新型抗生素麦拓莱霉素分离纯化过程的优化

新型抗生素麦拓莱霉素分离纯化过程的优化　

刘玉强，　王志平，　葛志强，　元英进　

(天津大学化工学院制药工程系，天津 300072)

摘 要：综合应用高效液相色谱HPLC、高效薄层色谱TLC技术、微生物抗菌活性检测方法，通过正交实验设计，对新型抗生素麦拓莱霉素在发酵液分离提纯过程中不同pH、温度、除蛋白工艺中的稳定性进行了研究. 考察了影响该抗生素稳定性的主要因素及其交互作用，提出了合理的抗生素分离纯化工艺流程，为相关抗生素的分离纯化及发酵液体系处理提供参考.

关键词：HPLC；麦拓莱霉素；分离；稳定性；TLC

中图分类号：TQ46 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2005)02−0205−04

１　　前　言　

麦拓莱霉素(Maituolaimycin)是一种新型大环内酯类抗生素，其对肺炎链球菌Streptococcus pneuoncae、化脓链球菌Streptococuus pyogenes、粪肠球菌Enterococcus faecalis等具有显著活性，更有意义的是其对罗红霉素有耐药性的肺炎球菌敏感，在解决临床肺炎球菌耐药性问题方面体现了其重要应用前景.

由于麦拓莱霉素为大环内酯类抗生素，表现出结构和生物活性上的不稳定，在该抗生素的分离纯化过程中，已发现多种因素均可影响其抑菌活性，其中温度、pH值、除蛋白处理是三个主要因素. 本工作利用高效液相色谱HPLC、高效薄层色谱TLC分析方法，结合抗菌生物活性检测技术设计了正交实验，探索了影响麦拓莱霉素稳定性的一般规律，可以为类似的不稳定大环内酯类抗生素或天然产物的分离纯化提供参考.

[2]

[3]

[1]

纯化所得，纯度>95%.　２．２　方法　

2.2.1 麦拓莱霉素的分析检测条件

高效液相色谱HPLC分析检测条件：流动相为甲醇:0.5%醋酸铵水溶液(65:35)，流速0.3 mL/min，检测波长2 nm，进样体积10 µL，室温检测. 样品1 mL以甲醇定容于10 mL容量瓶中，0.22 µm微孔滤膜过滤.

高效薄层TLC分析检测条件：展开剂为氯仿:甲醇(9.2:0.8)，上行展开，2 nm下观察暗斑.

抗菌生物活性检测条件：杯碟法检测抗生素活性，枯草芽孢杆菌作生物活性指示菌种，蛋白胨细菌固体培养基. 向灭菌后的培养皿中平铺培养基，再铺一薄层枯草芽孢杆菌细菌孢子，平放牛津杯，向其中注入100 µL待测样品，28󰀀培养24 h后，测量每个样品的抑菌圈直径d，计算稀释倍数k. 计算k采用抗生素在琼脂培养基中的扩散方程式[5]，回归分析后得公式：lnk= 0.0052d2−4.8331. 将发酵原液稀释为1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32及原液，分别测定麦拓莱霉素的生物活性，回归置信度为99.05%.

2.2.2 麦拓莱霉素的温度、pH值、除蛋白等处理条件

温度处理：取一定体积的发酵液，置于温度已经稳定在25, 50和75󰀀的恒温水浴中8 h.

pH值处理：取一定体积的发酵液，用2 mol/L的NaOH调节pH值至9和10，或用2 mol/L的HCl调节pH值至4, 6, 7.

除蛋白处理：取一定体积的发酵液，加入5倍无水乙醇，使其含醇量达85%，在5℃下搅拌30 min，离心，将蛋白沉淀析出，过滤，于60℃温度、１８　Pa压力下减压回收乙醇溶剂至干，用蒸馏水稀释至原体积，得乙醇

２　　实验材料与方法　

２．１　材料　

高效液相色谱仪(HPLC)：WatersTM 泵系统，Lab Alliance UV检测器，WatersTM µBonda−pak C18(3.9 mm×300 mm, 5 µm)反相色谱柱；乙腈购自Fisher试剂(USA)，超纯水用Millipore Q−2设备制备；超级恒温水浴(天津市中环实验电炉有限公司)；高效荧光硅胶薄层板Kieselgel 60F2购自Merck；pH计402pH/mV(上海精密仪器厂).

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis为本实验室保存；麦拓莱霉素发酵液，本实验室自制.

麦拓莱霉素标准品，为本实验室经过制备液相色谱

收稿日期：2004−04−19，修回日期：2004−07−08

基金项目：国家863高新科技基金资助项目(编号：2001AA214081)

作者简介：刘玉强(1958−)，男，天津市人，硕士研究生，副高级工程师，研究方向：天然产物的分离纯化；元英进，通讯联系人.

