生产指导 ＬＩＶＥＳＴ０ＣＫ ＡＮＤ Ｐ０ＵＬＴＲＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ ．．．同 效液相色谱法测定饲料添加剂中的甘露寡糖 Ｃｊ ＪＬ—ｌ 盛欣 （重庆市动物疫病预防控制中心，重庆４０１１２０） 摘要：目的： 建立饲料添加剂中甘露寡糖的高效液相色谱分析方法。方法： 样品经浓盐酸水解后，用氢氧化钠调节 ｐＨ至６～７，过０．２ ｍ滤膜后上机测定。采用Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＳＨ１０１ｌ糖分析柱，０．００５ ｍｏｔ／Ｌ硫酸溶液为流动相，用示差 检测器进行检测。结果：甘露寡糖的定量限为０．０１ ｍｅ／ｍＬ；线性范围为０．０５～０．５０ ｍ ｍＬ；相关系数ｒ ＝０．９９９５。结 论： 所建方法准确、灵敏、简便，适用于饲料添加剂中甘露寡糖的测定。 关键词：饲料添加剂；甘露寡糖；高效液相色谱法；示差检测器 中图分类号：Ｓ８１６．１７ 文献标识码：Ｂ ＤＯＩ：１０．１９５６７／Ｉ．ｅｎｋｉ．１００８—０４１４．２０１７．０４．０２２ 甘露寡糖（Ｍａｎａｎ—ｏｌｉｇｏｓａｃｈａｒｉｄｅ，ＭＯＳ）是由几个甘露糖 分子或甘露糖与葡萄糖通过ｄ一１，２、 一１，３、ｏ【一１，６糖苷键 组成的寡聚糖，广泛存在于多种植物和微生物的细胞壁中 。 ２方法 ２．１标准溶液的配制 甘露糖标准品（德国Ｄｒ，纯度大于９９％），准确称取２５０ ｍｇ （精确至０．１ ｍｇ），置于２５ ｍＬ容量瓶中，用水稀释至刻度。此 甘露糖储备液的浓度为１０．０ ｍｅ／ｍＬ。临用前用水稀释至所需 浓度。 目前作为饲料添加剂使用的甘露寡糖主要来源于酵母细胞提 取物，是二糖、三糖、四糖等的混合物。 在食品安全问题１３益严重的今天，甘露寡糖作为一种新型 绿色饲料添加剂，具有纯天然、安全无残留，化学性质稳定等特 点，能调节机体的免疫机能 ，吸附胃肠道致病菌 ，调节动物 ２．２样品前处理 胃肠道微生态环境，降低腹泻的发生率 ，提高动物日增重和 饲料转化率 等，是一种良好的抗生素代替品，具有很好的应 用前景。 准确称取０．５ ｇ样品（精确值０．００１ ｇ）置于２５ ｍＬ具塞离 心管中，准确加入５ ｍＬ浓盐酸，盖紧盖子，在涡旋振荡器上震 荡数秒至混合均匀。在４０℃恒温水浴锅中放置２ ｈ，取出，放冷 至室温，用１５０ ｍＬ水分多次将离心管中的液体全部转移至２５０ ｍＬ容量瓶中，用５ ｍｏＬ／Ｌ氢氧化钠溶液调节ｐＨ至６～７，用水 定容至刻度，摇匀。过０．２ ｍ滤膜后上机测定。 目前寡糖的检测方法主要有荧光辅助糖电泳法 、高效液 相色谱法 、液质联用法 等。荧光辅助糖电泳法是将荧光标 记技术与聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合起来的一种方法，待测 样品需经过１６ｈ的预衍生，衍生剂会为糖分子带上荧光标记以 及三个负电荷，进而促使待测样品在电场力的作用下得到更好 ２．３液相色谱检测条件 色谱柱：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＳＨ１０１ｌ（３００ ｍｍ ８ ｍｍ，６ Ｈｍ） 的迁移而实现分离。高效液相色谱法是检测各种物质常用的 分析方法。针对糖类化合物的高效液相色谱分析方法主要有 柱前衍生、离子交换、氨基柱分离、糖分析柱分离等。目前还未 见用高效液相色谱法测定饲料添加剂中甘露寡糖的报道，本研 究对样品前处理步骤和液相色谱分析条件进行了优化，建立了 饲料添加剂中甘露寡糖的高效液相色谱检测方法，方法准确、 灵敏、简便。 流动相：０．００５ ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液 流速：０．６ ｍＬ／ｍｉｎ 柱温：６５℃ 进样体积：２０ Ｌ ３ 结果 ３．１系统适用性实验 在上述色谱条件下，取甘露糖标准溶液进样分析，结果显 １仪器与试剂 Ａｇｉｌｅｎｔ １１００高效液相色谱仪（美国），ＨＷＳ恒温水浴锅 （上海），Ｖｏｒｔｅｘ—Ｇｅｎｉｅ ２涡旋振荡器（美国），ＳｅｖｅｎＣｏｍｐａｃｔ ｐＨ 计（上海），ＭＥＴｒＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ电子分析天平（瑞士）。 