维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期（总第８７） ２００７年４月 中国林副特产 Ｆｏｒｅｓｔ Ｂｙ—Ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ ｉｎ Ｃｈｉｎａ Ｎｏ．２（ＧＳＮＯ．８７） Ａｐｒ．２００７ 肽类天然防腐剂产生菌一Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株培养基成分的研究 么宏伟 ，雷虹 ，聂怀林。，冯磊 ，吴洪军 ，张磊 ，谢晨阳 ，赵凤臣 （１．黑龙江省林副特产研究所，黑龙江牡丹江１５７０１１；２．黑龙江大学生命科学学院；３．东宁县计量检定测试所） 摘 要：对小分子肽产生茵的发酵培养基成分进行研究。小分子肽的生物合成主要受碳源、氮源、磷源 和金属离子的。本文主要对各种不同的有机氮源、无机氮源进行了试验，发现以２ 蛋白胨作为氮 源效果最好，另外还对发酵培养基中氯化钠的添加量进行了试验，氯化纳的添加量为２０ｇ／Ｌ抑茵效果最 好。此外，添加复合维生素对小分子肽的产生无显著促进作用。在对种子培养基的优化中，以茵体的生 长速率为标准得到最佳组合为葡萄糖２ 、酵母膏１ 、牛肉膏１ 、Ｃａ抖０．０００５ ｍｏｌ／Ｌ、Ｍｎ抖０．０００２５ ｍｏｌ／Ｌ、吐温０．５ｍｌ／Ｌ。 关键词：乳酸茵；小分子肽；发酵；氮源 Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉ０ｐｒｅｓｅｒＶａｔｉＶｅ Ｙａｏ Ｈｏｎｇｗｅｉ ，Ｌｅｉ Ｈｏｎｇ２，Ｎｉｅ Ｈｕａｉｌｉｎ３，Ｆｅｎｇ Ｌｅｉ ，Ｗｕ ａｏｎｇｊｕｎ ， Ｚｈａｎｇ Ｌｅｉ ，Ｘｉｅ ｃｈｅｎｙａｎｇ ，Ｚｈａｏ Ｆｅｎｇｃｈｅｎ （１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｆｏｒｅｓｔ ｂｙ－ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉｎｇ ａｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉｎｇ，ａ Ｍｕｄａｎｊｉｎｇ，１５７０１１；２．Ｔｈｅａ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｅｉ ｌｏｎｇｊｉｎｇ ａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ； ３．Ｄｏｎｇｎｉｎｇ ｍｅａｓｕｒｅｍ ａｎｄ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｓｔｅｉｎｇ ｓｔａｔｉｏｎ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｅｅｍｓ ｔＯ ｂｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｍｅｔａｌ ｈｙｄｒｏｎｉｕｍ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｎｔｒｏ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｒｅｓｏｕｃｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｔＯ ｐｒｏｍｏｔｅ ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．２ ｐｅｐｔｏｎｅ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＮａＣ１ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒ— ｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｔｏｏ，ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｉｔ ｉｓ ２０ｇ／Ｌ．