兔抗人PDGF2A抗体的制备与鉴定

兔抗人PDGF2A抗体的制备与鉴定

张　萍,费玲玲,程希平,高立志,焦西英,陈镔复,鞠　躬(第四军医大学基础部神经科学研究所,陕西西安710032)

关键词:抗体;转染;特异性鉴定;兔中图分类号:R392.11　　　文献标识码:B

　　血小板衍生的生长因子(platelet2derivedgrowthfactor,

PDGF)是由A、B链通过二硫键连接而形成的二聚体。有研究

表明,PDGF2A参与创伤愈合过程中的炎症反应、肉芽组织和瘢痕形成1。另外,PDGF2A对雄性小鼠生殖系统的发育也起着决定性的作用,提示其对于生殖系统某些疾病的诊断和治疗可能具有重要意义2。为此,我们制备了兔抗人PDGF2A的抗体,为进一步研究PDGF2A的功能提供有用的试剂。

1　材料和方法

1.1　材料　PCRkit、pEGFP2C3购自Clontech公司。AgarosegelDNAextractionkit购自Roche公司。融合表达载体pGEX2PDGF2A由本实验室构建3。各种性内切酶及T4DNA连接酶,

均购自Promega公司。HRP标记的山羊抗兔IgG购自Boster公司。生物素化的山羊抗兔IgG和ABC(生物素2卵白素2辣根过氧化物酶复合物)购自Vector公司。弗氏佐剂购自Sigma公司。COS27细胞为本室冻存的标准细胞株。新西兰种雄性大白兔(BW2.5kg)由本校实验动物中心提供。

1.2　方法

1.2.1　抗原的制备　利用RT2PCR法,从人肝癌细胞系HHCC

的总RNA中反转录PDGF2A的全长cDNA,再用PCR法扩增

PDGF2A成熟肽的全长编码序列。将其测序验证后,克隆入表

达载体pGEX24T21中,构建PDGF2AcDNA的原核表达载体

pGEX2PDGF2A。将含重组表达载体pGEX2PDGF2A的工程菌,

在含氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基中过夜培养后,按

10%的接种量转接于含氨苄青霉素(100mg/L)的新鲜LB培养

基,以250r/min的转速于37℃摇菌至A600=1,加入IPTG(终浓度为0.5mmol/L)于37℃继续通气诱导培养4～5h。收集菌体,经超声破菌、离心,收获上清和沉淀,分别制样进行SDS2

PAGE。电泳结果显示,

工程菌可表达Mr

为

44000的GST2PDGF2A融合蛋白,主要以包涵体的形式存在。

采用本实验室常用的方法,用8mol/L尿素对以包涵体形式存在的GST2PDGF2A融合蛋白进行变性后,利用精氨酸对其进行复性。对GST2PDGF2A融合蛋白,采用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱进行纯化。纯化产物经100g/LSDS2PAGE,表明其Mr为440003。

1.2.2　兔抗人PDGF抗体的制备　将原核表达的pGEX2PDGF2AGST融合蛋白进行100g/LSDS2PAGE后,于相应的Mr处将收稿日期:2003-09-28;　修回日期:2003-11-12作者简介:张　萍(1978-),女,陕西西安人,助理实验师.

Tel:(029)83374474

含融合蛋白条带的凝胶切下,置于液氮中冻结后研成粉末,冻存于-20℃作为免疫原。选用纯种雌性新西兰大白兔,经背部皮下多点(不少于8点)和　窝皮下单点注射抗原进行免

疫,共免疫4次,每隔3wk免疫1次。初次免疫每只兔用0.4

mg抗原加完全弗氏佐剂,以后3次的抗原量均为0.2mg加不完全弗氏佐剂4。

1.2.3　抗血清的滴度测定及特异性鉴定　(1)抗血清的滴度

测定:于末次免疫后7d,耳静脉取血分离血清,以间接E2

LASA法测定血清抗体的效价5。(2)采用蛋白印迹法鉴定抗

血清的特异性:未经纯化的GST2PDGF2A原核表达产物,制样后进行100g/LSDS2PAGE,并转移至NC膜上。依次经10g/L

BSA封闭、加兔抗GST2PDGF2A的血清(10-6)、分别与生物素

化的山羊抗兔的IgG(1200∶)和生物素化2卵白素2辣根过氧化物酶复合物(ABC,1200∶)孵育后,用DAB法显色。同时,为验证抗体的特异性,用纯化的PDGF2A(10-6mol/L)和GST(10-6

