第３２卷第１０期 ２０１０年１０月 中国预防兽医学报 Ｖｏ１．３２．ＮＯ．１０ ０ｃｔ． ２Ｏｌ０ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００８—０５８９．２０１０．１０．０８ 食品中弓形虫和旋毛虫液相基因芯片检测方法的研究 杨朋欣 ，张子群 ，路义鑫 ，韩彩霞 ，李晓云 ，宋铭忻 （１．东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨１５００３０； ２．黑龙江出入境检验检疫局，黑龙江哈尔滨１５００３６） 摘 要：为建立一种可同时检测食品中弓形虫和旋毛虫的液相基因芯片方法，本研究以弓形虫Ｂ１基因和旋 毛虫１８Ｓ ｒＤＮＡ基因为靶序列，设计并合成特异性探针和引物，通过ＰＣＲ方法扩增目的片段并测序，建立一种基 于双重ＰＣＲ的液相基因芯片检测方法。结果显示：在约１８０ ｂｐ和９０ ｂｐ处分别扩增出目的条带；测序结果与 ＧｅｎＢａｎｋ登录的弓形虫和旋毛虫的相关基因一致性分别为９９．４７％和１００％；液相基因芯片对单重ＰＣＲ产物和双 重ＰＣＲ产物的检测结果一致，特异性和重复性良好。应用该方法检测弓形虫和旋毛虫变异系数（ｃｖ％）均在７％ 以内；灵敏度分别为６５．６ ｎｇ／ｍＬ和３９．０６ ｎｇ／ｍＬ，比琼脂糖凝胶电泳灵敏高约８倍；模拟污染试验准确率达９８％ 以上。本研究建立的液相基因芯片检测食品中弓形虫和旋毛虫的方法具有高效、灵敏和特异等优点，为食源性寄 生虫的检测和监控提供了新方法。 关键词：液相基因芯片；弓形虫；旋毛虫 中图分类号：￥８５２．６５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８．０５８９（２０１０）１０—０７７７。０４ ０Ｄｅｖｅｌ— ０ ｏｐｍｅｎｔ一 ｏｔ ｌ‘ ＿０ｌ ｑＵＩ＿ ‘ｄ 。 ●Ｉ 。 ＿ｌ ・ ｄｅｔｅｃｔ。 一 一■Ｉ ｑｑｅｎｅ ｃｈ Ｐ ｔｅｃｈｎ ｑＵｅ ｔｏｒ ｎ．．Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ａｎｄ Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ ｉｎ ｆｏｏｄ ＹＡＮＧ Ｐｅｎｇ—ｘｉｎ ，ＺＨＡＮＧ Ｚｉ—ｑｕｎ ，ＬＵ Ｙｉ—ｘｉｎ ，Ｈ Ａ Ｎ Ｃａｉ－ｘｉａ ，ＬＩ Ｘｉａｏ—ｙｕｎ ，ＳＯＮＧ Ｍｉｎｇ—ｘｉｎ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａ￣ｉｎ １５００３０，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｅｎｔｙ—Ｅｘｉｒｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ，Ｈａｒｂｉｎ ｌ５００３６，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｄｕｐｌｅｘ ＰＣＲ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｌｉｑｕｉｄ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ａｎｄ Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ ｉｎ ｆｏｏｄｓ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ Ｂ １ ａｎｄ Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓ １ ８Ｓ ｒＤＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． ，Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｂ１ ａｎｄ １８Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ １８８ ｂｐ ａｎｄ ９２ ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ．ｈａｄ ９９ ４７％ａｎｄ １００％ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｉｐ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｂｏｔｈ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｄｕｐｌｅｘ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｗｉｔｈ ｈｉ ｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｙ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ ６５．