第２４卷第５期 ２０１３年９月 文章编号：１６７４—１７３０（２０１３）０５—００４２—０４ 陇东学院学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｏｎｇｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＶｏｌＩ ２４ Ｎｏ．５ Ｓｅｐ．２０１３ 短柄五加果实中黄酮提取工艺优化研究 李东波 一，张 博 ， ，刘灵霞 ．一，周天林 ’ （１．甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室，甘肃庆阳７４５０００； ２．陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳７４５０００） 摘要：通过单因素及正交试验研究短柄五加果实ｑ－黄酮的最优提取工艺．其最佳工艺为：乙醇浓度７Ｏ 、 料液比１：１０（Ｗ／Ｖ）、提取温度６Ｏ℃、提取时间３ｈ、ｐＨ４．０． 关键词：短柄五加果实；黄酮；正交试验 中图分类号：Ｒ２８４．２ 文献标识码：Ａ ， ＥｘｔｒａｃｔｉＯｎ，Ｐｕｒｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ Ｂｒａｃｈｙｐｕｓ Ｈａｒｍｓ Ｉ Ｉ Ｄｏｎｇ—ｂｏ ，一，ＺＨＡＮＧ ｂｏ ，ＬＩＵ Ｌｉｎｇ—ｘｉａ ～，ＺＨＯＵ Ｔｉａｎ—ｌｉｎ ’ （１．ｋｏｎｇｄｏｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｎｇｄｏｎｇ Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｉｎ Ｇａｎｓｕ，Ｃ￣ｎｇｙａｎｇ ７４５０００，Ｃａｎｓｕ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｋｏｎｇｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，（￣ｎｇｙａｎｇ ７４５０００，（ ，２ｓ ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｏｂｊｅｃｔ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｉｓ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ Ｂｒａｃｈｙｐｕｓ Ｈａｒｍｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ａｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ：ｔＯ ｅｘｔｒａｃｔ Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｂｒａｃｈｙｐｕｓ Ｈａｒｍｓ ｗｉｔｈ １０ ｔｉｍｅｓ ｖｏｌｕｍｅ（ｖ／Ｗ）ｏｆ ７Ｏ ｅｔｈａｎｏｌａ ａｔ ｐＨ ４．０ ｆｏｒ ３０ ｈ ａｔ ６０。Ｃ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ Ｂｒａｃｈｙｐｕｓ Ｈａｒｍｓ；ｔｏｔａｌ Ｔｌａｖｏｎｏｉｄｓ；Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ 黄酮类化合物是以２一苯基色原酮为母核的植物次级代 １材料与方法 谢产物，其广泛存在于植物中，具有抗炎、抗肿瘤、解痉和保 １．１材料与试剂 短柄五加果实采于甘肃省庆阳市子午岭林区中湾林场． 肝等广泛药理作用，对心脑血管、消化系统有显著药效活 九月下旬果实成熟后采集、挑选、烘干、保藏． 