一株用于发酵青绿饲料的粪肠球菌及其菌剂的生产方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108179127 A(43)申请公布日 2018.06.19

(21)申请号 201810113500.4(22)申请日 2018.02.05

(83)生物保藏信息

CGMCC No.14617 2017.09.15

(71)申请人 山东江信动物保健科技有限公司

地址 262212 山东省潍坊市诸城市相州镇

振兴街120号(72)发明人 郑江　

(74)专利代理机构 北京世誉鑫诚专利代理事务

所(普通合伙) 11368

代理人 刘玲玲(51)Int.Cl.

C12N 1/20(2006.01)C12N 1/04(2006.01)A23K 30/18(2016.01)

()发明名称

一株用于发酵青绿饲料的粪肠球菌及其菌剂的生产方法(57)摘要

本发明公开了一株用于发酵青绿饲料的粪

其中，该粪肠球菌肠球菌及其菌剂的生产方法，

的保藏编号为CGMCC No.14617；该生产方法包括以下步骤：(1)将菌株接种在种子培养基中，36℃～38℃培养24h；(2)将发酵的种子接入发酵培养基中，36℃～38℃培养24h；(3)将发酵液离心，混入冻干保护剂，冷冻干燥。本发明的有益之处在于：(1)该粪肠球菌可以有效改善青贮饲料的饲用品质，提高青贮饲料的感官评价，调节青贮饲料的pH值，控制氨态氮与总氮的比值，增加乳酸含量；(2)该生产方法发酵时间短，活菌数高，发酵24h后活菌数可以达到2000亿/克以上，冻干后活菌数可以达到400亿/克以上。

C12R 1/01(2006.01)

权利要求书1页 说明书5页

CN 108179127 ACN 108179127 A

权　利　要　求　书

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1.一株用于发酵青绿饲料的菌株，其特征在于，分类命名为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14617，保藏日期为2017年09月15日。

2.含有权利要求1所述菌株的菌剂的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：Step1：将菌株接种在种子培养基中，36℃～38℃培养24h；Step2：将发酵的种子接入发酵培养基中，控制pH值5.0～9.0，发酵温度30℃～40℃，转速200rpm～300rpm，通气比1:0.3～1:0.8，罐压0.02MPa～0.07MPa，培养24h；

Step3：将所得发酵液离心，按菌体：冻干保护剂质量比为1:1～4的比例混合均匀；Step4：将混合后的菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到菌粉。3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，在Step1中，所述种子培养基为TSA培养基。

4.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，在Step2中，所述发酵培养基为：按质量百分比计，胰蛋白胨1.5％、大豆蛋白胨0.5％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、葡萄糖2％、氯化钠0.5％，pH自然。

5.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，在Step3中，所述冻干保护剂为：按重量比计，麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝4～8：1～6：1～3。

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说　明　书

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一株用于发酵青绿饲料的粪肠球菌及其菌剂的生产方法

技术领域

[0001]本发明涉及一株菌株及其菌剂的生产方法，具体涉及一株用于发酵青绿饲料的粪肠球菌及其菌剂的生产方法，属于微生物技术领域。背景技术

[0002]青贮饲料是指：含水率为65％～75％的青绿饲料经切碎后，在密闭缺氧的条件下，通过厌氧乳酸菌的发酵作用，抑制各种杂菌的繁殖，而得到的一种粗饲料。[0003]青贮饲料气味酸香、柔软多汁、适口性好、营养丰富、利于长期保存，是家畜优良饲料来源，主要用于喂养反刍动物，比新鲜饲料耐储存，营养成分强于干饲料。发明内容

[0004]本发明的第一个目的在于提供一株用于发酵青绿饲料、可有效改善青贮饲料的饲用品质、提高青贮饲料的感官评价、调节青贮饲料的pH值、控制氨态氮与总氮的比值、增加乳酸含量的菌株。

[0005]本发明的第二个目的在于提供含有上述菌株、发酵时间短、活菌数高的菌剂的生产方法。

[0006]为了实现上述第一个目标，本发明采用如下的技术方案：[0007]一株用于发酵青绿饲料的菌株，其特征在于，分类命名为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14617，保藏日期为2017年09月15日。[0008]为了实现上述第二个目标，本发明采用如下的技术方案：[0009]含有前述菌株的菌剂的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：[0010]Step1：将菌株接种在种子培养基中，36℃～38℃培养24h；[0011]Step2：将发酵的种子接入发酵培养基中，控制pH值5.0～9.0，发酵温度30℃～40℃，转速200rpm～300rpm，通气比1:0.3～1:0.8，罐压0.02MPa～0.07MPa，培养24h；[0012]Step3：将所得发酵液离心，按菌体：冻干保护剂质量比为1:1～4的比例混合均匀；[0013]Step4：将混合后的菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到菌粉。[0014]前述的生产方法，其特征在于，在Step1中，前述种子培养基为TSA培养基。[0015]前述的生产方法，其特征在于，在Step2中，前述发酵培养基为：按质量百分比计，胰蛋白胨1.5％、大豆蛋白胨0.5％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、葡萄糖2％、氯化钠0.5％，pH自然。[0016]前述的生产方法，其特征在于，在Step3中，前述冻干保护剂为：按重量比计，麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝4～8：1～6：1～3。[0017]本发明的有益之处在于：[0018]1、本发明提供的保藏编号为CGMCC No.14617的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，可以有效改善青贮饲料的饲用品质，提高青贮饲料的感官评价，调节青贮饲料

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的pH值，控制氨态氮与总氮的比值，增加乳酸含量。[0019]2、本发明提供的菌剂的生产方法，发酵时间短，活菌数高，发酵24h后活菌数可以达到2000亿/克以上，冻干后活菌数可以达到400亿/克以上。具体实施方式