６ ｎｇ／ｍＬ ｆｏｒ Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ａｎｄ ３９．０６ ｎｇ／ｍＬ ｆｏｒ ｓｐｉｒａｌｉｓ．ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ８－ｆｏｌｄ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｃｙ ｒａｔｅ ｏｆ ｂｌｉｎｄ ｔｅｓｔ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ９８％．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｌｉｑｕｉｄ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗａｓ ａ ｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ａｎｄ Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓ ｉｎ ｆｏｏｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｌｉｑｕｉｄ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ；Ｔｔｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ 弓形虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）ＹｆＨ旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ 以上２种寄生虫不同发育阶段的虫体或卵（囊）的食 品，会导致发生食源性弓形虫或旋毛虫感染。弓形 ｓｐｉｒａｌｉｓ）均为重要的食源性寄生虫ｌｌ１。人若进食含有 丰ＣＯｒｒｅｓｐＯｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ 收稿日期：２０１０．０３．２５ 基金项目： “十一五”国家科技支撑计划项目（２００６ＢＡＤ０６Ａ０９）；国家质检总局科技计划项目；黑龙江省教育厅科学技 术研究重点项目（１ １ ５３Ｌｚ０４） 作者简介：杨朋欣（１９８５一），女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事寄生虫分子生物学研究． 通信作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｏｎｇｍｘ＠ｎｅａｕ．ｅｄｕ．ｃａ ７７８ 中国预防兽医学报 ２０１０焦 虫几乎可以感染各种温血动物，人感染弓形虫除影 响生育外，还会引发多种疾病ｌ ２ｌ。据报道，全球约 １０亿人感染弓形虫，我国感染人数达６ ０００万 。 旋毛虫为肉品卫生检验中的必检项目，人体感染旋 毛虫严重者会导致心肌炎等疾病甚至死亡，我国旋 毛虫感染高发区主要在云南、河南、湖北和东北三 省 等地区。因此，加强食源性寄生虫的检测是十 分迫切和必要的。 目前，我国诊断食源性寄生虫的方法较多，但 是大多为一次仅检测一种虫体，在很大的程度上限 制了食源性寄生虫的快速检测和鉴定。因此，有必 要建立一种灵敏、特异、高通量的检测方法。液相 基因芯片技术是美国Ｌｕｍｉｎｅｘ公司开发的一种新型 检测型生物芯片技术［５－６］，已应用于微生物检测等领 域，具有高通量多指标同步分析、操作简便、灵敏 性和重复性好等优点。本研究以弓形虫Ｂ１基因及 旋毛虫１８Ｓ ｒＤＮＡ基因为靶序列，设计特异性引物， 建立高效、灵敏、特异的液相基因芯片检测方法， 为食源性寄生虫的检测提供新方法。 １材料和方法 １．１ 虫株、载体与菌株 弓形虫基因组ＤＮＡ由兰 州兽医研究所惠赠；旋毛虫为本实验室保种；载体 ｐＭＤ１８－Ｔ购自ＴａＫａＲａ公司；大肠杆菌感受态菌株 ＤＨ５ｅ￣为本实验室保存。 １．２主要试剂及仪器链霉素一亲和素一藻红蛋白 （ＳＡＰＥ）、表面羧基化的荧光编码微球购自上海透景 生物科技有限公司；Ｌｕｍｉｎｅｘ 液体悬浮点阵检测仪 为美国Ｌｕｍｉｎｅｘ公司产品。 １．