206 过 程 工 程 学 报 第5卷

除蛋白处理的发酵液；取同样体积的发酵液，加入300万分子量的聚丙烯酰胺(PAM)10 mg/L，搅拌1 h，用0.2 µm微膜真空过滤，滤液为PAM除蛋白处理的发酵液.

根据温度、pH值、除蛋白处理三因素对发酵液中Maituolaimycin活性的影响大小、各因素间的交互作用及影响程度，设计选取三因素三水平正交实验L9(34) 考

表１　Ｌ（３）正交实验设计　

Table 1 Orthogonal design of L9(34)

Level 1 2 3

Temperature (󰀀)

25 50 75

pH 4 7 10

Deproteination

None Ethanol PAM

Error 1 2 3

９

４

察Maituolaimycin分离纯化过程的优化工艺，见表1.

选择三因素二水平正交表L8(27)考察其交互作用，结果见表2.

每个正交实验序号取20 mL做2组平行实验，反应8 h，反应后的样品同时取出放入冰水中，调pH至7，补加蒸馏水至20 mL后，进行抗生素抗菌活性检测和HPLC及TLC[4]检测.

３　　结果与讨论　

３．１　正交实验的抗生素抗菌活性　

抗菌活性检测正交实验结果见表3, 4，M为活性组分浓度. 显著性检验得出，只有pH的影响显著性水平在F0.25以上，说明发酵液的pH值是影响Maituolaimycin活性的主要因素. 通过I/k的比较可以得出，分离纯化最优化条件为pH=10，25℃和乙醇除蛋白处理.

表２　正交实验Ｌ８（２７）各因素及水平　

Table 2 Level and factor design of L8(27)

Factor 1 2

Temperature (󰀀)

25 75

pH 6 9

Deproteination

No Yes

表３　生物检测结果　

Table 3 Results of antibacterial activity test

No. a b c d e f g h i F F0.25

1

Temperature (󰀀)

25 25 25 50 50 50 5 75 75 2.21461

3

2 pH 4 7 10 4 7 10 4 7 10 6.02844 3

3

Deproteination

No Ethanol PAM Ethanol No PAM PAM No Ethanol 2.02187 3

4 Error 1 2 3 3 1 2 2 3 1

d (cm) 1.1 3.0 2.9 0.85 2.7 2.9 0.0 2.0 2.8

Result k 0.015 0.852 0.627 0.012 0.350 0.466 0.008 0.063 0.466 Reliability 75%

M/Mmax 0.017 1.000 0.736 0.014 0.411 0.8 0.009 0.074 0.7

表４　麦拓莱霉素抗菌活性检测正交实验结果　

Table 4 Orthogonal results of antibacterial activity test of maituolaimycin

No. 1 2 3 4 5 6 7 8

T, temperature (󰀀) pH T×pH P, deproteination T×P pH×P Error

25 6 1 No 1 1 1 25 6 1 Yes 2 2 2 25 9 2 No 1 2 2 25 9 2 Yes 2 1 1 75 6 2 No 2 1 2 75 6 2 Yes 1 2 1 75 9 1 No 2 2 1 75 9 1 Yes 1 1 2

F0.25=5.83, Reliability 75%; F0.10=39.90, Reliability 90%; F0.05=161.40, Reliability 95% F >F0.10 >F0.10 F0.25 >F0.25 d (mm)

24.5 27.0 28.0 29.0 13.5 21.5 26.5 25.5

k 0.180 0.353 0.469 0.631 0.020 0.088 0.307 0.234

M/Mmax 0.286 0.558 0.743 1.000 0.032 0.140 0.486 0.371

各因素对麦拓莱霉素活性影响的显著性分析结果为：pH值>温度>温度与除蛋白因素的交互作用>除蛋白(酶). 温度与除蛋白因素的交互作用表明，在较高温度下除蛋白对麦拓莱霉素的稳定性影响不大，在较低温度下除蛋白对麦拓莱素稳定性有影响. 这进一步证明发酵液中有少量可降解麦拓莱霉素的酶存在[6]，在温度较高时这种酶的活性受到抑制.

３．２　ＨＰＬＣ分析检测结果　

通过高效液相色谱分析不同处理样品中的麦拓莱霉素含量，结果见图1. 比较1#与4#的HPLC图可以看出，麦拓莱霉素组分的峰随温度升高而减小，说明在较高温度下麦拓莱霉素活性组分浓度在迅速降低. 比较5#与8#的HPLC图可以看出，麦拓莱霉素组分的峰随pH值升高而增高，说明酸性环境中麦拓莱霉素不稳定，而

第2期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　刘玉强等：新型抗生素麦拓莱霉素分离纯化过程的优化　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　207　

0.160.140.120.10AU0.080.060.040.020.00

0

5

10Time (min)

15

20

0.080.060.040.020.00

0

5

10Time (min)

15

(a) 1

#

0.12

(b) 4

#

0.10

20

0.16

0.080.060.040.020.00

0

5

10Time (min)

15

20

(c) 5

#

0.140.120.100.080.060.040.020.00

0

(d) 8

#

510Time (min)

1520

图1 高效液相色谱分析麦拓莱霉素含量

Fig.1 HPLC analysis results of orthogonal design (maituolaimycin peak 12 min)

较高的pH值对麦拓莱霉素组分没有影响，因而麦拓莱霉素是稳定的.

