大肠杆菌

北京五中分校 李思佳 指导教师 韩竹 戴毅新

【摘要】 大肠杆菌是基因工程研究中最常用的原核表达宿主系统。大肠杆菌表达体系与植物表达体系相比具有培养条件简单，生长周期短，操作简便等优点。将植物基因分别转化大肠杆菌表达体系和植物表达体系，并在胁迫培养基中进行功能验证，分析结果表明大肠杆菌表达体系具有与植物表达体系相似的作用。

【关键词】大肠杆菌、基因分离鉴定、基因表达、功能验证、胁迫

【前言】

一、 问题的提出

生物课上老师讲到细菌的用途和危害时，同学们自己归纳出了很多细菌的危害，如可以引发人和动物的肺炎、腹泻、败血症、霍乱和肺结核等疾病；植物的叶斑病和萎蔫等。细菌的益处是可以制酒、酱油、醋，还可以利用细菌发电。老师引导我们说：细菌（如大肠杆菌）还有很多用途，同学们课下可以查找一些资料，做一些实验探究。于是，我就查找了相关资料，了解到大肠杆菌是基因工程研究中最常用的原核表达宿主系统。国内有研究人员利用这个原核表达体系筛选出了植物的抗旱基因。那么这个体系除此之外还有哪些作用呢？这个体系与植物表达体系相比较具有哪些特点？带着这些疑问，在老师和家长的帮助鼓励下，我翻阅了相关书籍，从大肠杆菌的胁迫培养条件及体系开始进行了研究。

二、 研究背景及目前国内外研究和应用现状

大肠杆菌属原核生物。细胞呈杆状，直径约1微米，长约2微米，两端钝圆，周身具鞭毛，可运动。革兰氏染色为阴性，不形成芽孢。在固体培养基生长的菌落为圆形，白色或黄白色，光滑而具闪光，低平或微凸起，边缘整齐。最适条件下培养20分钟可繁殖1代。大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人的大肠中并不致病，但偶尔侵入到阑尾、胆囊、腹腔或泌尿系统时，可发生炎症。在工业生产中，大肠杆菌可用以制备L-门冬酰胺酶，此酶是治疗白血病效果较好的一种药物。在水质监测方面，根据其有无及其数量多少，可作为检测水质状况和污染程度的重要指标。大肠杆菌是现代生物学中研究最多的一种细菌，作为一种模式生物，其基因组序列已全部测出。大肠杆菌是微生物遗传学研究的材料和基因工程中最常用的宿

主细胞。

植物功能基因组学是一个崭新的研究领域。其研究方法正在不断发展和完善。植物功能基因组学的研究将不仅会使我们全面、客观地了解基因的功能，而且将有助于我们更好的利用这些研究结果有目的地改造植物性状，使其更好地服务于人类社会。但由于植物生长周期长，植物转化技术一直是植物功能基因组学研究的瓶颈，因此，寻找、提供一种简单快速的基因功能研究方法将大大促进植物功能基因组学研究的飞速发展。大肠杆菌具有生长周期短、操作技术简单和容易培养的特征，经常被选用为高效表达外源基因的首选体系。Yamada等人在大肠杆菌中应用功能筛选法研究了红树植物CCTα基因的抗盐和渗透胁迫功能，又在大肠杆菌、酵母及烟草细胞中表达红树AOC基因，分析了AOC基因的耐盐机制。近年来，深圳大学郑易之研究组也利用大肠杆菌功能筛选法分离出大豆耐盐基因，但利用大肠杆菌快速检测植物功能基因的研究未见报道。

三、 创新突破

1、应用软件分析并结合大量实验结果，为植物功能基因组学研究提供了一种简便快捷的研究方法。

2、以植物PM11基因为例，验证了其在大肠杆菌体系及在植物体系中显示出相似的作用。

3、结合其他研究人员的研究成果（深圳大学余玉雯等利用此大肠杆菌表达体系，已分离鉴定出一些耐盐基因）。分析归纳出此体系具有：生长周期短，操作简便、高效，易于培养等特点。

4、此体系可适用于不同的研究目的（功能基因分离鉴定、外源基因高效表达、基因功能的验证），是一种简便快捷的值得推广运用的大肠杆菌功能验证系统。

【研究过程】 一、材料与方法 1、实验材料和仪器

大肠杆菌：Escherichia coli JM109， DH5α，TOP10，BL21 star； 根癌农杆菌：LBA4404；

载体及重组质粒：pET28a-PM11，pBI 121；

抗生素及试剂：氨苄青霉素，卡那霉素、链霉素(Sm)、羧苄青霉素(Cb)、利福平，IPTG，X-gal；

植物激素：6-BA、NAA。

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仪器：超净工作台、离心机、可见紫外分光光度计、光照培养箱、摇床、加液器等 2、培养基及溶液配制 （1）常用培养基