mol/L)分别与抗GST2PDGF2A的血清(10-6)混匀,4℃吸收过

夜后取得吸收液;以两种吸收液作为一抗分别与样品(未经纯化的GST2PDGF2A原核蛋白表达产物)孵育,其他同上。为了鉴定抗血清对真核表达蛋白的特异性,将PDGF2A的编码核苷酸片段亚克隆入真核表达载体pEGFP2C3中,酶切鉴定获得阳性克隆(pEGFP2C32PDGF2A)后,转染至COS27细胞中。48h后收集细胞,用RIPA(PBSpH7.4、EGTA1mmol/L、DOC5g/L、

EDTA4mmol/L、SDS1g/L、PMSF1mmol/L及蔗糖250mmol/L)

裂解液裂解细胞,提取蛋白,加入4×loadingbuffer,沸水中变性5min,进行SDS2PAGE后,转移至NC膜上。以空载体

pEGFP2C3转染的细胞抽提蛋白为对照,用制备的兔抗人GST2PDGF2A的血清(5×10-4)进行Westernblot。

2　结果

2.1　兔抗人PDGF2A抗血清的效价测定　用ELISA测定抗体

的效价达10-4后,从兔颈动脉取血分离血清,分装后于

-20℃冻存备用。4次免疫后,ELISA检测血清抗PDGF2A抗

体的滴度为110∶4

,抗GST抗体的滴度为1200∶。

2.2　抗体特异性的鉴定　吸收实验验证,兔抗人PDGF2A抗

血清能与原核表达的Mr为44000的GST2PDGF2A融合蛋白带起反应。用PDGF2A吸收后的抗血清不能再与原核表达的

GST2PDGF2A的融合蛋白带起反应;而经GST吸收后的抗血清

与原核表达的GST2PDGF2A的融合蛋白的反应性不变(图1A)。另外,兔抗人PDGF2A的抗体能与阳性克隆转染细胞表达的

Mr为45000的GFP2PDGF2A蛋白条带起反应;而不能与空载

转染细胞表达的蛋白起反应(图1B)。

(下转440页)

440ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2004,20(4)HAb18inradioimmunaldiagnosisofhumanhepatocellularcarcinomaJ.

ChinJOncol,1992,14(1):9-12.

结合力)筛选出阳性克隆的同时,还可防止筛选过程中结合力低而亲和力高的抗体丢失7。本实验中,我们应用嵌合L链进行导向链替换,以增加模板的人源化水平,排除在抗体展示、筛选过程中,鼠源和人源抗体序列的差异对抗体构象的影响,进而影响抗体的亲和力。

在抗体基因库的筛选过程中,一般采用噬菌体展示技术(噬菌体ELISA),对筛选抗体的多样性、特异性和亲和力进行分析鉴定,但结果的可靠性差。在对M13载体构建的抗体基因库的筛选中,应用IPTG进行诱导,可使目的抗体以pⅢ2scFv融合蛋白

2JespersLS,RobertsA,MahlerSM,etal.Guidingtheselectionofhuman

antibodiesfromphagedisplayrepertoirestoasingleepitopeofanantigenJ.

Biotechnol,2000,12:9-903.

3RaderC,BarbasCF.III.Phagedisplay,alaboratorymanunlM.Cold

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bodylibraryJ.

etal.Constructionofalargenaγvehumananti2

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etal.By2passingimmunization

5MarksJD,GriffithsAD,HoogengoomHR,

phageantibodylibrary:buildinghighaffinityhumanantibodiesbychainshuf2flingJ.

