.46 ̄4.86 89.3 1±3.82 89.72 ̄5.67’ Ⅲ用药后6d 90.98 ̄4.92 90.78 ̄3.82 91.18 ̄4.27 91.46 ̄3.96 91.10 ̄4.24“ 药 用药前86.34 ̄4.77 86.43 ̄4.46 86.76 ̄3.88 85.11±5.76 86.16 ̄4.71 物用药后3d 86.01 ̄3.61 86.64±3.07 86.86 ̄4.58 86.51±2.48 86.51 ̄3.42 Ⅳ用药后6d 86.84 ̄3.12 87.0l±4.12 86.94 ̄4.04 86.o4±3.65 86.7l±3.73 由表2可以看出四种药物中以方剂Ⅲ促进奶牛中 性粒细胞吞噬力的能力最强,用药后3d、6d分别使奶 牛中性粒细胞吞噬力比用药前提高了3.O%和4.58% (P<O.O1):方剂Ⅱ分别使中性粒细胞的吞噬率提高了 1.49%和1.98%(P<O.01):方剂I用药后比用药前奶牛中 性粒细胞吞噬力差异显著(P<O.05);而药物1V(o.1%碘 液)对奶牛中性粒细胞吞噬力的作用不明显(P>0.05)。 3讨论 3.1 中草药制剂对患病奶牛淋巴细胞刺激指数(SI)的 影响 T细胞介导的细胞免疫、B细胞介导的体液免疫及单 核一巨噬细胞系统是构成宿主防御、免疫自稳和免疫监视 功能的j个基本要素网 T淋巴细胞在非特异物质刺激下. 可被激活.向淋巴母细胞转化.在转化过程中DNA、RNA 及蛋白质合成增加.使细胞分裂增殖 而淋巴细胞担负机 体特异性免疫功能.淋巴细胞的繁殖与分化能力大小是 ・46・ 中国奶牛・2010年第7期・科技 机体特异性免疫功能强弱的一个重要衡量标准 试验 弱 研究认为,某些中药可增强此免疫作用 n】。现代药 理研究证实.党参能增强网状内皮细胞系统的吞噬功 采用MTr法 在酶标仪上测定其增殖情况 因Mrrr(噻 唑兰)是线粒体脱氢酶的底物.可被酶分解产生蓝黑色物 质.该物质的多少与激活的淋巴细胞数成正相关 中草药对患病奶牛的淋巴细胞转化有一定的促进 作用.并且以复方中草药内服制剂效果最好 方剂中所 使用的党参、白术、白芍、补骨脂经现代药理学证明具 有激发、促进免疫,提高淋巴细胞转化率的作用。据李 仪奎[51报道党参能刺激骨髓造血 王秋芳I ̄2002年报道、 白芍具有激活免疫细胞并引起淋巴细胞增殖的功效 Gallorini等 认为柴胡能诱导干扰素的产生.有免疫调 节作用.它能提高天然杀伤细胞和杀伤细胞的活性.对 肿瘤免疫和抗感染免疫都有用.还能提高杀伤细胞活 能:补骨脂中的补骨脂素具有提高小白鼠腹腔巨噬细 胞的吞噬率 特异性与非特异性免疫相互促进.病原微生物侵入 机体后.在激发免疫应答以前即可被单核巨噬细胞吞噬 并清除.在致病微生物激发机体产生特异性抗体后.覆盖 于病原体表面的IgG及补体激活片断C3b可与MPS细 胞表面的FcR及CR 结合,发挥调理作用,使病原体更 易被吞噬…】 本试验中中草药制剂对中性粒细胞吞噬力 的影响.其一是直接加强了中性粒细胞的吞噬力.其二 是刺激了淋巴细胞的增殖.通过抗体及补体等成分的作 用使中性粒细胞的吞噬力进一步加强 4小结 性而增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC) 柴胡能够促进巨噬细胞生成IL一1.而IL一1产生后IL一2 的生成也加强,而后者有利于 一干扰素的生成。中药 多系按照中医理论组方用药.复方是中药的精髓.最能 中草药制剂可显著提高患子宫内膜炎奶牛的淋巴 细胞刺激指数(SI)和对中性粒细胞的吞噬力.提高奶 牛的免疫力.其中以复方中草药的应用效果优于单味中 草药制剂,内服效果优于子宫灌注。 参考文献 体现中医用药特色。金虹报道_8I.中药复合多糖可使雏 鸡淋巴细胞百分率和ANAE+淋巴细胞百分率、外周血 中性粒细胞吞噬率和吞噬指数、腹腔巨噬细胞吞噬率和 吞噬指数、首免和二免后ND—HI抗体效价、法氏囊和 胸腺及脾重量、红细胞一C3b花环率和红细胞一IC花环率 明显升高.中药复合多糖能使环磷酰胺所造成的免疫抑 制逆转至正常水平.作为免疫增强剂.具有很好的研究 价值与应用前景 3.2 中草药制剂对患牛中性粒细胞吞噬力的影响 中性粒细胞有很强的变形运动和吞噬能力.