中国人兽共患病学报 １０６４ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ２０１３，２９（１１） ＤＯＩ：１０．３９６９／ｃｊｚ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００２—２６９４．２０１３．１１．００６ 手工ＭＧＩＴ法检测结核分枝杆菌异烟肼 和利福平耐药的效果评价 潘爱珍，柳正卫，吴蓓蓓，王晓萌 摘 要：目的 评价ＭＧＩＴ手工荧光判读法在检测结核分枝杆菌耐药的基层应用价值。方法 以常规Ｌ－Ｊ比例法为参照 方法，比较分析手工荧光ＭＧＩＴ液体药敏法检测３００株临床结核分离株异烟肼和利福平药敏效果。结果 手工ＭＧＩＴ液体 药敏法检测异烟肼和利福平灵敏度和特异度分别为９４．７ 和９２．６ 、９５．６ 和９８．８ 。两种药敏方法的异烟肼符合率 ９５．７ ，利福平符合率９７．７ ，两种方法检测异烟肼和利福平敏感性的差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。液体药敏阳性报告时 间平均７．６ ｄ，比传统比例法报告时间提前２Ｏ．４ ｄ。结论 手工ＭＧＩＴ液体药敏法与常规Ｉ 一Ｊ比例法检测异烟肼和利福平敏 感性结果一致性高，能快速、准确检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药，适合基层推广。 关键词：手工ＭＧＩＴ；结核分枝杆菌；药敏实验 中图分类号：Ｒ３７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２—２６９４（２０１３）１１—１０６４—０３ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｍａｎｕａｌ ＭＧＩＴ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｉｓｏｎｉａｚｉｄ ａｎｄ ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ ＰＡＮ Ａｉ—ｚｈｅｎ，ＬＩＵ Ｚｈｅｎｇ—ｗｅｉ，ＷＵ Ｂｅｉ—ｂｅｉ，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ—ｍｅｎｇ （Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００５１，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｈｅ ａｉｍ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｉｓ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｎｕａｌ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｔｕｂｅ （ＭＧＩＴ）ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｔｅｓｔ ｏｆ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｔｈｒｅｅ ｈｕｎｄｒｅｄ Ｍ＿ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｆｏｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｉｓｏｎｉａｚｉｄ ａｎｄ ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ ｂｙ ｔｈｅ ｍａｎｕａｌ ＭＧＩＴ，ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｏｓｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｎ Ｌ－Ｊ ｍｅｄｉｕｍ ｗｈｉｃｈ Ｗ＆Ｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ａ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ９７．７％ａｃｃｕｒａｃｙ，９５．６ Ａ０ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ ９８．８ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｗｅｒｅ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｆｏｒ ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ．Ｆｏｒ ｉｓｏｎｉａｚｉｄ，ａｃｃｕｒａｃｙ。ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｗｅｒｅ ｌｏｗｅｒ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ．ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，ｗｉｔｈ ａ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ９５．７ ，９４．７ ａｎｄ ９２．６ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＴｈｅｒｅ ｗａｓ ｒｉｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｔｏ ｉｓｏｎｉａｚｉｄ ａｎｄ ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐ＞０．０５）Ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｏｂ— ．ｔａｉｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗａｓ ｉｎ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ７．６ ｄａｙｓ ｂｙ ｔｈｅ ｍａｎｕａｌ ＭＧＩＴ ａｎｄ ４ ｗｅｅｋｓ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄＩｔ’Ｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ．ｍａｎｕａｌ ＭＧＩＴ ｉｓ ａｎ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｔｅｓｔ ｏｆ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｔｏ ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ ａｎｄ ｉｓｏｎｉａｚｉｄ．ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗ ｇｏｏｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍａｎｕａｌ ＭＧＩＴ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｎ Ｌ—Ｊ ｍｅｄｉｕｍ，ａｎｄ ｉｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｉｎ １ａ— ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｉｎ ｖｉｌｌａｇｅ ｌｅｖｅ１． ＫＥＹ Ｗ０ＲＤＳ：ｍａｎｕａｌ ＭＧＩＴ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ－一ｔｈｅ Ｍａｊｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ＆ Ｈｅａｌｔｈ ｉｎ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ（Ｎｏ．ＷＫＪ２０１０—２—００５） 在各种耐药结核病中，耐多药结核病（ｍｕｌｔｉ— ｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ＭＤＲ—ＴＢ）已成为结核 标的实现。ｗＨＯ最新统计显示，全球有２２万一４Ｏ 万例ＭＤＲ—ＴＢ患者，其中６０ 分布在印度、中国和 俄罗斯联邦＿】］。为有效开展耐多药结核病防治工 病防治的难点和热点，严重影响全球结核病控制目 作，我省成功申请了全球基金耐多药结核病防治项 卫生部科学研究基金一浙江省医药卫生重大科技计划“结核病聚集性 感染疫情应急处置支撑技术研究”（Ｎｏ．ＷＫＪ２０１０—２—００５） 作者单位：浙江省疾病预防控制中心，杭州 ３１００５１； Ｅｍａｉｌ：ｘｉａｏａｉ６３１＠１６３．ｃｏｒｒ１． 目，该项目实施以来，已分别在５个地市建立了市级 耐多药结核病诊治中心，目前已发现并治疗了一批 耐多药肺结核病人。由于传统培养与药敏检测方法 １１期 潘爱珍等：手工ＭＧＩＴ法检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药的效果评价 １．５．１ 比例法药 １０６５ 耗时较长，影响耐多药结核病例的发现和治疗。 目前我国的ＢＡＣＴＥＣ系统，但由于在基层广 泛。因此选择快速、简便，价格低廉选择手工ＭＧＩＴ 液体药敏法，并对其与Ｉ 一Ｊ比例法药敏效果进行比 较，评估其在基层应用价值。 １材料与方法 １．１ 对象收集３００株临床分枝杆菌分离株，其中２７０株 临床分离菌株来自耐多药诊治中心的２７０例病人和３Ｏ株由 根据ＷＨＯ推荐的耐药百分比判读是否耐 耐药百分比一嘉案 ＿；｛鋈｝｝量羹 ￣１００ 若耐药百分比＞１ ，则认为受试菌对该抗结核药耐药。 １．５．２液体药敏 当生长对照管为阳性，开始判读药敏试 验培养管的结果，时间为２ ｄ。