性ｌ＿１］，在食品和医药领域用途广泛． 芦丁标准品（１０００８０－２００７０７）、甲醇、乙醇、石油醚（３０－ 短柄五加（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｂｒａｃｈｙｐｕｓ Ｈａｒｍｓ）为五加科五 ０￣Ｃ）、浓硫酸，以上试剂均为分析纯． 加属药用植物，世界上仅中国西北部黄土高原有分布．短柄 ６．２仪器与设备 五加具扶正固本、益智安神、补肾健脾之功效［２］，可作刺五加 １ＰＣ－１０００数显式电热恒温水浴锅，上海跃进医疗器械 替代品［３］，其根、茎和叶已用于治疗多种疾病＿４］．目前对其 厂；ＳＨＢ一３型循环水多用真空泵，郑州杜甫仪器厂；旋转蒸 根茎化学成９Ｅ ¨］、生殖生物学和生态学方面研究较 发器，巩义市予华仪器有限责任公司；ＵＶ７５７ＣＲＴ紫外可见 多…］，但其果实黄酮的提取分离研究在国内外报道较少．黄 分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；电子天平，赛多利 土高原子午岭林区为短柄五加天然原产地，野生资源丰富， 斯科学仪器有限公司；ＦＺ一１０２微型植物粉碎机，天津泰斯特 果实产量高，但其开发利用研究较少，因此，本研究旨在摸索 仪器有限公司． 和探讨短柄五加果实中黄酮提取工艺，以期能够为药品和食 １．３方法 品领域拓展研究思路，并进一步为其果实中黄酮的开发利用 １．３．１短柄五加果实总黄酮提取工艺优化 提供科学依据及数据参考． 本实验研究了提取温度、时间、ｐＨ值、乙醇浓度和料液 收稿日期：２０１３—０２—２６ 基金项目：庆阳市重大科技支撑项目（１００３ＮＫＣＭ０２０） 作者简介：李东波（１９７９一），男，甘肃金昌人，讲师，硕士，主要从事天然药物化学研究 第５期 李东波，张博，刘灵霞，等：短柄五加果实中黄酮提取工艺优化研究 ４３ 比对总黄酮提取率影响；在单因素试验基础上，结合相关文 献选取对黄酮提取率有显著影响的四个因素（提取温度、提 取时间、乙醇浓度和料液比），采用正交试验分析以上四因素 在三水平上对总黄酮提取率的影响，确定各影响因素主次顺 序及最佳提取工艺． １．３．２标准曲线绘制 总黄酮含量测定采用分光光度法ｒ１ ．准确称取芦丁标 准品（１Ｏ５℃干燥）１０ｍｇ用７Ｏ 乙醇定容至１００ｍＬ，配制浓度 为０．１ｍｇ／ｍＬ标准液，取０，１．０，２．０，３．０，４．０，５．０ｍＬ．置 ２Ｏ℃ ３Ｏ℃４０℃ ５Ｏ℃ ６０℃ １０ｍ１容量瓶中，加５￣ＮａＮＯ。溶液０．４ｍＬ，摇匀，放置６ａｒｉｎ， 加ＩＯ％ＡＩ（ＮＯ。）。溶液０．４ｍＬ摇匀，放置６ｍｉｎ加４％ＮａＯＨ 溶液２ｍＬ，再用７ｏ％乙醇液稀释至刻度，摇匀，放置１０ｍｉｎ置 比色皿中在波长５１０ｎｍ测定．绘制标准曲线并得出回归方 程．回归方程为Ａ＝３．０７２９Ｃ一０．００９９（Ｒ。＝０．９９８），其中，Ａ 为５１０ｒｉｍ下吸光度值，Ｃ为芦丁浓度（ｍｇ／ｍＬ）． １．３．３短柄五加果实总黄酮含量测定 准确称取短柄五加果实置提取仪中，ｌ ｌ 一●瓣磷 暖牧 Ｏ ０ ０ ２ Ｏ ９ ８ ７ 按单因素和正交试 验方法，将所得提取物用乙醚萃取，滤液用７０％乙醇定容到 １００ｍｌ，按实验方法测定吸光度值，由回归方程计算总黄酮含 量，按下面公式计算提取率 提取率（１００ ）： ×ｌＯｏ ｍ ＝根据标准曲线计算出待测液中黄酮量（ｍｇ／ｍ１）； Ｖ＝样品提取液定容体积； ｍ＝短柄五加果实质量（ｇ）； 稀释倍数＝２ ２ 结果与分析 ２．１最佳提取温度的选择 在提取时间３ｈ、料液比为１：１５（ｗ／ｖ）、乙醇浓度５Ｏ％、 ｐＨ６．Ｏ、提取次数１次的条件下，不同温度（２０￣Ｃ、３０￣Ｃ、４０￣Ｃ、 ５０￣Ｃ、６０￣Ｃ）对黄酮提取率影响（图１）．随提取温度从２０￣Ｃ增 加到５０￣Ｃ，提取率逐渐升高，从０．７０６％增至１．１８８％，增幅 为６８．