LB培养基（1升）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH7.0（固体培养基每升加15g琼脂粉），高压灭菌；

YEB培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0（固体培养基每升加15g琼脂粉），高压灭菌；

YEP固体培养基（1升）：蛋白胨10g，酵母10g，牛肉浸膏5g，pH7.0琼脂粉15g，高压灭菌；

MS基本培养基：MS大量元素、微量元素、有机物，30g蔗糖，8g琼脂，pH5.8；高压灭菌；

烟草分化培养基：MS培养基+0.2mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA，pH5.8；高压灭菌； 烟草选择培养基：MS培养基+0.2mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+100 mg/L kana+500 mg/LCb，pH5.8；高压灭菌；

烟草生根培养基：MS培养基+0.05mg/L NAA+100 mg/L kana+500 mg/LCb，pH5.8；高压灭菌。

（2）常用溶液的配制

氨苄青霉素（Amp）贮液（100mg/ml）：100mg Amp溶于1ml蒸馏水中，0.22μm 滤膜过滤，-20℃保存。

卡那霉素（50mg/ml）：500mg 卡那霉素溶于10ml蒸馏水中，0.22μm 滤膜过滤，-20℃保存。

利福平（5g/L）：500mg利福平溶于约20ml甲醇中，溶解后加蒸馏水至总体积为100ml。 羧苄青霉素（500mg/ml）：5g羧苄青霉素溶于10ml蒸馏水中，0.22μm 滤膜过滤，-20℃保存。

二、试验方案及实施过程

为比较大肠杆菌异源表达体系与植物表达体系是否具有类似的验证植物基因功能的作用，我们将含有大豆LEA基因的重组质粒分别转化大肠杆菌表达体系和植物表达体系，并在干旱胁迫和渗透胁迫条件下进行诱导，记录并观察实验现象，分析大肠杆菌表达体系的优点及可能的应用推广价值。

1、 配制胁迫培养基

（1） 胁迫固体培养基（每升加琼脂15g）

1000 mM NaCl LB固体培养基: 蛋白胨10g， 酵母5g，NaCl 58.44g 800 mM KCl LB固体培养基: 蛋白胨10g， 酵母5g， KCl 59.64g 1500 mM Sorbitol LB固体培养基: 蛋白胨10g， 酵母5g，Sobitol 22.33g. （2） 胁迫液体培养基

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800mM NaCl LB液体培养基(1L):蛋白胨10g， 酵母5g， NaCl 46.75g 700 mM KCl LB液体培养基(1L): 蛋白胨10g， 酵母5g， KCl 52.185; 1200mM Sorbitol LB液体培养基: 蛋白胨10g， 酵母5g，Sobitol 218.5g. 2、 重组质粒在大肠杆菌中的表达及胁迫处理

将重组质粒转化E.coli BL21 Star（DE3），经IPTG（终浓度1mM，34℃ 180rpm）诱导4h后，进行全蛋白的SDS-PAGE（结果略）。将重组质粒转化菌和空载体转化菌培养过夜。次日以1%比例扩培至OD600=0.6，加IPTG（1mM）诱导4小时后，调整菌液的OD600值至0.8，作为基本培养物。将基本培养物稀释100倍，取50μl分别涂布于含有1000 mM NaCl、800 mM KCl的固体培养基平板上。37℃培养箱中培养48小时后记录菌斑数目。

取基本培养物分别移入含800 mM NaCl、700 mM KCl的液体培养基中诱导培养，每隔一定时间用紫外可见分光光度计测OD600值。

所有实验结果均为三次重复。 3、 植物转化及胁迫处理

无菌的烟草叶盘在含有PM11基因的根癌农杆菌农杆菌工程菌菌液中浸泡10min后，转入上铺一层滤纸的MS基本培养基中；28℃暗培养三天后，将材料转到含有抗生素的分化培养基中在16 h白天、8 h黑夜的光周期和25℃条件下进行培养；待抗性芽长至2－3cm高时，切下小芽转入生根培养基中诱导生根。经分子生物学检测为转基因植株的茎段插入到含1.5%NaCl的固体生根培养基中进行培养。培养25-30天，观察和记录转基因烟草植株的生长状况。

三、数据记录及结果分析

1、对照菌及重组菌在几种固体培养基上的生长状况

将同样量的对照菌和三种重组菌（pET28-PM11、pET28-PM30和pET28-ZLDE-2）菌液分别涂布于1000 mM NaCl 和800 mM KCl固体培养基上。经过一段时间培养，未见到对照菌生长，而pET28-PM11和pET28-PM30重组菌落的数目分别在500或1000个左右，pET28-ZLDE-2的菌落数目均在0～50个之间。在1500mM山梨醇固体培养基中只有pET28-PM30重组菌有1000个左右菌落生长，未见对照菌和其余两个重组菌株pET28-PM11 和pET28-ZLDE-2生长（表1）。