３探针及引物的设计与合成根据ＧｅｎＢａｎｋ登 录的弓形虫Ｂ１基因ｆＥＵ３４０８７９）和旋毛虫１８Ｓ ｒＤＮＡ 基因（ＡＹ４９７０１２）的序列，分别选择保守区域应用 ＤＮＡＳｔａｒ软件设计探针，并根据探针位置，应用 Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计引物（表１）。探针５ 端均添加 ｐｏｌｙ Ｔ１１尾并氨基化，同时将两条用于杂交的生物 素标记的探针互补链作为阳性对照，上游引物５’端 均采用生物素标记。探针和引物均由上海桑尼生物 有限公司合成。 １．４ 目的基因的克隆与重组质粒的鉴定 采用试剂 盒方法提取旋毛虫基因组ＤＮＡ，分别以弓形虫和旋 毛虫基因组ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增，设阴性 对照，反应条件为：９５℃５ ｍｉｎ；９４℃３０ Ｓ、５８℃ ３０ Ｓ、７２℃４０ Ｓ，３０个循环；７２℃１０ ｍｉｎ。琼脂糖 凝胶电泳鉴定ＰＣＲ产物。目的片段经过纯化分别克 隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体中，并转化感受态细胞ＤＨ５ｏ￣， ＰＣＲ方法筛选阳性重组质粒，测序鉴定。 表１ 引物和探针序列及扩增产物大小 Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆｐｒｏｄｕｃｔ Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅｒ（５ ｔｏ ３ ） Ｓｉｚｅ（ｂｐ） 耐Ｂ１ ＡＡＴＡＣＡＧＧＴＧＡＭＴＧＴＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡ Ａ １８８ ＣＴＡＣＴＣＧＡＣＡＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡ （３ｌ２ ｂｐ ３３５ ｂｐ） Ｔ ｓｐｉｒａ／ｉｓ １８Ｓ ＡＧＧＴＴＣＧＡＡＧＧＣＧＡＴＣＡＧＡＴＡＣ ＣＣＡＡＣＣＡＧＣＧＡＴＴＣＧＣＣＧＡＡＧＴ ９２ ｂｐ ＣＴＧＣＴＣＧｃＣＧＡＧＴＣＴＴＡＡＡＴＧ （１ ０５４ ｂｐ １ ０７６ ｂｐ） １．５双重ＰＣＲ反应以两种虫体基因组ＤＮＡ为 模板，进行双重ＰＣＲ扩增，反应体系为：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ ＩｘＬ，ｄＮＴＰ（各２．５ ｍｍｏ１）２．０ ＩｘＬ，上、下 游引物（１０ ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ）为弓形虫各０．５ Ｌ、旋毛虫各 ０．８ Ｌ，模板ＤＮＡ各０．５ Ｌ，ｒＴａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０．５ ｔｘＬ。反应条件为：９５℃５ ｍｉｎ；９４℃３０ Ｓ、 ５８．５℃３０ Ｓ、７２ ｏＣ ４５ Ｓ，３０个循环；７２℃８ ｍｉｎ。 琼脂糖凝胶电泳鉴定双重ＰＣＲ产物。 １．６液相基因芯片的制作购置表面带有活性羧基 化基团编号为３５和３８的两种微球，将Ｂ１基因探 针和１８Ｓ ｒＤＮＡ基因探针分别与３５号和３８号微球 耦联，命名为Ｉ和ＩＩ，耦联步骤由上海透景生物有 限公司完成，并采用生物素标记的探针互补链测定 耦联率。 １．７液相基因芯片检测体系的建立分别取单重和 多重ＰＣＲ产物各３ ，加入７ ＩＬＬ ＴＥ溶液和２０ Ｌ 稀释的微球溶液，９５℃变性５ ｍｉｎ，５０℃孵育２０ ｍｉｎ， 加入８０ Ｌ荧光素，５０℃９呼育２０ ｍｉｎ，于Ｌｕｍｉｎｅｘ 液体悬浮点阵检测仪读取各微球检测的荧光强度 值。 １．８重复性试验 采用ＰＣＲ方法分别扩增弓形虫 和旋毛虫的基因组ＤＮＡ，以液相基因芯片体系检测 各ＰＣＲ产物荧光强度，在相同的试验条件下重复６ 次，并对结果进行分析，验证本方法的重复性。 １．９特异性试验分别以弓形虫和旋毛虫引物扩增 弓形虫、旋毛虫、猪囊尾蚴（Ｃｙｓｔｉｃｅｒｃｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）和 华支睾吸虫（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）的基因组ＤＮＡ，应 用液相基因芯片体系检测各ＰＣＲ产物的荧光强度， 并对结果进行分析，验证本方法的特异性。 １．１０敏感性试验对弓形虫和旋毛虫ＰＣＲ扩增产 物进行２－ｎ倍比稀释，每种产物稀释１２个梯度，分 第１０期 杨朋欣，等．食品中弓形虫和旋毛虫液相基因芯片检测方法的研究 ７７９ 别应用琼脂糖凝胶电泳和液相基因芯片体系检测， 比较两者的敏感性。 １．１１ 人工模拟污染试验分别提取弓形虫、旋毛 虫和检疫合格猪肌肉组织的基Ｌ大Ｊ组ＤＮＡ，将猪基因 组ＤＮＡ分装入３０个ＥＰ管中：其中２０个管加入一 ２．