２ ，在５０￣Ｃ，黄酮提取率最大（１．１８８％）．当温度高于 ５ｏ￣ＣＥ，黄酮浓度降低，故选择提取温度５０￣Ｃ为宜． 溶剂法提取过程中，升高提取温度可使细胞破裂，分子 运动加剧，缩短黄酮在溶液中的平衡过程和提取时间，增加 其溶解度，但温度过高会导致杂质含量升高其提取效果不增 加反降低． ２．２最佳乙醇浓度的选择 在时间３ｈ、料液比１：１５（Ｗ／Ｖ）、温度４０￣Ｃ、ｐＨ６．Ｏ、提取 次数１次的条件下，乙醇浓度（４０、５０、６Ｏ、７０、８０、９５％）对黄酮 提取率的影响（图３）．随乙醇浓度增加，黄酮提取率逐渐升 高，当乙醇浓度高于８０ 后，增加乙醇浓度，黄酮提取率变化 平缓，故选择乙醇浓度８０％为宜． 黄酮类化合物在花、叶、果中一般以苷的形式存在，而在 温度ＣＣ） 图１提取温度对黄酮提取率的影响 糌 蹿ｃ 蕊 粒 ５０％ ６０％ ７Ｏ％ ８０％ ９Ｏ％ 乙醇浓度（％） 图３ 乙醇浓度对黄酮提取效果的影响 木质部中多为游离苷元．黄酮苷及极性稍大的苷元，可用丙 酮、乙酸乙酯、乙醇和水提取，其中甲醇一水（１：１）效果最佳， 但甲醇、丙酮毒性高，存在安全问题，而乙醇广泛用于活性成 分提取，安全性高．乙醇水溶液中，水可渗透原料组织，提高 通透性，利于氢键形成，而乙醇促进氢键断裂，使聚合物裂解 成小分子，进入溶剂中，还可将糖苷转变为自由形式，且其极 性对提取苷元结构也十分有利．乙醇浓度过高，会使某些脂 溶性成分溶出增多，增加后续分离难度；其水量减少，溶剂穿 透细胞能力减弱，也导致黄酮从细胞中渗出量降低． ２．３最佳提取时间的选择 图４提取时间对黄酮提取率的影响 在提取温度４０Ｖ、料液比１：１５（Ｗ／Ｖ）、乙醇浓度５ｏｇ、 ｐＨ６．Ｏ、提取次数１次的条件下，提取时间（Ｏ．５、１．０、１．５、 ４４ 陇东学院学报 第２４卷 ２．０、２．５、３．Ｏｈ）对黄酮提取率的影响（图４）．随着提取时间延 因素之一． 长，提取率逐渐增高，从０．８８１ 增至１．３３４ ，增幅为 ２．５最佳ｐＨ的选择 ５１．４ ，在２．０ｈ，黄酮提取率最大（１．３３４％）．当提取时间超 过２．Ｏｈ后，黄酮提取率逐渐下降，故选择提取时间２．０为宜． 提取初期，溶剂中黄酮浓度低，样品中黄酮含量高，两体 系有较高浓度差，传质推动力大，黄酮浸出速率快，随提取时 间延长，两个体系浓度差缩小，传质推动力降低，黄酮浸出缓 慢．提取时间延长可使杂质溶出量增多，浪费能源，所以应选 择合理浸提时间． ２．４最佳料液比的选择 图６ ｐＨ值对黄酮提取效果的影响 在提取温度４０Ｃ、提取时间３０ｍｉｎ、乙醇浓度５０％、料液 比１：１５（Ｗ／Ｖ），提取次数１次的条件下，ｐＨ（２、４、６、８、１Ｏ）对 黄酮提取率影响（图６）．随ｐＨ值逐渐升高，提取液黄酮浓度 先增加后减少，当ｐＨ值４．０时，黄酮浓度最大，继续增加ｐＨ 值，黄酮浓度逐渐降低，到ｐＨ８．０时降幅变缓，故选择ｐＨ值 １：６ １：８ ｌ：１０ １：ｌ２ ｌ：ｌ４ ｌ：ｌ６ ４．０为正交试验条件． 料液比 采用酸化溶剂，可抑制酚羟基解离，阻止其与金属离子 图５料液比对黄酮提取效果的影响 络合沉淀，增强溶剂破坏结合键的能力，破坏黄酮与蛋白质、 从而提高黄酮提取 在提取温度４０￣Ｃ、提取时间３０ａｒｉｎ、乙醇浓度５Ｏ 、提取 多糖及其自身间的氢键和疏水键作用，但黄酮含多羟基，溶液通常呈弱酸性，易溶于碱性溶液 次数１次的条件下，料液比分别１：６、１：８、１：１０，ｌ：１２、１：１４、 率．酸过多会降低黄酮的溶解性，使黄酮提取率下降． １：１６（ｇ／ｍ１）对黄酮提取效果影响（图５）．随料液比逐渐增大， 中，．６正交试验结果 提取液黄酮浓度逐渐增加，当料液比达１：ｌｏ时，继续增加溶 ２表ｌ正交试验因素水平表 剂比例，黄酮浓度无显著增加，故选择料液比１：ｌＯ为宜． 溶剂用量直接影响提取时的平衡浓度，从而影响提取速 率和提取量．