微生物综合实验设计方案（1）4

第八小组 第八小组 （曹婉仪 （曹婉仪 蔡楚萍 蔡楚萍 贝 贝 张韵红） 张韵红）

一、取样

取三个经高压蒸汽灭菌的锥形瓶，于华师校园内湖中取水样。取三个经高压蒸汽灭菌的锥形瓶，于华师校园内湖中取水样。为使取样具有

代表性和全面性，分别选取三个取样点，取样点1：湖的东面，取样点2：中间湖边，取样点3：湖的西面，分别编号1.2.3，于水面以下1.2.3，于水面以下10cm，取水各10cm，取水各100mL，100mL，盖好瓶塞。 盖好瓶塞。

器具：三角瓶*3器具：三角瓶*3个

二、测水体pH值

为了大致地确定水体微生物的生长适宜pH（个人感觉这说法有点奇怪，好pH（个人感觉这说法有点奇怪，好像暗示测出来的pH就是适宜生长的pH似的，至少改为：为了了解华师湖水的pH吧，或者改为其他更好的说法），取好水样后，分别用pH计测量三个水样的值，每个水样各测量三次，取平均值。 值，每个水样各测量三次，取平均值。

将三个水样混合均匀，得到混合水样，用pH计测量pH三次，取平均值。 三次，取平均值。 器具：pH器具：pH计 三、分离提纯2

种微生物

1、材料：混合水样 混合水样 2、方法

操作名称 操作名称 配置牛肉膏蛋白胨

具体步骤 具体步骤

1、配置牛肉膏蛋白胨固体培养基

试剂和材料 试剂和材料 NaCl 2g 蛋白胨4g

牛肉膏1.2g 400mL水 1mol/LNaOH

器具（经高压器具（经高压蒸汽灭菌） 蒸汽灭菌） 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌锅 天平 天平 玻璃棒 玻璃棒

500ml大烧杯*1个

250ml三角瓶*2个 封口膜*2封口膜*2张 绳子*2绳子*2条 培养皿16套 试管*4试管*4个 胶塞/棉塞*4个 报纸多张 报纸多张

稀释涂布分离微生

物

1、取0.2ml混合水样进行稀释，设混合水样进行稀释，设混合水样 混合水样 置四个梯度：原液、×10置四个梯度：原液、×10、×10、×100、×100、100、蒸馏水 蒸馏水

恒温培养箱 恒温培养箱

1ml移液管*5

固体培养基400mL 400mL，分装于两个三角瓶400mL，分装于两个三角瓶 ，分装于两个三角瓶

2、高压蒸汽灭菌 、高压蒸汽灭菌 （灭菌材料：250ml三角瓶*5培养三角瓶*5，*5，皿*16，试管*16，试管*11，试管*11，*11，1ml移液管

*5,10mll1mol/L HCI *5,10mll量筒*1） 3、倒16个平板 4个平板 4支试管斜面（按支试管斜面（按 原来写的也要13个平板，怎么会是(pH7~7.6) 10个，而且还没有设置对照的平板；如果要作×10000，还要更多平板。我觉得做15~20个平板比较好。

×1000，分别装于1000，分别装于4个试管中，标明稀释度，每种稀释度5ml2、涂布5ml2、涂布8个平板 个平板

3、37℃恒温培养箱中倒置培养37℃恒温培养箱中倒置培养24h

空白平板*8空白平板*8个 个

10ml量筒 量筒

试管*4试管*4个酒精灯

酒精棉球 酒精棉球 涂布器 涂布器 标签纸 标签纸

平板划线分离微生物

1、选取稀释涂布平板操作中分离程度较好的两种微生物的平板菌落，

涂布分离的平恒温培养箱 恒温培养箱 板

酒精灯 酒精灯

进行平板划线，各划线2个平板 空白平板*4个平板 空白平板*4个 酒精棉球 酒精棉球

2、37℃恒温培养箱中倒置培养℃恒温培养箱中倒置培养24h 接种环 37接种环

标签纸 标签纸

平板划线分离微生

物

1、两种微生物均选取划线操作效果好的菌落，进行第二次平板划线操作，各划线2个平板 个平板

第一次划线分恒温培养箱 恒温培养箱

离的不同菌种酒精灯 酒精灯 的平板*2酒精棉球 的平板*2个 酒精棉球

2、 37℃恒温培养箱中倒置培养空白平板*4空白平板*4个 接种环 接种环

平板菌种接种到试管保藏 管保藏

24h 标签纸 标签纸

1、用接种环把菌种接种到试管斜第二次划线分恒温培养箱 恒温培养箱 面，每个菌种接种2个斜面 个斜面 2、37℃恒温培养箱中培养37℃恒温培养箱中培养24h

离的不同菌种冰箱 冰箱

的平板*2酒精灯 的平板*2个 酒精灯

3、待菌种在固体斜面培养基上生长空白斜面培养酒精棉球 酒精棉球 丰满后，注明菌类或菌种名、保藏基*4个 接种环 接种环 日期、保藏人，然后置于4~8℃的冰标签纸 4~8℃的冰标签纸 箱中保存 箱中保存

