基因工程TNF菌种稳定性观察

基因工程TNF菌种稳定性观察

许丽锋　刘德郁　张振龙　赵秀芬　王京玲　倪道明

(卫生部北京生物制品研究所,北京　100024)

摘　要　对重组的pRL-hTNF/Jm103工程菌菌种按规程进行了50代传代,并进行了一系列检测,结果表明:我们目前所用的工程菌经50代传代后,用还原型SDS-PAGE电泳其表达量占菌体蛋白的7.8～8%,生物学活性为7.8×105-1.7×106IU/ml,与原代菌种基本一致。一般生物学性状如革兰氏染色及质粒内切酶图谱与原始菌种无变异。电镜检查经传代的工程菌与原始菌种形态一致,菌体内部结构相同,无支原体、病毒样颗粒及其它微生物污染。

关键词　肿瘤坏死因子(TNF)　基因工程表达　菌种传代分类号　R730.4

pRL-hTNF/Jm103waspreparedfor50generalionsandtest　XuLifeng,etal　NationalVaccineandSerumInstituteBeijing100024

Abstract　50generationsofpRL-hTNF/Jm103wereproduced,andthecharacteristicsofexpres-sionproductofhTNF-󰀁weretested.TheexpressionleverofhTNF-󰀁accountedfor8%oftotalpro-tein.Itsbiologicalactivitywas7.8×105-1.7×106IU/ml.Theseresultsaresimilarwiththatofthepri-maryculture.Thegeneralbiologicalcharacteristicsofthe50thgeneration,suchasGramslain,eleclronicmicroscopeobservalionandtherestrictionmapoftheplasmidarealsosimilarwiththatoftheprimaryculture.

Keywords　TNF　GeneExpression　Strainpassage

　　肿瘤坏死因子(TNF)是宿主革兰氏阴性菌感染免疫的介质之一,主要由活化的单核巨

1〕

噬细胞产生,具有广泛的生物学作用〔,其主要

达hTNF-󰀁的中试工作。为适应基因工程产品

扩大生产及确保生产用菌种的稳定性,我们对TNF工程菌菌种进行了50代人工传代,并进行了必要的检测。1　材料和方法

1.1　菌种

pRL-hTNF/Jm103菌种含TNF󰀁全长cDNA,原核表达载体pJLA501含Amp抗性和PRPL启动子,宿主菌大肠杆菌Jm103。上游构建由复旦大学遗传所完成。

1.2　菌种传代方法

在含Amp100󰀁g/ml的LB(1%蛋白胨,0.5%酵母抽提物,1%氯化钠,2%琼脂粉)固体平皿上划线传代,30℃培养24小时挑起单菌落继续划板,每传一次计作一个代次,传50代次,中间每10代次收取甘菌种备检测用。生物学活性是杀伤肿瘤细胞,免疫调节及参与炎症和发热反应。可与多种细胞因子协同作用,激活巨噬细胞和多核细胞,促进Ⅰ类MHC分子的表达,以此促进细胞毒T淋巴细胞介导的抗病毒作用。也有实验证明TNF体内可诱导介素-7受体及介素-3、介素-6及TNF受体、

GM-CSF的表达从而起到对骨髓的保护作

2〕用〔。因其在体内外可对多种肿瘤细胞产生特

异性杀伤作用,而被认为是一种很有潜力的抗癌药物。近年来对其功能的研究比较透彻,其表达也多采用基因工程重组方法将TNF基因重组入适当的质粒中在大肠杆菌中进行。我们与上海复旦大学合作进行了用基因工程方法表〔3〕

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　微生物学免疫学进展1997年第25卷第3期10

1.3　外源基因在大肠杆菌中的表达

取原代菌种、10代、20代、30代、40代、50代菌种分别接种含Amp100󰀁g/ml的LB培养基试管30℃摇动培养过夜,次日晨1%量转种大三角瓶TB培养基(1.2%蛋白胨、2.4%酵母抽提物、0.017MkH2PO4、0.072MK2HPO4、0.4%甘油)30℃摇动培养A600(吸光度值,原为光密度OD值)为0.8-1.0时,移入42℃水浴升温诱导培养4-5小时,离心收集菌体,生理盐水洗2次,-30℃,冻存。

1.4　肿瘤坏死因子的活性测定及SDS-PAGE电泳

活性测定方法采用在放线菌素D存在下,TNF对L929细胞的细胞毒性方法。还原型SDS-PAGE电泳,分离胶浓度为12.5%,浓缩胶浓度为5%,100V恒压,约1小时拆胶,考马斯亮蓝R250染色1小时后脱色至本底透明,封胶。1.5　电镜观察

