全长cDNA酶切和连接体系

F5、F6和F7片段的连接，F5(Not I/ Fsp I)、F6(Fsp I/Csp45 I)、F7(Csp45 I/Sal I)分别进行酶切，将载体pGEM5zf同时进行Not I/Sal I双酶切，分别将各酶切产物进行纯化回收。由于F5片段和载体pMD18-T大小相近，故无法回收酶切后的目的片段，所以F5片段直接采用PCR产物进行双酶切。各片段的酶切体系如下： 灭菌去离子水 10×buffer BSA DNA 酶1 酶2 4.3µl 2µl 0.3µl 12µl 0.7µl 0.7µl 37℃，酶切3h，回收各酶片段。20µl酶切体系 酶切buffer F5用buffer D、F6用buffer B、F7用 buffer D

F21和F22的连接，将F21和F22 PCR测序片段分别用Nhe I酶切后，回收目的条带，将二者用T4 DNA酶连接后，克隆到T-easy载体上。即为连接全长所用的F2片段。连接时，直接用设计时的两端酶切位点。

LF3和LF4同样用Acc III酶切后，用T4 DNA连接酶连接，再克隆到pMD-18T载体上，用于5’半长的连接。

F21、F22连接酶切体系：

Nhe I 1µl；10×M buffer 2µl；DNA 17µl； F3、F4连接酶切体系：

Acc III 1µl；10×F buffer 2µl；BSA 0.2µl；DNA 16.8µl。 37℃ 3h酶切。纯化回收时，注意各种性酶的灭活(65℃,10min)。 连接体系：

T4 DNA连接酶buffer 2µl；T-easy(F2) or pMD-18T(F34) 2µl；回收DNA片段15µl；T4 DNA连接酶 1µl。16℃ 6h，再4℃过夜。转化感受态JM109。

5’半长cDNA酶切体系： 体系 灭菌水 10×buffer BSA DNA 酶1 酶2 T4 DNA ligase 10×buffer F1 pGEM-5zf(+) 40µl体系 2.4 Buffer D 4 0.6 30 Not I Sal I 5’半长连接体系 20µl 1.1 2 5.3 10µl 0.5 1 2.7 1.5 1.5 F1片段 30µl体系 4.0 Buffer D 0.6 20 Not I Pvu I 1.2 1.2 3 F2片段 40µl体系 2.4 Buffer D 0.6 30 Pvu I Nsi I 4 F34片段 40µl体系 2.4 Buffer D 0.6 30 1.5 Nsi I 1.5 Sal I 1.5 1.5 4 F2 F34 pGEM-5zf(+) 5.3 5.3 1 2.7 2.7 0.4 16℃，过夜，次日4℃保存至闪日下午转化。 全长连接时的5’半长与3’半长酶切体系 40µl体系 10×D buffer 灭菌水 BSA DNA 酶1 酶2 37℃ 3h。 酶切后纯化回收时，依据连接时DNA的用量，最后一步适量入无核酸酶水。 全长连接体系：20µl T4 DNA连接酶 1µl 10×buffer 2µl 5’-half 8µl 3’-half 8µl pGEM-5zf(+) 1µl

16℃连接6小时后，4℃放置过夜，次日下午转化。分别取10µl转化一管感受态JM109。涂板，挑斑，鉴定。

5’-half 4 2.4 0.6 30 Not I Spl I 1.5 1.5 3’-half 4 2.4 0.6 30 Spl I Sal I 1.5 1.5