通常，溶剂用量越多，产物提取率越高，但当料 液比达到一定程度，有效成分已基本析出，再增加料液比，不 但不能提高目标产物提取率，而且还会使更多杂质溶出和造 成溶剂与能源的浪费．因此，料液比是影响提取黄酮的重要 表２试验号 Ａ时间 Ｂ温度 正交试验结果 Ｃ浓度 Ｄ料液比 黄酮素浓度（ｍｇ／ｍ１） 在单因素试验基础上，选择主要影响因素：时间（Ａ）、温度（Ｂ）、浓度（Ｃ）和料液比（Ｄ）为研究对象，采用四因素三水平 第５期 李东波，张博，刘灵霞，等：短柄五加果实中黄酮提取工艺优化研究 ４５ 正交试验研究短柄五加果实黄酮不同条件下提取率，且每个 是乙醇浓度、时间和料液比，且均达到极显著水平（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１）． 条件下三个平行试验．以黄酮提取率为指标，因素水平表（表 根据Ｋ￣３ｖＪＪ，可知，短柄五加果实黄酮提取的最优条件是 Ｄ ，即温度６０￣Ｃ、乙醇浓度７０％、时间３ｈ和料液比１ １）所示．通过对正交试验结果（表２）进行极差分析和方差分 Ｂ。Ｃ Ａ。析：短柄五加果实黄酮提取效果影响最为显著的是温度，其次 ：１０． 表３方差分析表 ３ 结论 ［４］周淑意，王晋源，段雪清．五加冲剂治疗白细胞减少 黄酮是食品和药品领域的研究重点，富含黄酮的浆果正 症４３例临床观察［Ｊ］．西安医科大学学报，１９８９，１０ （２）：１７７—１７９． 逐渐被食品及保健品企业所关注．目前，提取分离黄酮的方法 ［５］斯建勇，陈迪华，常琪．倒卯叶五加根茎的化学成 很多，如水提法、碱性水或碱性稀醇提取法、有机溶剂提取法、 分ＥＪ］．中国植物学报，１９９３，３５（６）：４８３—４８５． 微波法、酶解法、大孔树脂吸附法、超滤法和超临界萃取等，部 ［６］ＨＵ Ｈａｏｂｉｎ，ＺＨＥＮＧ Ｘｕｄｏｎｇ，ＨＵ Ｈｕａｉｓｈｅｎｇ，ｅｔ 分方法繁琐、耗时、高成本，不能在实际中广泛使用．溶剂法提 ａ１．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉ— 取分离黄酮是目前国内外普遍采用的方法，而乙醇是最常使 ｔｉｅｓ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｏｉｌｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ａｃａ ＾０ 口 口ｚ 用的溶剂．乙醇浓度对黄酮的提取影响较大，通常高浓度乙醇 ｂｒａｃｈｙｐｕｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２Ｏ０９，３２（５）：６９９—７１０． 适于提取黄酮苷元类，低浓度乙醇适于提取黄酮苷类． ［７］Ｈｕ Ｈａｏｂｉｎ，ＺＨＥＮＧ Ｘｕｄｏｎｇ，ＣＡＯ Ｈｏｎｇ，ｅｔ ａ１． 李娜等研究蒙椴树总黄酮提取工艺发现乙醇浓度对总黄 Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔｅｍ Ｂａｒｋ ｏｆ Ａｃａｎ— 酮提取影响较大，其后依次为时间＞提取次数＞乙醇用量，Ｅ４ ｔｈｏｐａｎａｘ ｂｒａｃｈｙｐｕｓ Ｈａｒｍｓ［Ｊ］． ｃｈｅｍ．ｐｈａｒｍ． 用１０倍量９５￣／／ｏ乙醇，提取２次，每次３小时为最佳工艺［１ ． Ｂｕｌ１．２００９，５７（９）：１０００—１００３． ［８］ＱＩ ＸｉａｎｇＪｕｎ，ＣＨＥＮ ｌｉ，ＺＨＵ Ａｉｈｕａ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｕｄｙ 陈兴芬等研究侧柏叶总黄酮的提取工艺，表明影响提取的因 ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃ— 素主次顺序为料液比＞乙醇体积分数＞提取时间，６５％乙醇 ｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ口ｃ口 ￡＾０ 口扎ａｚ ｏｂｏｖａｔｕｓ ｈｏｏＩ－Ｊ］．