取Jm103宿主菌,原代菌及经传代的各代收集菌种,分别接种LB培养基,30℃培养4小时收集菌体,生理盐水洗3次后,少量盐水悬起,制片,电镜下观察。1.6　革兰氏染色

取原代及各传代菌种30℃培养4小时收集菌体,生理盐水洗两次。常规方法制片并进行革兰氏染色,经升温诱导表达4-5小时的菌体也以同样方法制片染色后,光学显微镜下观察。1.7　质粒检查

采用碱裂解方法分别提取原代菌种、10代菌种、50代菌种的质粒,经Sepherose4B柱纯化后,少量恢复,备酶切鉴定。

性内切酶Ndel、EcoRI、PvuⅡ购自Promega

公司。酶切方法按产品说明书进行。

2　结果与讨论

现存由复旦大学遗传所提供的pRL-hT-NF/Jm103在含30%甘油的液体培养基中-70℃保存两年菌体活化后生长状况良好。

原始菌株经在含100󰀁g/mlAmp的固体培养基中传代50代次后菌落呈典型的大肠杆菌集落即直径2-3mm、圆型隆起、无色的光滑型菌落,无其他杂菌生长。各代菌种经4小时培养,收集菌片,革兰氏染色光学显微镜下见革兰氏阴性、短杆菌、形态均匀一致,未见杂菌。

菌种经50次传代仍保留当初建株时的Amp抗性;经电镜观察菌体呈典型的大肠杆菌形态与宿主菌无变异、细胞壁完整、菌体内部结构与原代菌种一致无支原体、病毒样颗粒及其它微生物污染。

传代的菌种与原始菌种同时经同种条件诱导表达收集菌体,生理盐水洗两次,再用相同量生理盐水悬浮后超声裂解细菌,做生物学活性测定,三次重试结果见表1。SDS-PAGE电泳在分子量为1.7万处可见约占菌体蛋白量7-8%的表达带,各代次间无明显差异,扫描结果为:原代7.8%,10代7.4%,20代7.6%,30代7.4%,40代8%,50代7.7%。

表1　原代及传代后不同代次表达产物生物学活性检测结果*

Table1BiologicalactivityofTNF

Primarygeneration7.8×1051.7×1061.7×106

thetenthgeneration7.8×1051.7×1061.7×106

thetwentiethgeneration7.8×1051.7×1067.8×105

IU/ml

　　*UsingSigmarhTNF-󰀁(TO157)asreferencestandard.It󰀁sactivitywas2×107IU/mgor1×105IU/ml

thethirtiethgeneration7.8×1051.7×1067.8×105

thefortiethgeneration7.8×1057.8×1051.7×106

thefiftiethgeneration7.8×1051.7×1067.8×105

Groups

thefirstthesecondthethird

　　质粒检测:抽提原代菌种、10代菌种、50代菌种质粒,分别经Sepherose4B柱纯化后进行酶切鉴定:󰀁分别用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切后,1%琼脂糖电泳为约480bp和4.9kb的两微生物学免疫学进展1997年第25卷第3期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　11

条电泳带;󰀁分别用PVuⅡ酶切后1%琼脂糖电泳可见约230bp和5.15kb的两条电泳带。由于原始质粒构建过程中TNF基因经Ndel和EcoRI重组入表达质粒pJLA501,TNF基因为480bp,在其139位和373位分别含有两个PvuⅡ酶切位点,所以酶切初步鉴定结果为经传代后的工程菌保留原重组质粒,质粒内携带全部TNFcDNA基因片段与构建时酶切图谱一致。

基因工程产品中菌种稳定性是关键的一环,目前国内外生物技术产品对菌种库有比较

5〕

严格的质控标准〔。本课题得到“863”的资助,经实验结果表明,我们目前中试所用的pRL-hTNF/Jm103菌种可稳定携带外源基因至50次人工传代,其生物学性状,外源基因表达量及

质粒内切酶图谱不变。3　参考文献

1　OLdLJ.Tumornecrosisfactor(TNF).Science,1985,230(4726):630

2　HeiligB.andMaparaM.etal,TNFalphatherpyactivateshumanB-lymphomacellJ.old

3　ThomasH.andBalkwillFR.OthereffectsofIFNandoth-ercylokinesonlumorsinanimals:Arewiew.PharmacTher,1991,52(3):307-310

4　SanbrookJ.etal.Molecularcloning:AlaboratoryManual,coldSpringHarbarLaborotory,NewYork19

5　中华人民共和国卫生部《中国生物制品规程》一部1995年版:257

(收稿　1997-04-07　　修回　1997-07-18)

in

vivoandmayprotect

myelopoiesisleukRes.1992Aug;16(8):769-73.Lloyd