[0020]以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。[0021]一、菌株的分离与筛选

[0022]我们将采集于诸城的青贮饲料样品，利用稀释分离培养的方法，涂布于TSA培养基上，在37℃厌氧培养罐中培养24h，然后从中挑选出了生长较快、菌落整齐单一的一株。[0023]随后我们利用16S rRNA序列同源性分析技术对该株菌进行了分子鉴定，并将得到的序列在NCBI中进行了比对，比对结果显示：我们挑选的菌株与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的序列相似性为99％。[0024]2017年09月15日，我们将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.14617。[0025]二、准备培养基[0026]1、种子培养基[0027]种子培养基为TSA培养基：按质量百分比计，胰蛋白胨1.5％、大豆蛋白胨0.5％、氯化钠0.5％、琼脂1.5％，pH自然。[0028]2、发酵培养基

[0029]发酵培养基为新配方培养基：按质量百分比计，胰蛋白胨1.5％、大豆蛋白胨0.5％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、葡萄糖2％、氯化钠0.5％，pH自然。[0030]我们在TSA培养基的基础上省去了琼脂，添加了牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵和葡萄糖，营养更充分，粪肠球菌生长会更快，产量会更高。[0031]三、生产菌剂[0032]1、获得种子液

[0033]将菌株接种在种子培养基中，36℃～38℃培养24h。[0034]在本实施例中，培养温度为37℃。[0035]2、发酵培养

[0036]将发酵的种子接入发酵培养基中，控制pH值5.0～9.0，发酵温度30℃～40℃，转速200rpm～300rpm，通气比1:0.3～1:0.8，罐压0.02MPa～0.07MPa，培养24h。[0037]在本实施例中，发酵条件为：pH值7.0，发酵温度37℃，转速220rpm，通气比1:0.5，罐压0.05MPa。[0038]3、加入冻干保护剂[0039](1)确定冻干保护剂的配方[0040]冻干保护剂为：按重量比计，麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝4～8：1～6：1～3。

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[0041]

[0042]

将所得发酵液离心，按菌体：冻干保护剂质量比为1:1的比例混合均匀，然后将混

合后的菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到菌粉。[0044]对照组：不加冻干保护剂。[0045]经检测，各组菌粉对应的活菌数如下：

[0046]

[0043]

活菌数

1060亿/克1082亿/克1100亿/克1073亿/克1042亿/克500亿/克

[0047]由上表可知，麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖在4～8：1～6：1～3这个范围内，均可较好的保护菌体，其中，麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝6：3：2混合时，保护效果最好。[0048](2)确定冻干保护剂的用量[0049]将所得发酵液离心，按菌体：冻干保护剂(麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝6：3：2)质量比为1:1～4的比例混合均匀，然后将混合后的菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到菌粉，经检测，各组菌粉对应的活菌数如下：

[0050]

第1组第2组第3组第4组第5组对照组

菌体：冻干保护剂活菌数1:11100亿/克1:2700亿/克1:3560亿/克1:4420亿/克

[0051]由上表可知，菌体：冻干保护剂在1:1～4这个范围内，均可较好的保护菌体，考虑到冻干保护剂的使用成本，菌体：冻干保护剂＝1:1是最佳的使用方案。[0052](3)将菌体与冻干保护剂混合

第1组第2组第3组第4组

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在本实施例中，将菌体与冻干保护剂按质量比1:1的比例混合均匀，其中，冻干保

护剂使用的是麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝6：3：2混合。[00]4、冷冻干燥

[0055]将混合后的菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到菌粉。[0056]四、活菌数测定[0057]样品1：发酵液离心后得到菌体，从中采集10g作为样品1。[0058]样品2：冷冻干燥后得到菌粉，从中采集10g作为样品2。[0059]将样品1和样品2分别进行稀释分离培养，涂布在MRS培养基上，培养24h进行活菌落计数。

[0060]

[0061]

[0062]

由上表可知，两样品的活菌数均较高。

[0063]五、发酵青绿饲料[00]取两吨新鲜的、粉碎的玉米秸秆作为基质，向基质中喷洒1kg上述菌粉，然后放入青绿饲料发酵池中，密封发酵45d。[0065]发酵结束后，将饲料搅拌均匀，取100g进行样品鉴定。[0066]1、感官评价

[0067]

颜色气味酸味结构黄绿色，有光泽芳香酸味浓湿润、紧密[0068]由上表可以看出，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.14617的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)可以提高青贮饲料的感官评价，使青贮饲料品相、卖相更好。[0069]2、饲用品质

[0070]从奶牛场随机选择10头成年正常产奶，并且体重在500kg、日产奶量在20kg以上的泌乳牛，其中，5头作为实验组饲喂上述发酵饲料，5头作为对照组饲喂原始饲料。[0071]每天测定平均日产奶量，连续测定7天，测定结果如下：

[0072]

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[0073]

[0074]

由上表可以看出，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.14617的粪肠球菌

(Enterococcus faecalis)可以有效改善青贮饲料的饲用品质，使青贮饲料更有营养，并且更易被吸收。[0075]3、pH值、氨态氮与总氮比值、乳酸含量

[0076]

氨态氮与总氮比值乳酸含量

5.1％1.2％

[0077]由上表可以看出，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.14617的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)不仅可以调节(降低)青贮饲料的pH值，使青贮饲料不易被杂菌污染，有效保护了青贮饲料，而且可以控制氨态氮与总氮的比值(更低)，使青贮饲料蛋白质分解较少，有效保护了青贮饲料的营养，同时还可以增加乳酸含量，乳酸含量是评定青贮饲料品质的可靠指标，优质的青贮饲料中含较多的乳酸，可以提高口感和营养吸收。[0078]需要说明的是，上述实施例不以任何形式本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

pH值4.2

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