淋巴细胞分层液有两种 (1)

淋巴细胞分层液有两种

（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。应用时，用蒸馏水配制9％溶液。泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名Vrografin，结构式为3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量为60％或75％，每安瓶为20ml装，常用于人的脏器造影。应用时，取60％泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15.38ml，即为33.9％泛影葡胺。 1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制： 9％聚蔗糖液 24份 33.9％泛影葡胺液 10份

混合即可。必要时，可测比重。需要备用，可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min，4℃保存。一般可保存3个月。 （2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液 34％泛影葡胺液 10份 60％右旋糖酐液 12.5份

混合，即为比重1.07～1.09的分层液。分装于棕色瓶中，4℃冰箱保存备用。 一、淋巴细胞分离

人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，根据不同试验有相对纯度，尽最大可能保持细胞应有活性。分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。本文介绍常用的密度梯度离心法的原理及方法。

人外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.074±0.001。密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的带，从而达到分离的目的。

常用的分层液有Ficoll，Ficoll是一种合成性蔗糖聚合物的商品名，无毒，但高浓度溶液往往不等渗，且粘性高，易使细胞聚集，常使用60g/L低浓度溶液（密度1.020）加入泛影葡胺（Hypague），应用浓度为340g/L（密度1.200），以泛影葡胺适当比例与Ficoll混合，可配制成比重合适的细胞分层液（密度1.077±0.001）。称为Ficoll-Hypague分层液或称淋巴细胞分离液。 【材料】 1、抗凝管。

2、淋巴细胞分离液(有商品供应，比重1.077±0.001）。 3、无Ca++、Mg++、Hank's 液（D-Hankl's ）。 4、刻度吸管、毛细吸管、离心管、离心机等。 【方法】

1、采静脉血2ml加入抗凝管，轻轻摇动试管，混匀，5min后加入Hank's 液2ml，手动轻轻摇匀。

2、将抗凝血全部沿管壁缓慢加至另一含2ml淋巴细胞分离液管的液面上，注意保持两种液体界面清晰。

3、将试管平衡后置水平式离心机，1000rpm离心20min。

4、用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处淋巴细胞层至一刻度离心管内。 5、加入5倍体积的Hank's液，手动旋转试管使液体混匀，1000rpm离心10min，弃上清，沉淀即主要为淋巴细胞（或单位个核细胞）。加入含10%灭活小牛血清Hank’s液1 ml，混匀后进行计数。

（备注：如做淋巴细胞转化或其它培养，所用试剂、器材应是无菌的。尚需细胞存活率检查，见下页。） （一）T、B细胞分离技术

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为了深入研究T、B细胞的生物学特性和功能，需从淋巴细胞群中分离出单一的T细胞或B细胞。根据T、B细胞膜表面标志及粘附能力等不同。可将二者加以分离。常用的方法有E花结形成法，尼龙棉柱法、免疫吸附法、免疫磁珠分离法等。应用流式细胞仪可以分离出均质性的单一细胞类型或细胞亚群。 花环沉降法分离T细胞

绵羊红细胞（SRBC）能与人类T细胞形成E花环。经溴化二氨基异硫基异硫脲氢化物（AET）处理的SRBC，能与T细胞形成稳定而巨大的E花环。用淋巴细胞分离液分离时，AET-E花环沉于管底，在分离液界面的淋巴细胞为B细胞；沉于管底的AET-E花环经低渗溶液溶解花环周围的SRBC，即可获得纯的T细胞。 【村料】