Ｊｏｕｒ— 提取２次，提取时间１．５ｈ，料液比１：１５为最佳工艺．熊勇等研 ｎａｌ ｏｆ ｓｈａａｎｘｉ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｓｃｉｅｎｃｅ＆ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． 究密蒙花中总黄酮提取工艺，表明乙醇浓度７０％，温度７５，时 ２００９，２７（１）：１—６． 间３ｈ，影响提取的主次顺序为温度＞时间＞乙醇浓度Ｅ１４］．盛 －Ｉ９］ｗＥＩ Ｐｉｎｇ．Ｙｕ Ｇａｏｍａｉ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｍｅｔａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｅｍｓ ｏｆ Ａｃ口咒￡ Ｄ户口 口ｚ ｂｒａｃｈｙ－ 萍等研究罗布麻总黄酮提取工艺，发现只有提取次数对提取 ｐｕｓ Ｈａｒｍｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｈｅｒｂａｌ 效果有显著影响，料液比１：１０，煎煮３次，每次３０ｒｎｉｎ为最佳 ｄｒｕｇｓ，１９８８，１１，４８—５０． 提取工艺ｌ＿１引．王向国研究良姜总黄酮提取工艺，其最优条件 ［１０］Ｈｕ Ｈａｏｂｉｎ．Ａ ｎｅｗ ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｏｎｓｔｉｔｕ— 为２０倍５０％乙醇，温度６Ｏ，时间１．５小时，对得率的影响大 ｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ａｃｎ卵￡＾０ 口 口ｚ ｂｒａｃｈｙｐｕｓ Ｈａｒｍｓ［Ｊ］． 小乙醇浓度＞提取时间＞料液比＞温度．可见主要影０向因素， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９８９，２０， ８—９． 各因素对提取效果的影响大小，最佳提取工艺各不相同，差异 ［１１］刘福顺，张希彪，马世荣．黄土丘陵区子午岭短柄五 较大，这可能是因为材料，原料前处理、粒度及提取方式等因 加群落特征分析［Ｊ］．植物研究，２００９，２９（４）：４７５— 素不同弓Ｉ起．通过单因素试验，在正交试验基础上得出：短柄 ４８０． 五加果实黄酮提取的最优条件是Ｂ。Ｃ Ａ。Ｄ ，即温度６０。Ｃ、乙 ［１２］王丽英，宋玉萍，王淑珍．分光光度法测定刺五加茎 醇浓度７０％、时间３ｈ和料液比ｌ：１０条件下可达到最佳的提 中黄酮含量［Ｊ］．时珍国医国药，１９９９，１０（１２）８８４． ［１３３李 娜，田福利，王瑞亭．正交试验优选蒙椴树总黄 取效果． 酮的提取工艺［Ｊ］．内蒙古大学学报：自然科学版， ２０１０，４（４１）：３８１—３８３． 参考文献： ［１４］熊 勇，李永春，赵春艳．正交设计优选密蒙花总黄 ［１］程秋月，郭 菁，张成义．黄酮类化合物药理作用的 酮提取工艺研究ＥＪ－１．云南民族大学学报：自然科学 研究Ｉ－Ｊ］．北华大学学报：自然科学版，２０１１，１２（２）： 版，２０１ｏ，２（１９）：１４６—１４９． １８Ｏ一１８３． ［１５］盛萍，王新铃，杨学斌，刘洪炳．罗布麻总黄酮提 ［２］杨智锋，李改琴，郭五保．倒卵叶五加的生药学研究 取工艺的优选［Ｊ］．时珍国医国药，２００６，１７（４）：５８７ ＥＪ］．西北药学杂志，２００４，１９（５）：２０５—２０７． ５８８． ［３］徐小平．短柄五加对中枢抑制作用的初步药理研究 【责任编辑赵建萍】 ［Ｊ］．陕西中医学院学报，１０（４）：３０～３２．