３．３　ＴＬＣ分析检测结果　

TLC分析显示，随温度的升高B点由浓且清晰变淡，C, D点由淡变浓，对照抗生素活性检测结果，C, D点是失活后的麦拓莱霉素[7]；TLC图还显示随pH值的升高B点变得更加浓且清晰，C, D点变化不明显，对照抗生素活性检测结果，说明pH值降低会使麦拓莱霉素活性降低，但对因温度升高、麦拓莱霉素失活而产生的C, D点不产生影响，这证明因pH值降低而失活的机理可能与因温度升高而失活的机理是不同的；TLC图还显示经过除蛋白质后，B点变得更加浓且清晰，说明因经过除蛋白质处理，使麦拓莱霉素活性更加稳定些，尤其是在温度较低时这一趋势更加明显. C, D点在较低温度下变化不明显.

在较高温度下因升高温度失活而产生的C, D点经过除蛋白质后变得更浓. 证明经过除蛋白质后因高温失活的过程更多地经过能产生C, D的机理.

A

B

３．４　分离纯化过程优化结果　

麦拓莱霉素发酵液原有的分离纯化工艺是一种得率较低的工艺过程. 发酵经离心固液粗分、浓缩(50℃)、乙酸乙酯萃取、水反萃、浓缩(30℃)、硅胶柱层析，再经高效液相制备色谱精制，最后浓缩(30℃).

综合对分离纯化过程中麦拓莱霉素稳定性的研究，调整和优化了麦拓莱霉素的原有分离纯化工艺，离心粗分的发酵液用NaOH调节pH为8，不浓缩，直接用2.5倍的乙酸乙酯萃取发酵液10次；不用水反萃，直接用旋转蒸发器于30󰀀及10 Pa将乙酸乙酯浓缩.

麦拓莱霉素分离纯化过程经优化后，活性组分得率明显提高，优化后的活性组分总量提高4.26倍.

４　　结论与讨论　

新型抗生素麦拓莱霉素对温度较为敏感，但失活机理不同. 在60℃以上，随着温度的升高麦拓莱霉素活性衰变的速率加快，失活，会产生能被TLC检测出的组分C和D. 发酵液的pH值越低麦拓莱霉素的活性衰变速度越快，在碱性环境中其活性较为稳定，而在较低pH值环境中麦拓莱霉素失活所产生的组分未被相同条件下的TLC分析检测出来.

对麦拓莱霉素产生影响的温度与除蛋白因素有一定的交互作用，导致麦拓莱霉素在低温下分离纯化，活性衰变速度加快，随着温度升高酶活性降低以至消失. 当操作温度为30℃时，可以不必用乙醇除蛋白工艺.

选取分离提纯麦拓莱霉素的温度为30℃，pH 9，经过萃取、蒸干、浸取后的粗品收率提高4倍，纯度较高，可直接使用高效液相制备色谱精制纯化，该条件可为分子结构中含有不饱和内酯环药效团的化合物的分离纯化提供参考.

参考文献：

[1] 元英进，王志平，范晋勇，等. 一种大环内酯类抗生素及其制备

方法 [P]. 中国专利：03130571.7, 2003−08−15.

C D

1# 2# 3# 4# 5# 6# 7# 8#

图5 TCL检测结果

Fig.5 TLC spectra of orthogonal experiments

(A, C, D: decomposed compositions of maituolaimycin;

B: maituolaimycin 1#~8#: orthogonal experiment number)

208 过 程 工 程 学 报 第5卷

[2] Milos Blazsek, Anna Surovcova. LC Determination of Salinomycin in

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Optimization of Separation and Purification Process of Novel Antibiotic Maituolaimycin

LIU Yu-qiang, WANG Zhi-ping, GE Zhi-qiang, YUAN Ying-jin (Dept. Pharm. Eng., Sch. Chem. Eng., Tianjin Univ., Tianjin 300072, China)

Abstract: With the analysis technologies of HPLC, TLC and test of antibacterial bio-activity, the stability of maituolaimycin, a novel macrolide antibiotic, during the process of separation and purification from the fermentation broth was studied in orthogonal test. The research included pH, temperature and protein-removing, the main factors that affected the stability of maituolaimycin, as well as their interaction, and the authors put out a reasonable technological process forward the separation and purification of maituolaimycin. Also the optimized separation and purification process after fermentation offers an analogy for other antibiotics. Key words: HPLC; maituolaimycin; separation; stability; TLC