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ，ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｖｉｔａｍｉｎｓ ｗａｓ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｈａｓ ｎｏ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ｓｅｅｄ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｂ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７，ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ２ ｇｌｕｃｏｓｅ，１ ｍｉｃｒｏｚｙｍｅ，１ ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ，０．０００５ｍｏｌ／Ｌ Ｃａ抖，０．０００２５ ｍｏｌ／Ｌ Ｍｎ２ ，０．５ｍｌ／Ｌ ｔｗｅｅｎ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄ：ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ；ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ １前言 天然防腐剂中研究最早最透彻的是乳酸链球菌素（Ｎｉ— 防腐剂（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）是指为防止食品、变质， 延长食品保存期、抑制食品中微生物繁殖的物质ｎ］。 大致可分为化学防腐剂和天然防腐剂。目前，我国及 其它发展中国家仍然普遍使用化学防腐剂，这对人体 或多或少地会产生毒害作用０］。随着人们生活水平的 ｓｉｎ），也称乳链菌肽，Ｎｉｓｉｎ在乳制品、酿造业、制药业等 工业中的应用已充分展示了其作为生物防腐剂的作 用Ⅲ。 据研究发现，未经灭菌的Ｌ－乳酸菌发酵的酸菜在 常温下保质期长达１．５年之久，经实验证明发现其可 能为一种在食品中具有较好防腐作用，而在体内可被 分解为氨基酸的高安全性的小肽类物质极具研发价 值，对提高我国的天然防腐剂的技术含量和推进我国 提高，健康意识不断增强，倡导安全、营养的绿色消费 观念已深入人心，因此安全高效的天然食品防腐剂取 代或部分取代化学防腐剂已成为一种趋势［３］。微生物 收稿日期：２００６一ｌ１—１２ ４ 维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７年 么宏伟等：肽类天然防腐剂产生茵一Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株培养基成分的研究 第２期 的绿色食品发展战略的发展都具有十分重要的意 义 。 好的培养基浓缩１Ｏ倍，用移液吸取１１０￣１进行点 样，最后将平板置于３７℃的培养箱中培养１２ｈ后，测抑 菌圈大小。 ２．２．３发酵培养基成分优化 ２．２．３．１ 发酵培养基成分优化结果的对比。 ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株经平板、种子培养基活化、扩大 培养后，按３ 的量接入各优化后的培养基，３Ｏ℃静止 培养４８ｈ后，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后测定ｐＨ值，剩 余培养基１Ｏ倍浓缩后，双层检测平板法检测抑菌效 本实验经过对小分子肽产生菌的不断筛选，获得 的Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７乳酸菌菌株的抑菌 效果比较好，适用于发酵条件的优化，诱变育种，原生 质体融合等实验。为了使Ｌｂ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７乳酸 菌菌株能够高产，本实验进行了发酵条件优化的研究。 本试验从有机氮源、无机氮源和其他氮源等方面出发， 对Ｌｂ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７乳酸菌菌株的发酵培养基成 分进行了优化，得到了最佳发酵培养基配方，以及通过 正交实验得到了最佳种子培养基配方，为进一步的研 究及生产工作奠定良好的基础。 ２材料与方法 ２．１材料 ２．１Ｉ １供试菌种及来源 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株：齐齐哈尔丰 源食品公司提供的酸菜发酵液中分离得到。 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）：黑龙江省科学 院应用微生物研究所提供。 ２．１．２培养基 Ｍ 培养基 、牛肉膏蛋白胨培养基 、素琼脂培 养基、发酵培养基（１Ｌ）：豆芽１５０ｇ，番茄２００ｇ，白菜 ２００ｇ，蔗糖２０ｇ，ＮａＣ１ ２０ｇ，蛋白胨２０ｇ，蒸馏水１０００ｍｌ （Ｏ．１５ＭＰａ，灭菌２０ｍｉｎ）。种子培养基：葡萄糖２ 、酵 母膏１ 、牛肉膏１ 、Ｃａ ０．００１ｍｏｌ／Ｌ、Ｍｎ ０．０００５ ｍｏｌ／Ｌ、吐温０．５ｍｌ／Ｌ、ｐＨ６．８ ２．２ 方法 ２．２．１培养方法 刮半环 ． ｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株到Ｍ６培养基 上，恒温３Ｏ℃厌氧培养４８ｈ。将２环 ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株刮入ｌｍｌ无菌水中，混匀后转入３０ｍ１种 子培养基中，恒温３Ｏ℃培养２４ｈ。在１００ｍｌ发酵培养 基，以３ 的接种量接人种子培养基，恒温３Ｏ℃培养 ４８ｈ。 ２．２．２分析方法 ２．２．２．１ 培养基菌体浓度的测定。用ＵＶ７７５Ｂ型分 光光度计在５２０ｎｍ处测定培养４８ｈ后的培养基的光 密度，即ＯＤ值。 ２．２．２．２培养基ｐＨ值的测定。用ＰＨＳ－２５型标准酸 度计测定离心（４０００ｒ／ｍｉｎ，ｌＯｍｉｎ）后的培养基的ｐＨ 值。 ２．２．２．３双层检测平板法。在无菌平皿中倒入２０ｍｌ 加热融化的素琼脂（２％），待其充分冷却凝固后，按一 定次序摆放整齐数个已灭菌的牛津杯。将分装于三角 瓶中的３０ｍｌ融化的指示菌培养基冷却至５ｏ℃左右， 加入稀释后的指示菌（枯草芽孢杆菌）菌悬液２ｍｌ，迅 速混合均匀，倒入平板。冷却后，用无菌镊子取出牛津 杯。此平板为小分子肽抑菌效果的检测平板。将培养 果。各优化的培养基成分见表２—１。 表２—１ 发酵培养基优化成分表 单位： Ｌ ２．２．３．２不同有机氮源对小分子肽产量的影响。将 发酵培养基中的蛋白胨分别用２％牛肉膏、２ 酵母膏 等有机氮源进行替换，配制各培养基，同时以发酵培养 基和不加蛋白胨的发酵培养基作对照。 ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株经平板、种子培养基活化、扩大培养后，按 ３ 的量接入各培养基，３Ｏ℃静止培养４８ｈ后，４０００ｒ／ ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后测定ｐＨ值，剩余培养基１Ｏ倍浓缩 后，双层检测平板法检测抑菌效果。 ２．２．３．３不同无机氮源对小分子肽产量的影响。将 发酵培养基中的蛋白胨分别用０．４％（ＮＨ。）。ＳＯ。及含 氮量相等的ＮＨ。Ｃ１、ＮＨ。ＮＯ。、（ＮＨ。）。ＣＯ。、ＮａＮＯ。、尿 素等无机氮源替换，配制各培养基，同时以发酵培养基 和不加蛋白胨的发酵培养基作对照。 ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株经平板、种子培养基活化、扩大培养后，按 ３ 的量接入各培养基，３Ｏ℃静止培养４８ｈ后，４０００ｒ／ ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后测定ｐＨ值，剩余培养基１Ｏ倍浓缩 后，双层检测平板法检测抑菌效果。 ２．２．３．４不同其他氮源对小分子肽产量的影响。将 发酵培养基中的蛋白胨分别用２Ｏ 牛肉汤、５Ｏ 豆 浆、等作为唯一氮源进行替换，配制各培养基，同时以 发酵培养基和不加蛋白胨的发酵培养基作对照。 ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株经平板、种子培养基活化、扩大 培养后，按３ 的量接入各培养基，３Ｏ℃静止培养４８ｈ 后，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后测定ｐＨ值，剩余培养基 １Ｏ倍浓缩后，双层检测平板法检测抑菌效果。 ２．２．３．５ 氯化钠不同浓度的小分子肽产量的影响。 将发酵培养基中的氯化钠成分，按１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／ Ｌ的梯度，分别作成培养基，Ｌｂ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌 株经平板、种子培养基活化、扩大培养后，按３ 的量 接入各培养基，３Ｏ℃静止培养４８ｈ后，４０００ｒ／ｍｉｎ离心 １０ｍｉｎ后测定ｐＨ值，剩余培养基１Ｏ倍浓缩后，双层检 测平板法检测抑菌效果。 ２．２．３．６复合维生素不同浓度对小分子肽产量的影 ５ 维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７血 中 国 林 副 特 产 第２期 响。将等量的维生素Ｂｌ、Ｂ２、 、Ｂ 、Ｂ 。、ＢＨ混合制成 复合维生素，分别按０ｇｇ／Ｌ，１０ｇｇ／Ｌ，２０ｇｇ／Ｌ的量，用 细菌滤器打入以灭好的发酵培养基中，作为培养基使 用。Ｌ６．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株经平板、种子培养基活 依据本实验室人员对发酵培养基组分做正交实验 所得的两种优化结果，做进一步的优化验证。将优化 出的两种发酵培养基，各自培养Ｌ６．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７ 菌株后，测得ｐＨ值和抑菌效果见表３—１。 表３－１发酵培养基成分优化的对比 化、扩大培养后，按３ 的量接入各培养基，３Ｏ℃静止 培养４８ｈ后，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后测定ｐＨ值，剩 余培养基１Ｏ倍浓缩后，双层检测平板法检测抑菌效 果。 ２．２．４种子培养基成分的优化（正交试验） 以种子培养基为基础进行培养基成分的优化，设 置葡萄糖、酵母膏和牛肉膏、Ｃａ。 和Ｍｎ 、吐温８Ｏ四 个因子，每个因子设计三个水平，因子、水平设计见表 ２－２，试验方案见表２—３。 表２－２种子培养基成分的优化正交试验的因子 与水平表 表中结果可看出，优化一、优化二均能促进Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株产小分子肽，但产量有明显差 别，优化一抑菌圈直径最大，说明优化一的配方较好。 ３．１．２不同有机氮源对小分子肽产量的影响 将发酵培养基中的蛋白胨分别用２ 牛肉膏、２ 酵母膏等有机氮源进行替换，配制各培养基，同时以发 酵培养基和不加蛋白胨的发酵培养基作对照，各培养 基培养Ｌ６． ｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株后，测得ｐＨ值和抑 菌效果见表３—２。 表３－２ 有机氮源培养基ｐＨ值和抑菌效果 表２—３种子培养基成分的优化正交试验的试验方案 葡萄糖 组合１ １ １ １ 吐 １ 组合２ 组合３ 组合４， 组合５ 组合６ １ １ ２ ２ ２ ２ ３ １ ２ ３ ２ ３ ２ ３ １ ２ ３ ３ １ ２ 组合７ 组合８ 组合９ ３ ３ ３ １ ２ ３ ３ １ ２ ２ ３ １ 图３一ｌ 有机氮源培养基ｐＨ值和抑菌效果图 由表中结果可看出，蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等有 机氮源源，均能促进Ｌ６． ｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株产小分 子肽，但产量有明显差别，其中２ 蛋白胨的抑菌圈直 径最大，说明作为氮源优于其它有机氮源。 ３．１．３不同无机氮源对小分子肽产量的影响 将发酵培养基中的蛋白胨分别用０．４ （ＮＨ ）。ＳＯ，及含氮量相等的ＮＨ Ｃ１、ＮＨ ＮＯ。、 （ＮＨ ）。ＣＯ。、ＮａＮＯ。、尿素等无机氮源替换，配制各培 养基，同时以发酵培养基和不加蛋白胨的发酵培养基 作对照。各培养基培养Ｌ６．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株后， 测得ｐＨ值和抑菌效果见表３—３。 Ｌ６．