趋化 【l】陈德坤,党岩,等.可溶性CD2分子及其配体的功能研究【J1.中国兽医科技. 1998,28(4):9—11. 121张淼涛,马新武,等.中草药对隐性乳房炎奶牛细胞免疫力的影响 动物医学进展. 2000,21(4):148—149. [31李映丽,吴万兴,等.魔芋甘露聚糖免疫作用的研究[Jj-陕西林业科技,l999(增刊): 68—70 【4]胡松华.谈奶牛乳腺的免疫机能【J1.中国奶牛,1997,5:53—55. [5】李仪奎.中药【M] 海.-上海中医药大学出版社,1995:346. [61王秋芳,张淼涛,等.中药对隐性乳房炎奶牛细胞免疫功能的影响[JJ畜牧兽医学报, 2002,33(4),408—41 1. 【7]Gallorini A,plebani M,pontisso P,et a1. [8]金虹,王建华.从IL一2水平探讨黄芪及黄芪多糖的免疫调节作用fJ1.中国免疫 学杂志,1989,(5):308—310. 性强。能吞噬侵入机体的细菌或异物 中性粒细胞内 含大量溶酶体酶.能将吞噬入细胞内的细菌和组织碎 片分解.在非特异性免疫中有十分重要的作用.其吞 噬力的大小。在一定程度上反映着细胞免疫功能的强 [91 吕曙华,朱永智,吴寿金.内蒙黄芪地I二部分黄酮成分的研究【J1.中草药品,1990, f61:9—10. [】o]杜志德,来玉梅黄芪的免疫作用研究进展[J1.中草药,1988,9,4o-42. 『1 11龙振洲.医学免疫学『M1.北京:人民卫生出版社,1998.6. ’ The Influence of Chinese Traditional Herbal Drugs on Milking Cow’S Immunity CHEN Xian-wei (College of Life Science,Linyi Normal University,Linyi 276005) Abstract:In order to observe effect of cow’s immunity from Chinese medicinal herb,the study treated endometritis of cows by oral intake and infusing preparation from Folium Isatidis,Radix et Rhizoma Rhei,Radix Codonopsis et 19 Chinese traditional herbal drugs,and detected the lymphocyte stimulation indices(SI)and Phagocytic power of neutrophi.The result showed that Chinese traditional herbal drugs could improve the cow’s immunity.The effect of drugs by orla intake was better than that of infusingfP<0.05).The Co-Chinese medicinal herb preparation grinds was better than single Chinese medicinal herb preparation(P<0.05).The lymphocyte stimulation indices and the Phagocytic power of neutrophil increased 53.76%and 4.58%(P<0.01)respectively by oral intake the Co—Chinese medicinal herb preparation, the above two indices increased 39.58%and 1.98%(P<0.01)respectively by infusing uterus. Key words:Chinese traditional herbal drugs;Lymphocyte stimulation indices(SI);Phagocytic power of neutrophil