1、AET溶液。

2、绵羊红细胞悬液。 3、淋巴细胞分离液。

4、含10％小牛血清、10培养液。 5、Hank's 液。 6、生理盐水。

7、单个核细胞悬液。 【方法】

1、用AET处理SRBC：取绵羊红细胞悬液，加入Hank's 液，轻轻摇匀，1500rpm离心5min，共3次。取一份压积的SRBC，加入4份新配制的AET液混悬，置于37℃水浴15min，不断摇匀。加入冷生理盐水，混匀，1500rpm离心5min，并5次。观察无溶血，细胞凝集后，加入含小牛血清的10培养液，混匀，离心同上。在1份SRBC中加入9份含10％小牛血清的10培养液制成AET-SRBC悬液； 2、用含10％小牛血清的10培养液稀释AET-SRBC悬液至l％AET-SRBC； 3、取2×106个单个核细胞/ml与等量1％AET-RBC混合，37℃水浴15min后，1000rpm离心5min，再静置于4℃水箱45min； 4、用毛细吸管轻轻吹吸，使细胞散匀；

5、将细胞轻轻沿管壁铺于具有等量淋巴细胞分离液的试管液面上； 6、2000rpm水平式离心20min，沉于管底者为AE－SRBC花环；

7、取管底细胞，加入Hank's液，混匀后2000rpm离心10min，沉淀中加入3ml双蒸水，立即加入1ml 3.5％氯化钠溶液，500rpm离心5min，沉淀即为T细胞。 尼尤棉柱法分离T、B细胞

B细胞在37℃时易粘附于尼龙棉（聚酰胺）纤维上，而T细胞不具此能力，从而可将T、B细胞分离。 【材料】

1、Hank's 液。

2、RBMI 10培养液。 3、小牛血清。

4、单个核细胞悬液1ml，含细胞2~3×107。 5、聚乙酰塑料管或1ml注射器等。 6、尼龙棉纤维。 【方法】 1、尼龙毛柱的制备：称取尼龙毛50~70mg，细致地撕开，使其松散均匀，用Hank's液浸透后装入聚乙烯塑料管或注射器，柱高约2cm。

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2、取单个核细胞，用含10％小牛血清的10培养液制成细胞悬液。 3、用Hank's液和含20％小牛血清的10培养液各5ml洗柱，流速约1~2ml/10秒。

4、将1ml细胞悬液上柱，放37℃温箱置1ml。 5、用预温37℃含小牛血清的培养液5ml洗脱，收集洗脱液，2000rpm离心20min，沉淀即为T细胞，纯度达90％左右。

6、用冷10培养液5ml冲洗柱床，边洗边挤压塑料管，收集洗脱液，2000rpm离心20min，沉淀即为B细胞，纯度达80％左右。 附：细胞计数方法：

A加样：将淋巴细胞悬液混匀，吸取10μl加入到40μl含10%灭活小牛血清的Hank’s液中，混匀后再吸取10μl加入到血细胞计数板上。

B加盖玻片：取盖玻片轻轻覆盖于标本上，静置片刻，置显微镜下计算淋巴细胞数。具体计数方法如下：

C计算血细胞计数板上四个角的四个大方格中淋巴细胞总数。

计算：按下列公式求出单个核细胞总数。 四个大方格中单个核细胞总数

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6、细胞存活率检测：取10μl淋巴细胞悬液加入0.4%台盼蓝染色液10μl，混

单个核细胞总数=

×稀释倍数×细胞悬液毫升数

匀。取10μl加入血细胞计数板，静置片刻，置显微镜高倍镜下观察。 【结果判定】

活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入细胞内，故死细胞被染成蓝色，死细胞体积较大，无光泽。正常情况下，活细胞存活率应在95%以上。

计数200个细胞中的死亡细胞数并计算其存活率：

细胞存活率=

活细胞数

×100%

二、淋巴细胞抗原片制备 活细胞数+死细胞数

1、将分离得到的淋巴细胞以RPMI 10培养液配成1x105—106/ml细胞悬液； 2、将细胞悬液用毛细吸管轻轻将细胞滴吹铺于玻片，约1cm2

3、以冷风吹干，根据不同的目的分别以冷丙酮、冷甲醇、10%中性缓冲甲醛液固定5—15min，冷风吹干后，细胞片密封置-20℃以下低温保存备用。

中，斜面放置试管，静止30min后，用竹签将血块轻轻剥离管壁，2000rpm离心20min，用毛细吸管吸取上清（血清）于eppendorf管中保存，4℃冰箱备用。

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