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株经平板、种子培养基活 化、扩大培养后，按３ ９／５的量接入各培养基，３Ｏ℃静止 培养４８ｈ后，光电比浊法在５２０ｎｍ波长下测定培养基 ＯＤ值、４０００ｒ／ｒａｉｎ离心１０ｒａｉｎ后测定ｐＨ值，剩余培养 基１Ｏ倍浓缩后，双层检测平板法检测抑菌效果。 ３结果与分析 ３．１发酵培养基各成分对小分子肽产量的影响 ３．１．１发酵培养基成分优化结果的对比 表３—３ 无机氮源培养基ｐＨ值和抑菌效果 ６ 维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７年 么宏伟等：肽类天然防腐剂产生茵一ｌ＿￣ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株培养基成分的研究 第２期 表中结果可看出，牛肉汤、豆浆、蛋白胨等氮源，均 能促进Ｌｂ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株产小分子肽，但产量 有明显差别，其中２ 蛋白胨的抑菌圈直径最大，说明 ２ 蛋白胨作为氮源优于其氮源。 ３．１．５ 氯化钠不同浓度的小分子肽产量的影响 将发酵培养基中的氯化钠成分，按１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、 ３０ｇ／Ｌ的梯度，分别作成培养基，同时以不加蛋白胨的 发酵培养基作对照，各培养基培养Ｌｂ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株后，测得ｐＨ值和抑菌效果见表３－５。 表３－５不同氯化钠浓度的发酵培养基 ｐＨ值和抑茵效果 图３—８ 图３—９ 图３一ｌ１不同氯化钠浓度的发酵培养基ｐＨ值和押茵效果图 由表中结果可看出，ＮＨ４ Ｃｌ、ＮＨ４ＮＱ、（ＮＩ４，）。Ｃ０３、 ＮａＮＱ、（ＮＨ４）。Ｓ０４、尿素、蛋白胨等氮源，均能促进工６． ？－ａｃａ￥ｃｉ ＨＤ１．７菌株产小分子肽，但产量有明显差别，其 中２ 蛋白胨的抑菌圈直径最大，说明作为氮源优于其它 无机氮源。 表中结果可看出，四种培养基均能促进 ． ｐａ？－ａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株产小分子肽，但产量有明显差 别，其中ＮａＣ１添加量为２０ｇ／Ｌ的抑菌圈直径最大，说 明ＮａＣ１添加量为２０ｇ／Ｌ作为培养基成分较好。 ３．１．６ 复合维生素不同浓度对小分子肽产量的影响 ３．１．４不同其他氮源对小分子肽产量的影响 将发酵培养基中的蛋白胨分别用２０ 牛肉汤、 ５０ 豆浆等其他氮源进行替换，配制各培养基，同时以 发酵培养基和不加蛋白胨的发酵培养基作对照，各培 养基培养 ．ｐａ？－ａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株后，测得ｐＨ值和 抑菌效果见表３—４。 表３—４ 其他氮源培养基ｐＨ值和抑菌效果 将等量的维生素Ｂ 、Ｂ２、Ｂ４、Ｂ６、Ｂ 。、ＢＨ混合制成 复合维生素，分别按１０￣ｔｇ／Ｌ，２０“ｇ／Ｌ的量，用细菌滤 器打入以灭好的发酵培养基中，作为培养基使用。同 时以发酵培养基作对照，各培养基培养 ．ｐａ？－ａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株后，测得ｐＨ值和抑菌效果见表３－６。 表３－６不同复合维生素浓度的发酵培养基 ｐＨ值和抑菌效果 表中结果可看出，三种培养基均能促进 ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株产小分子肽，但产量有明显差 别，其中发酵培养基的抑菌圈直径最大，说明发酵培养 基中不添加维生素较好。 ３．２ 种子培养基成分的优化（正交试验） 以种子培养基为基础进行培养基成分的优化，设 置葡萄糖、酵母膏和牛肉膏、Ｃａ。 和Ｍｎ２ 、吐温８Ｏ四 个因子，每个因子设计三个水平，作正交试验。各培养 ７ 维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７生 中 国 林 副 特 产 第２期 组组组合合合基培养Ｌｂ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株后，抑菌圈、ＯＤ值 的直观分析见表３—７、３—８。 