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表1 对照菌和重组菌在胁迫固体培养基上生长状况

菌株

1000mM NaCl

pET28对照菌 pET28-PM11 pET28-PM30 pET28-ZLDE-2

－ ＋＋ ＋＋ －

800mM KCl

－ ＋＋＋＋ ＋＋＋ －

1500mM Sorbiol

－ － ＋＋＋＋

－

－”示无菌落或数目<100个菌落，“＋”示250个菌落 2、对照菌及重组菌在几种液体培养基中的生长状况 我们将对照菌和三种重组菌分别接种于正常液体培养基中培养。经过1小时的延迟期后，均开始生长，并很快进入对数生长期，8小时后对照菌和重组菌的生长进入稳定期(结果未给出)。可见LEA基因在大肠杆菌中的过量表达并没有对其生长产生显著影响。

在800 mM NaCl的液体培养基中，对照菌的生长延迟期达48小时左右，之后进入对数期,75小时左右时进入稳定期。与对照菌相比，三种重组菌的延迟期较短，pET28-PM11、pET28-PM30和pET28-ZLDE-2的延迟期分别为32小时、35小时和42小时；75小时左右达到稳定期（图1）。

在含700 mM KCl的液体培养基中，对照菌经过35小时的延迟期后，其生长进入对数期，58小时左右达到稳定期。与之相比，pET28-PM11和pET28-PM30重组菌的延迟期分别提前到17小时和21小时，在45小时左右达到稳定期，且pET28-PM30菌比对照菌和pET28-PM11重组菌还显示出较高的生长量。然而，pET28-ZLDE-2菌的生长状况不及对照，迟滞期为40小时，60小时左右达到稳定期（图2）。

综合上述结果可以看出，在大肠杆菌中PM11和PM30基因的表达，使重组子菌株对高NaCl和高KCl胁迫有较好的抗性。ZLDE-2基因的表达赋予重组子对高NaCl有较好抗性，而对高KCl抗性提高无明显效果。因此，三种不同的LEA基因的表达对重组菌抗性提高的作用效果不同，其抗逆机制也可能不同。

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OD6001.41.21.00.80.60.40.20.00 pET28¶ÔÕÕ¾ú pET28-PM11 pET28-PM30 pET28-ZLDE-210203040T(hour)50607080

图1 对照菌和重组菌在800 mM NaCl液体培养基中的生长曲线

OD6002.82.42.01.61.20.80.40.00102030T(hour)405060 pET28¶ÔÕÕ¾ú pET28-PM11 pET28-PM30 pET28-ZLDE-2

图2 对照菌和三种重组菌在700 mM KCl液体培养基中的生长曲线

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3、利用植物表达体系验证PM11基因功能

（1）PM11基因转化烟草 采用叶盘法将含PM11基因的农杆菌转化烟草叶片（图3），并经分子生物学手段检测出22株转基因植株。

图3 再生苗的生根情况（左图为转空载体苗，右图为转基因苗）

（2）转基因烟草的耐盐性鉴定

为验证植物PM11基因在大肠杆菌体系中的作用是否与其在植物体系中的表现相同，将获得的转PM11基因烟草植株（实验组）及转pBI121空载体烟草植株（对照组1组）载入到含1.5%NaCl的固体培养基中。经过10-15天的培养，对照1组的烟草植株叶片从主叶脉处开始显示出变黄，经过25-30天培养，对照2组的植株的逐渐变黄，叶片略窄，植株略显矮小，而实验组的转基因烟草叶片仍显示绿色，叶片较饱满（图4）。

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实验组（1-6） 对照2组（7-9） 对照1组（10） （转PM11基因烟草植株） （转空载体） （转空载体） 1.5%NaCl培养基 1.5%NaCl培养基 正常盐培养基 8 9 10

4、两种体系的比较

体系名称 培养条件 生长周期 方法 作用 原核表达、基因分离鉴定、功能验证 真核表达、功能验证 大肠杆菌表达体系 37℃ 25℃,16 h白天、8 h黑夜的光周期 75小时达稳定 简便易行 植物表达体系

2-3个月 7

转化技术，专业

【结论】

1、PM11基因、PM30基因和ZLDE-2基因的表达产物可赋予重组菌株良好的抗逆性。 2、将PM11基因转化的烟草植株可表现出对高盐（1.5%NaCl）有良好的耐受性，进一步证实了PM11蛋白对高等植物在高盐胁迫下可起到保护作用。