Biotechnology(NY),1992,10(7):779-783.

etal.Invitroassemblyofrepertoiresof

JMolBi2

6FiginiM,MarksJD,WinterG,

的形式可溶性表达,对培养上清中的目的蛋白可用ELISA检测8。本实验中,我们对细菌裂解上清中

antibodychainsonthethesurfaceofphagebyrenaturationJ.

ol,1994,239:68-78.

的pⅢ2Fab融合蛋白进行了ELISA和FCM分析,对筛选的目的蛋白进行鉴定表明,可以抑制交叉反应,提高筛选目的抗体的效率。

7BeiboerSHW,ReursA,RooversRC,etal.Guidedselectionofapan

carcinomaspecificantibodyrevealssimilarbingdingcharacteristicsyetstructuraldivergencebetweentheoriginalmurineantibodyanditshumanequivalentJ.

JMolBiol,2000,296:833-849.

8PeneffC,LefrancMP,DariavachP.Characterisationandspecificityof

参考文献:

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twosingle2chainFvantibodiesdirectedtotheproteintyrosinekinaseSykJ.

JImmunolMeth,2000,236:105-115.

(上接436页)

　　本研究中我们采用原核表达并经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱纯化的GST2PDGF2A融合蛋白为免疫原,免疫新西兰大白兔,制备了抗PDGF2A的抗血清。经ELISA法测定抗血清的抗

4

体滴度效价达110∶。免疫印迹的结果显示,免疫血清与原核

表达的蛋白可产生特异性的结合反应。兔抗人PDGF2A抗体的制备,为进一步研究PDGF2A的功能提供了有用的试剂。

参考文献:

1

α在单纯创伤和照秦全红,王德文,彭瑞云,等.PDGF2A、PDGFR2射复合创伤愈合过程中伤口成纤维细胞内的表达与意义J.华放射医学与防护杂志,2002,22(6):401-404.

中

图1　兔抗人PDGF2A抗体特异性的免疫印迹分析

A:抗血清与原核表达的GST2PDGF2A的反应.M:蛋白marker;1:兔

抗人PDGF2A的抗血清作为一抗;2:兔抗人PDGF2A的抗血清与纯化的PDGF2A的吸收液作为一抗;3:兔抗人PDGF2A的抗血清与纯化的

GST的吸收液作为一抗.B:抗血清与真核表达的GFP2PDGF2A的反

2GnessiL,BascianiS,MarianiS,etal.Leydigcelllossandspermato2

genicarrestinplatelet2derivedgrowthfactor(PDGF)2A2deficientmiceJ.3

JCellBiol,2000,149(5):1019-1026.

应.M:蛋白marker;1:兔抗人PDGF2A抗血清与pEGFP2C32PDGF2A转染后表达蛋白的反应;2:兔抗人PDGF2A抗血清与空载体pEGFP2C3转染后表达蛋白的反应.

费玲玲,张　萍,黄文晋,等.人PDGF2A基因的克隆、表达及表达产物的纯化J.

细胞与分子免疫学杂志,2002,18(4):339-341.

4李改丽,王百忍,费玲玲,等.COX22的基因克隆和多克隆抗备J.

生物化学与生物物理进展,2003,30(3):478-482.

西安:第四军医大学出

3　讨论

PDGF是一种具有神经营养活性的生长因子6。在人的

5金伯泉.细胞和分子免疫学实验技术M.版社,2002:1-48.

胚胎发育、伤口愈合、胶质细胞增生和动脉粥样硬化的病理发生等过程中都有PDGF参与。PDGF可促进伤口深部的成纤维细胞和肉芽组织的增生,从根本上影响皮肤细胞。PDGF2A对男性生殖系统的发育与繁殖也起着决定性的作用2。

6王　尧,杜子威.神经生物化学与分子生物学M.生出版社,1997:65-66.

北京:人民卫