表３—７ （３‘）正交表：种子培养基成分优化的 正交试验结果的直观分析 从表３—７可以看出，Ｃａ 、Ｍｎ２ 和酵母膏、牛肉膏 的极差Ｒ分居第一、二位，是影响培养基抑菌效果的 关键因子，其次是吐温８０，葡萄糖的影响最小。 根据各试验因子的总计数或平均数计算，以小分 子肽的产量可以看出，发酵培养基成分最佳组合为葡 萄糖２ 、酵母膏０．５ 、牛肉膏０．５ 、Ｃａ ０．００１５ ｍｏｌ／Ｌ、Ｍｎ２ ０．０００７５ ｍｏｌ／Ｌ、吐温０．５ｍｌ／Ｌ。 表３—８ Ｌ。（３‘）正交表种子培养基成分优化的 正交试验结果的直观分析 。～。（ ） 牛肉膏（ ） （ ｏｔｏｌ／ Ｌ）（ｍ ｌ／Ｌ。。值 ）１ １ ２．１５５ ２ ２ ４．４５６ ３ ３ ２．６１１ ２ ３ ２．２６２ ３ ｌ ４．３４７ １ ２ ５．０４６ ３ ２ ２．０４６ １ ３ ４．４５６ ２ １ ３．５７９ １１．６５７ １Ｏ．０８１ Ｔ２ １１．６５５ １３．２５９ １０．２９７ １１．５４８ Ｔ３ １０．０８１ １１．２３６ ９．００４ ９．３２９ ３．８８６ ３．３６０ ３．４３２ ３．８４９ ３．Ｏ０１ ３．１１Ｏ ０．８８５ Ｏ．７３９ ８ 从表３—８可以看出，酵母膏、牛肉膏和Ｃａ 、Ｍｎ。 的极差Ｒ分居第一、二位，是影响培养基抑菌效果的 关键因子，其次是葡萄糖，吐温的影响最小。 根据各试验因子的总计数或平均数计算，以菌体 的生长素率为标准可以看出，种子培养基成分最佳组 合为葡萄糖２ ９／５、酵母膏１ ９／５、牛肉膏１％、Ｃａ ０．０００５ ｍｏｌ／Ｌ、Ｍｎｚ ０．０００２５ ｍｏｌ／Ｌ、吐温０．５ｍｌ／Ｌ。 ４结论 经过对 ． ｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株发酵培养基及 种子培养基各成分的试验，筛选出一组最佳条件： ４．１蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等有机氮源源，ＮＨ。Ｃ１、 ＮＨ。Ｎ（）３、（ＮＨ。）：ＣＯ３等无机氮源，牛肉汤、豆浆等其 他氮源，均能促进 ． ｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株产小分子 肽，但产量有明显差别，其中以２ ９／５蛋白胨作为氮源优 于其它有机氮源。 ４．２发酵培养基中氯化钠的含量为１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、 ３０ｇ／Ｌ时，均能促进Ｌｂ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＨＤ１．７菌株产小分 子肽，但产量有明显差别，其中氯化钠的含量为２０ｇ／Ｌ 时最佳。 ４．３维生素Ｂ。、Ｂ２、Ｂ４、Ｂ６、ＢＩ 、ＢＨ混合制成的复合维 生素添加在发酵培养基中，作用不大，发酵培养基中不 应填加复合维生素。 ４．４ 优化后的发酵培养基（１Ｌ）组分为： 白菜２００ｇ／Ｌ、豆芽１５０ｇ／Ｌ、番茄２００ｇ／Ｌ、蔗糖 ２０ｇ／Ｌ、氯化钠２０ｇ／Ｌ、蛋白胨２０ｇ／Ｌ ４．５ 以小分子肽的产量为标准，种子培养基最佳组合 为： 葡萄糖２ ９／５、酵母膏０．５ ９／５、牛肉膏０．５ ９／５、Ｃａ。 ０．００１５ ｍｏｌ／Ｌ、Ｍｎ２ ０．０００７５ ｍｏｌ／Ｌ、吐温０．５ｍｌ／Ｌ。 ４．６ 以菌体的生长速率为标准，种子培养基最佳组合 为： 葡萄糖２ 、酵母膏１ 、牛肉膏１％、Ｃａ ０．０００５ ｍｏｌ／Ｌ、Ｍｎ２ ０．０００２５ ｍｏｌ／Ｌ、吐温０．５ｍｌ／Ｌ。 参 考 文 献 １还连栋，陈秀珠．乳莲菌肽应用的新进展［Ｊ３．中国食品添 加剂．２０００（３）：２５￣２８． ２杜荣茂．天然食品防腐剂［Ｊ］．中国食品添加剂，２００３ （Ｏ２）：６８￣７３＋儿． ３徐宝才．天然食品防腐剂的研究进展（续）［Ｊ］．江苏食品 与发酵，２００１（Ｏ３）：１～３． ４郭新竹，宁正祥．天然防腐剂研究进展［Ｊ］．食品与发酵工 业，２０００，２７（２）：７２～７５． ５胡国平，叶嗣颖．乳链菌肽（Ｎｉｓｉｎ）的研究进展［Ｊ］．中国微 生态学杂志，２００１，１３（２）：１１５． ６沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验［Ｍ］．北京：高等教 育出版社，２００１．５．