示甘露糖色谱峰峰宽较窄，峰形对称，无拖尾、分叉、前沿现象， 保留时间合适。理论塔板数大于１．６×１０ 。甘露糖标准品色 谱图见图１。 ３．２专属性 按上述前处理方法处理空白样品和饲料添加剂样品后上 盐酸、硫酸、氢氧化钠，均为分析纯。 机测定，结果显示：在该色谱条件下，样品基质中杂质峰能与甘 露糖色谱峰完全分离，杂质不干扰甘露糖的测定。空白样品和 饲料添加剂样品的色谱图见图１（Ｂ）、１（Ｃ）。 ３．３标准曲线、线性和检出限 收稿日期：２０１７—０２—１５ 配制浓度分别为０．０５、０．１０、０．２０、０．２５、０．５０ ｍｓ／ｍＬ的系 ３８ ２０１７年第４期（总第３３５期） 畜禽业 生产指导 ｎＫｌＵ ｎＲＩＵ ４０００ ４０００ ３０００ ３０００ ２０００ ２０００ 』 ． １０００ ８ ｌｏ０ｏ Ｏ ——、 ————＿＿、／ 一 ／＼ 。 ４．２水解时间的考察 Ｊ【 ＼ＪＬ — √＾ ～ 图１ 甘露醇标准溶液（Ａ）、空白样品（Ｂ）、饲料添加剂样品（Ｃ）的色谱图 列标准溶液，在上述色谱条件下进样分析，以甘露糖浓度为横 坐标，对应峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程Ｙ＝０． ３２６２ｘ＋０．００１１，相关系数ｒ２＝０．９９９５。取甘露糖标准溶液进 行逐步稀释，上机测定，以信噪比（Ｓ／Ｎ）≥１０计，获得甘露糖检 测的定量限为０．０１ ｍｇ／ｍＬ。结果显示，甘露糖在０．０５—０．５０ ｍｇ／ｍＬ浓度范围内均呈良好的线性关系。 分别准确称取等量的饲料添加剂样品，各加入５ ｍＬ浓盐 酸后，分别于４０℃水浴条件下水解０．５ ｈ、１ ｈ、２ ｈ、３ ｈ、４ ｈ后上 机测定，结果见图２，可见，饲料添加剂样品在２ ｈ后样品已经 完全水解，故选择水解时间为２ ｈ。 ｌｌ 二 １ｊ２ ３ １ｊ４ ５ ６５结论 建立了饲料添加剂中甘露寡糖的ＨＰＬＣ检测方法，从样品 提取与净化，色谱条件等方面进行了优化，并对专属性、线性范 围、定量限等进行了方法学考察。结果显示，本方法准确、灵 鲁 昌 敏、简单，适用于饲料添加剂中甘露寡糖的检测。 参考文献 蛏 鞲 妆 血 寇庆，梁咪娟，淘亮亮，等．甘露寡糖的研究与应用［Ｊ］． 粮食与饲料工业，２０１２（５）：５７—５９． 石军，李俊婷，陈安国．甘露寡糖的生理功能及其在动物 生产中的应用［Ｊ］．饲料博览，２００２（１０）：１０—１１． 赵蕾，王志祥，李葱晓．甘露寡糖的研究进展及其在家禽 生产中的应用［Ｊ］．新饲料，２００７（８）：３５—３７． 水解时间（ｈ） 张建刚，李文婷，侯玉洁，等．甘露寡糖在养猪生产中的 图２水解时间对单糖浓度的影响 应用进展［Ｊ］．养猪，２０１２（２）：１７—２Ｏ． 梁永，李彪，戴晋军．甘露寡糖在饲料工业上的应用进展 ［Ｊ］．饲料研究，２０１３（１）：３２—３３． 陈晓菁．植物与微生物细胞壁糖的荧光辅助糖电泳分析 ３．４甘露糖标准溶液的稳定性 配制高、中、低３种浓度的甘露糖标准溶液，分别在放置的 第１天，第３天，第５天，第８天和第１０天上机测定，记录相应 的峰面积，计算得到峰面积ＲＳＤ≤３．５％，提示甘露糖标准溶液 ［Ｊ］．华中科技大学硕士学位论文，２００５：１６—１７． 裘雅渔，李巧玲，程和勇．高效液相体积排阻色谱法分析 黄秋葵多糖的单糖组成［Ｊ］．实验室研究与探索，２０１４， ３３（１２）：２７—３０． 在放置１０ ｄ含量基本无变化。 ４讨论 ４．１ 甘露寡糖水解溶剂的选择 张运涛，陶冠军，王林祥，等．液质联用技术分析甘露寡 糖类水解常用的水解剂有盐酸和三氟乙酸等。本研究比 较了盐酸和三氟乙酸的水解效果。实验发现，三氟乙酸挥发性 极大，水解时必须完全密闭，否则三氟乙酸极容易挥发损失，影 响水解的效果和结果的重现性。而采用盐酸为水解溶剂时，一 糖［Ｊ］．色谱，２００２，２０（４）：３６４—３６６． 作者简介： 盛欣（１９８６一），女，重庆忠县人，硕士，兽医师，主要从事 饲料检测工作。 般的具塞塑料离心管就能满足要求，结果重现性较好，且毒性 较小，故选择浓盐酸（３７％）作为水解溶剂。
