土壤提取微生物实验

生93 沈睿 2009012372 同组成员：赵磊 徐鲁斌

实验日期：2011-3-17

一．实验目的

1. 掌握细菌涂片的制备方法

2. 掌握细菌简单染色法和革兰氏染色法的原理及操作步骤 3. 学习无菌操作技术

二．实验原理

1. 细菌的简单染色

细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷易被带负电荷的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。简单染色法即在染色过程中只用一种染料。

2. 革兰氏染色

细菌根据细胞壁结构可以分为两类，一类（G-）细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的脂类物质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，当用乙醇脱色时，脂类物质被溶解，细

胞璧通透性增加，甲紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌被脱色，再经番红复染就变成了红色。另一类（G+）细胞壁中肽聚糖层后且交联度高，脂含量少，经脱色反

而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留原来颜色。

三．实验器材

1. 普通光学显微镜、酒精灯、打火机、接种环、载玻片、擦镜纸、擦镜液、镜油、无

菌牙签

2. 菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、未知菌种S1、未知菌种S2

3. 草酸铵甲紫染液、革氏碘液、95%乙醇溶液、番红染液

四．实验步骤

1. 载玻片处理：洗净的载玻片浸泡在75%乙醇中，取一块纱布擦干，在涂菌位置的背

面用记号笔画圈标记，涂菌部位用火焰烤，可除去油脂。

2. 涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，于载

玻片涂成薄层（背面有圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片，用接种环从斜面上（或用无菌牙签从口腔里）挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。注意在拔或塞试管塞时，应将试管口在火焰处略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

3. 干燥：涂片后室温下自然干燥，也可酒精灯上略加温，迅速干燥，但勿靠近火焰。 4. 固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速

来回移动3-4次，共约3-4秒。要求玻片温度不超过60oC，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。 5. 染色：

初染：滴加1滴结晶紫染液，染色1分钟，水洗，吸干。（至此步骤后，直接进行

镜检即为简单染色法的操作过程，但在简单染色中的可使用各种染液）

媒染：再加1滴碘液覆盖涂片1分钟，水洗。

脱色：用吸水纸吸去玻片上的残留水，用滴管滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。

复染：滴加蕃红染液复染约2分钟，水洗。

镜检：吸干水后，盖上盖玻片观察标本，注意细菌形态、大小、排列和颜色。

五．实验结果

1． 普通染色结果

图1 枯草芽孢杆菌（400×）

经草酸铵甲紫普染呈现紫色，另有特殊结构芽孢（箭头所指）

2． 革兰氏染色结果

1） 枯草芽孢杆菌

图2 枯草芽孢杆菌（1000×）

染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌，另有特殊结构芽孢（箭头所指） 2） 大肠杆菌

图3 大肠杆菌（1000×） 染色结果为红色，是革兰氏阴性菌

3） 金黄色葡萄球菌

图4 金黄色葡萄球菌（1000×） 染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌

4） 酵母菌

图5 酵母菌（1000×）

染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌，能观察到出芽（箭头所指） 5） 未知菌S2

图6 未知菌S2（1000×）

染色结果为红色，是革兰氏阴性菌，从形状看应属于杆菌

6） 牙垢

图7-1 牙垢中的链杆菌（1000×） 染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌

图7-2 牙垢中的杆菌和球菌（1000×）

左菌群染色结果为红色，是革兰氏阴性菌；右菌群染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌

图7-3 牙垢中的链球菌（1000×）

染色结果介于红色和紫色之间，红色可能是番红染液残留，故推断是革兰氏阳性菌

7） 革兰氏染色结果汇总 菌种

枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌

酵母菌 未知菌S2 牙垢（链杆菌）

革兰氏染色结果

紫色

红色 紫色 紫色 红色 紫色

形状 杆状 杆状 球状 椭球状 杆状 杆状

菌体排列 革兰氏鉴定结果 分散，偶成短链 阳性

分散 聚集

分散 分散 链状

阴性 阳性 阳性 阴性 阳性

牙垢（杆菌） 牙垢（球菌） 牙垢（链球菌）

红色 紫色 紫色

杆状 球状 球状

聚集 聚集 链状

阴性 阳性 阳性

表1 革兰氏染色结果汇总表

六．实验讨论

1. 分析影响某一微生物的革兰氏染色结果的因素

1） 菌龄：取处于对数生长期的细菌，此时生长旺盛，个体数目较多，便于观察，

结果典型。若菌龄过大，细菌大量死亡或部分菌自然溶解，造成细胞壁通透，

阳性菌出现假阴性，使得染色结果受到干扰。 2） 清洁载玻片：在涂菌处用酒精灯烤，除去油脂。

3） 涂菌：不宜太薄，否则菌的数量太少；不宜太厚，否则菌体大量聚集、重叠，影响观察，可能还会留住残余染料，影响判断。

4） 热固定：温度不能太高，否则会造成细菌结构的破坏。同样也不能太低，否则导致菌体固定不牢，水洗时会被冲去。 5） 染色：染料应过量，避免结晶。

初染和媒染：时间在30-60秒为宜，过长则不易脱色。 复染：时间可稍长，约2分钟。

6） 脱色：20-30s，以流下的脱色液无色为准，否则制片上会留有杂质或造成假阳性或假阴性。

7） 水洗：要充分，否则制片上会留有杂质。

2. 未知菌鉴定

未知菌S2经革兰氏染色后为红色，所以是革兰氏阴性菌。 3. 牙垢里微生物描述

观察牙垢涂片能发现我的牙垢里球菌较多，还有一定量的杆菌。这些不同的微生物

经革兰氏染色后，大部分呈现紫色，也有呈现红色的，即大部分为革兰氏阳性菌，少数为革兰氏阴性菌。这可能和口腔内会一直分泌唾液有关，细胞壁较厚、保卫能力更强的革兰氏阳性菌更能在这样的环境中生存。 4. 解释平常使用的甲紫药水的杀菌机理

甲紫药水即1%-2%龙胆紫水溶液或酒精溶液。龙胆紫是一种碱性阳离子染料，其阳

离子能与细菌蛋白质的羧基结合，从而影响其代谢，对革兰氏阳性菌有选择性抑制作用，因而产生杀菌作用。对革兰氏阳性菌，特别是葡萄球菌、白喉杆菌，对白色念珠菌也有较好的抗菌作用。它杀菌力强，对组织没有刺激性。

七．致谢

非常感谢陈老师、以及几位助教，是你们的帮助和指导让我们顺利地完成了本次

实验。还有要感谢同组的两位同学，借数码相机给我使用，实验后也进行了一些交流，对实验反思很有促进作用。

八．参考资料

1.《微生物学实验指导》，清华大学出版社，陈金春 陈国强 主编，2005年8月