３液相基因芯片体系检测结果应用生物素标记 的探针互补链测定液相基因芯片ｌ和ＩＩ，检测耦联 率较高，表明Ｉ和ＩＩ可以在该体系中应用。液相基 因芯片体系检测单重ＰＣＲ和双重ＰＣＲ产物结果表 明：阴性和阳性的荧光强度检测值与琼脂糖凝胶电 泳结果一致（图略），两种虫体检测过程的信噪比分 种虫体基因组ＤＮＡ；８个管加入两种虫体的混合基 因组ＤＮＡ；另外２个管为对照组。将３０个ＥＰ管随 机编号，应用弓形虫和旋毛虫的混合引物分别扩 增，对液相基因芯片检测结果进行分析。 别为７２．７２和７５．１ １，表明荧光信号值明显高于背景 值，视为有效结果；双重ＰＣＲ产物检测结果与单重 ＰＣＲ产物检测结果一致（表２）。 表２液相基因芯片检测ＰＣＲ产物 Ｔａｂｌｅ ２ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ Ｉ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｙ ｏｆ ＩｔＩ ２ 结 果 ２．１ 目的基因的克隆与重组质粒的鉴定 应用 ＰＣＲ方法分别从弓形虫与旋毛虫基因组ＤＮＡ中扩 增出约２００ ｂｐ和１００ ｂｐ的ＤＮＡ片段（图１），与预期 大小相符。测序结果显示，弓形虫Ｂｌ基因和旋毛 虫】８Ｓ ｒＤＮＡ基凶与ＧｅｎＢａｎｋ登录的相关基因相似 性分别为９９．４７％和１００％，表明目的片段已插入克 ２．４重复性试验在相同试验条件下，重复检测６ 次，计算各批间平均荧光强度值的变异系数（ｃｖ）。 重复性检测结果显示各变异系数均在７％以内（表 ３），表明该方法具有良好的重复性和稳定性。 表３ 液相基因芯片检测单重ＰＣＲ产物重复性试验 Ｔａｂｌｅ ３ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｏｆｌｉｑｕｉｄ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｆｏｒ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ 隆载体中，构建了弓形虫和旋毛虫的重组质粒。 Ｍ：ＤＬ２０００ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ：１：Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓ； ３： ｇｏｎｄｉｉ；２．４：Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ 一 ｇｏｎｄｉｉ ａｎｄ Ｔ．ｓｐ／ｒａ／／ｓ ２．５特异性试验特异性检测结果显示，扩增虫体 混合基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ产物荧光强度值呈阳性， 而扩增猪肉基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ产物荧光强度值均 呈阴性（表４），表明该方法具有较好的特异性。 表４液相基因芯片特异－陛试验 Ｔａｂｌｅ ４ Ｓｐｅｃｉｉｃｉｆｔｙ ｔｅｓｔｓ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ 图１ 目的基因ＰＣＲ扩增结果 Ｆｉｇ．１ ＰＣＲ ａｍｐｆｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ２．２双重ＰＣＲ扩增应用双重ＰＣＲ方法由弓形虫 与旋毛虫混合基因组ＤＮＡ中扩增出约２００ ｂｐ和 １００ ｂｐ的ＤＮＡ片段（图２），与预期大小相符，表明 双重ＰＣＲ扩增产物正确。 Ｍ １ ， Ｍ：１００ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ；１：Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｄｕｐｌｅｘ ＰＣＲ； ２：Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ Ｂ１：３： ｓｐｉｒａｌｉｓ １ ８Ｓ ｒＤＮＡ 一 图２ ＰＣＲ反应条件优化结果 Ｆｉｇ．２ ＯｐｔｉｍｉＴａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｏｆ ＰＣＲ ２．６敏感性试验 比较液相基因芯片体系和琼脂糖 凝胶电泳检测结果的灵敏性，结果表明液相基因芯 片体系比琼脂糖凝胶灵敏度高约８倍，检测弓形虫 和旋毛虫的最低限可达原液的２一ｓ（图３）和２－ （图４）， 灵敏度分别为６５．６ ｎｇ／ｍＬ和５３．５２ ｎｇ／ｍＬ ２．