药敏试验培养管在对照管阳 性后的第２ ｄ仍为阴性，判定为敏感；药敏试验培养管与对 照管同一天或晚１～２ ｄ为阳性，则判定为耐药。 １．６质量控制 每批药敏敏感性试验以结核分枝杆菌标准 国家结核病参比实验室提供全国第５轮药敏熟练度测试质 株Ｈ。 ｎｖ敏感株作为对照来检测含药培养基质量和检验操 控菌株。 作规范。 １．２ 仪器与试剂ＭＧＩＴ液体培养管、ＭＧＩＴ营养添加剂 １．７统计学方法应用ＳＰＳＳ １３．０软件卡方检验，进行数 （ＯＡＤＣ）、分枝杆菌联合药敏试剂盒及荧光判读仪Ｍｉ— 据处理。两种检测结果的一致性用Ｋａｐｐａ检验，Ｋａｐｐａ值 ｃｒｏＭＧＩＴ由美国ＢＤ公司提供。其中联合药敏试剂盒中药 ≥Ｏ．７说明两种方法具有较好的一致性，０．７＞Ｋａｐｐａ≥０．４ 物终浓度为：异烟肼０．１ ｇ／ｍｌ ，利福平１．０ ｇ／ｍＩ 。固体 两者一致性一般；Ｋａｐｐａ（０．４两者一致性较差。以Ｉ 一Ｊ比 药敏培养基由杭州嘉伟生物有限公司提供，其中药物终浓度 例法检测结果为判断标准，计算手工ＭＧＩＴ法的敏感度、特 为异烟肼０．２ ｇ／ｍｌ ，利福平４Ｏ ｇ／ｍＩ 。 异性和符合率。 １．３结核分枝杆菌标准株Ｈ。 Ｒｖ（敏感型）来自中国疾病 预防控制中心传染病预防控制所结核病室／传染病预防控制 ２ 结 果 国家重点实验室结核病室。由浙江省疾控预防控制中心传 ２．１ 两种方法的药敏结果比较 应用ＭＧＩＴ法与 代培养、保藏。 Ｌ—Ｊ固体比例法检测３Ｏ株国家药敏熟练度测试质 １．４方法 控株和２７０例结核杆菌临床分离菌株的药敏结果， １．４．１ 传统比例法按照《结核病诊断细菌学检验规程》 比例法操作，接种后的培养基于３７℃，至４周后报告结果。 ＩＮＨ药敏结果相符２８６株，不符１４株，符合度 １．４．２液体药敏培养基的制备 用４ ｍＩ 无菌蒸馏水／去 ９５．３％；ＲＦＰ药敏结果相符２９３株，不符７株，符合 离子水溶解异烟肼和利福平冻干药物，分装置于一２Ｏ℃备 度９７．７ ，一致性高，Ｋａｐｐａ值分别为０．８７９和 用。 ０．９２０，见表１。手工ＭＧＩＴ液体药敏法和传统Ｌ－Ｊ １．４．３ 接种及孵育取出１ ｍＩ 阳性菌液（直接液体阳性菌 比例法在检测临床结核分枝杆菌异烟肼和利福平药 液或将新鲜的固体阳性培养物研磨成０．５个麦式比浊度的 敏中差异无统计学意义Ｙ 一１．７９，Ｐ ＞０．０５；．）（；＝＝＝ 菌悬液）加至４ ｍＩ 无菌生理盐水中，作１：５稀释。取３支 ０．０，Ｐ２＞０．０５）。 ＭＧＩＴ管，分别标注对照管、含药管的标识；每管加入０．５ ２．２两种方法结果报告时间比较 手工ＭＧＩＴ液 ｍＩ ＯＡＤＣ（无ＰＡＮＴＡ的），在含药管中分别加入１００ Ｉ 抗 体药敏报告时间平均为７．６ ｄ（３～１４ ｄ），传统比例 结核药物（生长对照管中不加入抗生素），再在每管中加入 法报告时间为２８ ｄ。ＭＧＩＴ液体药敏法在１０ ｄ内 ０．５ ｍＩ埽 释后的菌液。放置于３７℃孵育，３ ｄ后取出ＭＧＩＴ 耐药检测率是８７．０ ，见表２。 培养管用荧光判读仪进行检测，直至得到最终结果。 １．５结果判读 表１ 两种不同方法药敏检测结果比较 Ｔａｂ．１ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ 注： 一１．７９，Ｐ１＞ｏ．０５； 一０．０，Ｐ２＞ｏ．０５ １０６６ 中国人兽共患病学报 ２０１３，２９（１１） ３讨 论 有必要的。 耐药结核病，尤其是耐多药结核病已成为严重 的公共卫生问题。我国的耐药结核病流行情况也较 为严重，耐多药率达８．３２ ，每年新发ＭＤＲ—ＴＢ患 者１２万例，约全球每年新发耐多药患者总数的１／ ４，位居全球第２位口］。控制耐药结核病的发生、传 播和流行，有效地措施之一是快速、特异、准确地药 敏试验，为Ｉ临床制定科学合理的治疗方案提供依据。 １９９６年美国ＢＤ公司继１９７７年研制出参一 Ｂａｃｔｅｃ 一 ４６０ＴＢ系统后，又研制出ＭＧＩＴ系统（包括手工 ＭＧＩＴ和Ｂａｃｔｅｃ ＭＧＩＴ ９６０／３２０分枝杆菌全自动快 速培养仪）。手工ＭＧＩＴ优势在于仅需一个小巧的 半自动判读仪或紫外灯，操作简单且低廉，不象 Ｂａｃｔｅｃ ＭＧＩＴ ９６０／３２０分枝杆菌全自动快速培养仪 设备昂贵，体积大占用空间。 本研究显示手工ＭＧＩＴ的异烟肼、利福平药敏 试验结果与Ｌ—Ｊ比例法一致率分别是９３．１ ， ９７．５ ，Ｋａｐｐａ值分别为０．８７９和０．９２０。两种药 物敏感性、特异性和符合率与国外相关研究报道的 ９４ ～１００ 基本一致ｌ４ ］。可见手工ＭＧＩＴ法与 “金标准”Ｌ—Ｊ比例法具有很高的一致性。检测时间 方面，手工ＭＧＩＴ法具有很大的优势，药物平均７．６ ｄ就能出药敏报告，与相关研究＿４。］的６～８．８ ｄ基本 一致。本次研究比Ｌ—Ｊ比例法缩短了２０．４ ｄ，利于 耐多药病人早诊断和早期合理的治疗。 随着分子生物学技术的发展和广泛应用，各结 核实验室均能在１～２ ｄ内快速检测耐药基因型从 而诊断耐多药患者，然而由于试剂仪器昂贵不适合 基层实验室推广。同时我们也应该注意到临床用药 更多依赖于菌株的表形耐药非基因耐药。 因此发展适用的快速检测耐药表型的方法是很 收稿日期：２０１３—０７ ０３；修回日期：２０１３ ０９—１ ６