3、大肠杆菌异源表达体系是用来研究植物基因的耐盐机制、验证耐盐基因功能的简单、快捷作用体系。

【讨论】

1、关于大肠杆菌体系异源表达体系。

大肠杆菌最基本最常用的作用是原核表达的宿主细胞。此外，利用其功能筛选法从可以筛选出植物耐盐基因（国内外各有一例报道）。本文为大肠杆菌的耐盐基因功能验证作用提供了实验数据。在应用此大肠杆菌体系时，应根据不同的研究目的，调整体系的组分和浓度，操作方法也不尽相同。

另外，此体系目前仅限于胁迫相关基因（如耐盐、抗冻、渗透等）的分离鉴定、基因表达及功能验证等，其他作用还有待于开发，所以期待更多的同学和研究人员进一步研发并推广。

2、表达的蛋白特点。

利用此体系表达的蛋白一定是可溶性蛋白，有生物活性，否则不能验证其功能。本文列出的三个基因全部是可溶性蛋白，有强的亲水性。其中的ZLDE-2具有分子伴侣功能，所以在功能验证体系中表现出与其他两种蛋白不同的反应现象。以下是利用DNAsis软件分析的结果：

（1）利用DNAsis软件分析此蛋白质的疏水和亲水性质，得到PM11蛋白的亲（疏）水性分布图（图5）。从分布图可以看出，该蛋白质的平均亲水指数为-1.56，全部序列均处于亲水性区域，其中第44-63氨基酸为由20个氨基酸构成的LEA GroupⅠ保守区基序，可能形成该蛋白的活性功能区。

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图5 PM11编码的氨基酸的亲（疏）水性分析

注：阈线以下为亲水性区域

（2）利用DNAsis软件分析此蛋白质的疏水和亲水性质，得到PM30蛋白的亲（疏）水性分布图（图6）。从分布图可以看出，该蛋白的平均指数为-1.42，全部序列均处于亲水性区域，其中第31-74氨基酸为由3个11-氨基酸构成的LEA 3保守基序，该区段可能形成该蛋白的活性功能区。

图6 PM30编码的氨基酸的亲（疏）水性分析

注：阈线以下为亲水性区域

（3）用DNasis软件分析ZLDE-2编码的氨基酸的亲（疏）水性（图7），可知，该蛋白质的平均指数为-1.26蛋白序列的大部分均处于亲水性区域，可见它是亲水性很强的蛋白。

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图7 ZLDE-2编码的氨基酸的亲（疏）水性分析

注：阈线以下为亲水性区域

【收获体会】

初一时我参加了学校组织的在平谷中学举办的中学生科技比赛，看到学哥学姐们用自己的聪明才智，创造出很多新颖的小发明，他们还研究出很多新理论，简直象科学家一样伟大！我也被他们的精神所感染，和爸爸妈妈提出：我也要搞研究！然而即使是想一个适合我的题目都很难。一次在学校的生物课上，我突然对大肠杆菌的应用非常感兴趣。看书，上网，咨询专家，终于定了方案，我可以做实验了！虽然不是我全部独立完成的，但我的收获还是很大。

第一，能够自己在参考书中找问题的答案了。记得在上学时，妈妈就给我买了一本英国的小学生生物课本，因为书里的图多词少。我总是要依赖爸爸和妈妈讲给我。现在遇到了问题，等不及他们找答案再告诉我，我只好自己试着翻看了，不知不觉中，原来神秘的基因和大肠杆菌也不再是生词了。

第二，锻炼了动手能力。以前在家里，什么事情都是妈妈帮做了。现在做起了实验，连培养基都是自己准备（称量一定要准确）。我培养了仔细认真的好习惯。

第三，吃苦能力和独立性增强了。现在的学习任务紧了，作业很多，我每周还上一次小提琴课，妈妈让我选择一样放弃，我不愿意。有时回家时已是10点多钟，每天早上还要6点半起床，没有休息日，可我还是感到很高兴，习惯就好了。

通过本次科技活动的参与，我的学习能力和动手能力提高了，也养成了坚强的性格和好的行为习惯，收获很大。

【致谢】

最后，我想感激老师和学校为我们提供了这么好的一个锻炼平台。感谢戴主任、韩老师对我的支持。感谢中科院微生物所几个老师和学生对实验方面的帮助。更要感谢我的父母对我的鼓励和生活上的照顾。我想，参赛的结果并不重要，我在这个过程中的成长一定会令我受益匪浅的。

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【参考文献】

[1] 人民教育出版社生物室 编译. 高中生物图解与练习-4 《微生物与生物技术》. 人民教育出版社

[2] 吴松刚 主编. 《微生物工程》. 科学出版社

[3] 陈章良 主编. 《植物基因工程研究》. 北京大学出版社

[4] 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 D W. 《分子克隆实验指南》. 黄培堂译. 科学出版社 [5] 余玉雯等. 大豆耐盐相关基因的分离及其功能鉴定. 深圳大学学报.2004, 21(4): 324-329

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