人脐带华通胶间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

人脐带华通胶间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的：建立并优化人脐带间充质干细胞分离纯化方法，并对其表面标志与多向分化潜能进行鉴定。方法：收集健康足月产胎儿脐带组织，采用组织块贴壁法进行原代培养，流式细胞仪对其表面标志进行检测，通过向成骨成脂分化对其多向分化潜能进行鉴定，RT-PCR对其干细胞特性基因Oct4、Nanog、Sox2、Nestin进行检测。结果：采用组织块贴壁法可在2周左右获得大量间充质干细胞，培养的细胞经流式细胞仪检测，高表达CD29、CD44、CD105、CD106，低表达CD34、CD45；经成骨成脂诱导2周后可分化为成骨细胞和成脂细胞，RT-PCR检测发现原代细胞表达Oct4、Nanog、Sox2、Nestin基因。结论：人脐带间充质干细胞可在体外扩增培养，具有多向分化潜能，可作为组织工程种子细胞来源。

标签： 人脐带间充质干细胞；原代培养；分离鉴定

虽然胚胎干细胞具有全能性，可分化为各个胚层的细胞，但其来源还存在伦理和法律上的争议，且致瘤性目前还无法控制。与胚胎干细胞相比，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）则因具有多向分化潜能、易培养、扩增能力强、来源广等优势而被大量用于实验和临床研究。在各种成人干细胞中，目前研究较多的是骨髓MSC，因其可以作为自体移植的干细胞来源。但骨髓的获取属于侵入性检查，来源有限，且骨髓MSC的量、增殖效率、分化潜能有着明显的个体差异，会随着年龄的增加而显著减少，因此寻找新的干细胞来源成为当务之急。

研究發现，可以从多种组织如骨髓、脂肪组织、脐带血、胎盘等中分离得到MSC。相比骨髓，脐带属于医用废弃物，具有较低的免疫原性，容易获得，相对纯净，不会给供者带来痛苦，致瘤性、病毒和细菌污染的可能性均较骨髓MSC低。此外，与骨髓MSC相比，人脐带MSC（human umbilical cord MSC，hUCMSC）具有更强的增殖能力，其独特的多潜能特性能在体外保留更长时间，因此成为干细胞研究的重要来源。我们尝试从脐带组织中分离得到MSC，并从细胞免疫表型及其多向分化能力方面对其进行研究，为其临床应用提供相应的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验在实验室完成。健康新生儿脐带取自医院妇产科足月剖宫产的胎儿，其获取得到了医院伦理委员会的批准和病人的知情同意。

α-MEM、DMEM、成骨成脂分化培养基（Invitro？gen 公司）；胎牛血清（FBS）（Gibco 公司）；CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD106 单克隆抗体（eBioscience 公司）；RNA Simple Total RNA kit、Quantscript RT kit（大连宝生物公司）；流式细胞仪（Epics XL公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 脐带MSC的分离、培养

从手术室取得新鲜健康新生儿脐带，用PBS将脐带冲洗干净，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1 mm3大小，加入α-MEM培养液，于37℃、5% CO2培养箱中培养，培养液中含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素，待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.3 流式细胞仪检测

将原代细胞消化下来后，加PBS调整细胞浓度至1×106/mL，取200 μL细胞悬液按组合方案分别加入5 μL荧光标记的单抗（CD29-FITC，CD34-FITC，CD44-FITC，CD45-CY5，CD105-PE，CD106-PE）混匀，室温下避光孵育20 min，于流式细胞仪中检测。

1.4 成骨成脂细胞分化

取P3细胞消化传代后，以约105/孔接种到6孔板中，成脂、成骨分化及对照各2孔，待细胞贴壁后，向分化组加入相应的分化培养液。成骨分化培养基中含0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸盐和50 μmol/L抗坏血酸，成脂分化培养基中含1μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、60 μmol/L 吲哚美辛和5 U/mL胰岛素，每3～4 d换液1次，分化2周后，用4%低聚甲醛将细胞固定，分别用碱性磷酸酶和油红O染色，苏木精复染，于显微镜下观察。

2 结果

2.1 细胞增殖形态改变

脐带组织培养5～7 d天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，1周后细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，10 d左右去掉组织块，15 d左右可铺满培养瓶的90%。传代后的细胞呈纤维状生长，细胞在增殖传代过程中形态无明显改变。（图一）

2.2 流式细胞仪检测

流式细胞仪检测结果显示，脐带 MSC 高表达CD29、CD45、CD105、CD106，低表达或不表达CD34、CD45。

2.3 成骨成脂分化

成脂诱导分化1周后，显微镜下可见胞质内有少量脂滴形成，2周后，油红O染色可见胞质内有较多油滴空泡；成骨分化14 d，碱性磷酸酶染色后可见胞浆内大量的棕黑色钙结节。（图二）

图2 成脂（A）和成骨（B）诱导分化14 d（100×）

3 讨论

脐带组织中富含干细胞，研究表明，平均每厘米脐带组织中含4×105干细胞，远高于骨髓中。目前，hUCMSC的获取主要有组织块贴壁法与酶消化法。

由于酶对细胞的损伤较大，且细胞得率较低，费用昂贵，因此本实验采取了组织块贴壁法进行培养，培养的细胞可稳定传代，传代后生长迅速，细胞形态与增殖能力没有明显改变。采用组织块贴壁法，组织块在培养5～7 d时有少许细胞开始爬出，细胞呈典型的纺锤形，体积和胞核较小，且增殖较快。同时在原代培养过程中我们发现，当组织在添加有高浓度谷氨酰胺的DMEM培养液中培养3周左右时，细胞体积和胞核明显增大，且细胞呈不规则的多角形，随着培养时间延长，细胞活性下降，部分细胞开始凋亡，传代后的细胞也增殖较慢，体积较大；而换用不另加谷氨酰胺的培养基后，细胞呈体积较小、形态相对均一的梭形。研究表明，细胞培养液中谷氨酰胺的自然分解及能量代谢会产生大量有较强细胞毒性的氨，体外培养中，细胞生长受高浓度谷氨酰胺的抑制作用明显。因此，我们认为原代细胞培养所用培养基应尽量新鲜配置，且不需要另外添加高浓度的谷氨酰胺。hUCMSC 能表达多种细胞表面标记，包括CD10、CD29、CD44、CD59、CD90、CD105、CD106、CD166、CD73、CD49e、CD54、CD200，还可以表达HLA-Ⅰ类分子，但不表达或低表达造血干细胞及引起移植物抗宿主反应的重要表面标记，如 CD80、CD86、CD40及HLA-Ⅱ类分子。本研究选取了几个报道较多的表面标记 CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD106进行检测，结果除CD34、CD45低表达外，其他均高表达，与报道相符。由于对于脐带间充质干细胞表面特异性抗原缺乏研究，因此将其向成骨成脂分化是对其多向分化潜能进行鉴定的最有力证据。本实验通过成骨成脂诱导分化，证实了hUCMSC的多向分化潜能，因此hUCMSC可作为一种种子细胞向其他细胞进行诱导分化，有望治疗相应的临床疾病。目前，有研究表明，hUCMSC可以向肝细胞、神经细胞、胰岛内分泌细胞分化，为帕金森病、脊柱损伤等神经损伤性疾病及糖尿病的治疗带来了新的希望。

综上，我们采用组织块贴壁法建立了一种稳定而成熟的hUCMSC原代细胞培养及传代培养的方法，并通过对其表面标志、多向分化潜能的检测，对其生物学特性进行了初步研究，为其临床应用提供了一定的理论基础。

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