７人工模拟污染试验结果应用建立的液相基因 ７８０ 中国预防兽医学报 芯片体系检测３０个随机编号的待检样品，结果显示 ３０份样品中阳性率为９０％（２７／３０）；阴性率为７％ （２／３０）；阳性检出率为９６％；阴性检出率均为１００％， 盲测结果准确率达９８％以上，与预期的结果基本相 符，表明该方法在实际操作中具有一定的可行性。 ２ ５００ ４ ０００ 磐２ ０００ ３ ５００ ３ ０００ ｇ １ ５００ ２ ５００ ２ ０００ 皇 ０００ ｌ ５００ ５００ ｌ ０００ ５００ ０ Ｏ ０ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ ｌＯｌ１ Ｏ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １Ｏｌ１ｌ２ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ 图３液相基因芯片检测弓形 图４液相基因芯片检测旋毛 虫灵敏度结果 虫灵敏度结果 Ｆｉｇ．３ Ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ Ｆｉｇ．４ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｔｅｓｔ ｏｆ Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓ ３讨 论 近年来，尽管建立了多种食源性寄生虫的检测 方法，但均为“单一”法，本研究建立的液相基因 芯片方法打破了传统“一对一”的检测方式，可快 速进行高通量、多指标同步分析，为特异性强、灵 敏性和重复性好的新方法。 在建立方法过程中，基因的选择和探针的设计 至关重要。核糖体ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）是细胞核内编码核 糖体ＲＮＡ的基因，为一类中度重复序列，每个重 复单位由非转录间隔区（ＮＴＳ）、内转录间隔区（ＩＴＳ） 和３种核糖体基因编码区（１８Ｓ、５．８Ｓ、２８Ｓ）组成Ｉ ７ｌ， 不同区域进化速率不同，而且十分保守。因此，本 研究选择旋毛形线虫１８Ｓ基因作为检测的靶基因。 虽然弓形虫Ｂｌ基因的生物学功能尚不清楚，但该 基因是一种多拷贝基因，并且序列高度保守，是目 前鉴定弓形虫最为理想的目的基因之一 ］。本方法 能够特异地对弓形虫和旋毛虫ＰＣＲ产物进行检测， 检测的线性范围广，检测荧光强度的ＣＶ值控制在 统汁学有效范围内，本实验结果均证明该方法具有 良好的稳定性。在验证液相基因芯片灵敏度时，发 现ＰＣＲ产物初始浓度的荧光值并非最高，而是随浓 度的降低呈先升高后下降的趋势，这种变化在其它 文献中尚未报道，暂将其称作液相基因芯片所需 ＰＣＲ产物的最适浓度。虽然本研究在人工模拟污染 试验中取得较好的结果，但在检测实际样本方面， 还有待进一步验证。总之，液相基因芯片技术的开 发及应用将改变食源性寄生虫检测的现状，该方法 的建立为食源性寄生虫的检测提供了实验依据。 参考文献： ［１］ 甘绍伯．病原生物学与感染性疾病［Ｊ］．中国热带医学， ２００６，６（１２）：２１０３—２ｌｌ４． ［２］ 许隆祺，余森海，徐淑惠．中国人体寄生虫分布与危害［Ｍ］． 北京：人民卫生出版，２０００． ［３］ 薛纯良．孕期弓形虫感染的诊断、治疗和预防［Ｊ］．中国寄生 虫学与寄生虫病杂志，２０００，１８（１）：５５—６１． ［４］ Ｂａｓｔｉｅｎ Ｐ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ，２００２，９６（Ｓ１）：２０５—２１５． ［５］ 夏骏，邓菲，金润铭，等．液相芯片ＭＡＳＡ技术用于儿童 呼吸道感染病原学研究［Ｊ］．中国病毒学，２００５，２０（６）： ５８６—５８９． ［６］ Ｋｅｌｌａｒ Ｋ Ｌ，Ｉａｎｎｏｎｅ Ｍ Ａ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ—ｂａｓｅｄ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙｓ［Ｊ］Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ，２００２，３０：１２２７—１２３７． ［７］ 董晓波，李冬梅，花丽茹，等．旋毛虫ＩＴＳ ＩＩ区基因的克隆 及其在分类学上的应用［Ｊ］ｌ畜牧兽医学报，２００６，３７（２）： １７３．１７５． ［８］ 单连玉．ＰＣＲ技术诊断弓形虫病的研究进展【Ｊ］．国外医学寄 生虫病分册，２００２，２９（２）：５８—６５． ［９］ 路义鑫，宋铭忻．各隔离株旋毛虫感染性的研究［Ｊ］．动物医 学进展，２００３，２４（３）：８２—８４． （本文编辑：张朝霞）