四、革兰氏染色

细菌的革兰氏染色 细菌的革兰氏染色

1.实验材料1.实验材料 实验材料

1.1材料 材料

第二次划线分离的不同菌种的平板 第二次划线分离的不同菌种的平板*2第二次划线分离的不同菌种的平板*2个 1.2试剂： 试剂：

无菌水、结晶紫、碘液、 无菌水、结晶紫、碘液、95%无菌水、结晶紫、碘液、95%乙醇、番红95%乙醇、番红 乙醇、番红 1.3器具 器具

载玻片、接种环、酒精灯 载玻片、接种环、酒精灯 载玻片、接种环、酒精灯 2.实验方法2.实验方法 实验方法 步骤序号 步骤序号 操作名称 操作名称 1 制片

操作方法

①涂片：滴1滴无菌水于载玻片，挑取少许菌体与水滴均匀混合 少许菌体与水滴均匀混合 ②干燥：火焰上方略加温 ②干燥：火焰上方略加温

③固定：用加热法，通过火焰3次

2 染色

结晶紫初染1min，水洗；碘液媒染1min，1min，1min，水洗；95%水洗；95%乙醇脱色95%乙醇脱色20~30s，水洗；番20~30s，水洗；番红复染1min，水洗1min，水洗 显微镜油镜观察

3

镜检

五、观察细菌的形态特征

在高倍镜和油镜下观察细菌形态，拍下照片，画图，描述形态特征

器具：显微镜 器具：显微镜

六、生理生化试验（淀粉水解、糖酵解）

（1）淀粉水解实验

操作名称 操作名称

接种 接种 培养 培养

实验方法 实验方法

以无菌操作技术，把两个菌种接种到同一个平板上，划成“+”字

形，平板的一边接一个种

在平皿底部做好记号，盖上盖，37在平皿底部做好记号，盖上盖，37℃恒温培养箱中倒置培养37℃恒温培养箱中倒置培养24h

检验 检验

平皿盖打开，滴加卢卡氏碘液于接种处 平皿盖打开，滴加卢卡氏碘液于接种处

有水解圈：淀粉水解实验阳性，用+有水解圈：淀粉水解实验阳性，用+表示；无水解圈：淀粉水

解实验阴性，用-解实验阴性，用-表示 表示

记录结果 记录结果

(2)糖酵解实验(2)糖酵解实验 糖酵解实验 1 实验材料1 实验材料 实验材料 1.1实验材料 实验材料

第二次划线分离的不同菌种的平板 第二次划线分离的不同菌种的平板*2第二次划线分离的不同菌种的平板*2个、空白平白*1个、空白平白*1个、试管*5个、试管*5个 1.2实验试剂 实验试剂

卢卡氏碘液, 卢卡氏碘液, 葡萄糖发酵培养基试剂, 葡萄糖发酵培养基试剂[葡萄糖发酵培养基试剂[蛋白胨0.1g,NaCl 0.25g, K2HPO4 0.01g,水（1%水溶液） 0.15ml，葡萄糖 0.5g] 0.01g,水 50ml,溴麝香草酚蓝 50ml,溴麝香草酚蓝1%水溶液） 0.15ml，葡萄糖 0.5g] 1.3实验器具 实验器具

恒温培养箱、酒精灯、酒精棉球、接种环、标签纸 恒温培养箱、酒精灯、酒精棉球、接种环、标签纸 恒温培养箱、酒精灯、酒精棉球、接种环、标签纸 2 实验方法2 实验方法 实验方法

操作名称 操作名称 配置糖发酵培养基 配置糖发酵培养基 接种 接种 操作方法 操作方法 配置葡萄糖发酵培养基50ml,分装50ml,分装5支试管中，高压蒸汽灭菌 支试管中，高压蒸汽灭菌 取葡萄糖发酵培养基试管3支，分支，分别接入两种菌种，用标签纸标明菌类或别接入两种菌种，用标签纸标明菌类或菌名、发酵培养基名称，第3支不接种，作为对照。接种后，轻摇试管，使混合均匀 均匀 37℃恒温培养箱中静止培养37℃恒温培养箱中静止培养24h 记录结果：黄色、有气泡：产酸产 气，用0表示 表示 黄色、无气泡：产酸不 黄色、无气泡：产酸不产气，用+产气，用+表示 表示 紫色、无气泡：不产酸 紫色、无气泡：不产酸不产气，用-不产气，用-表示 表示 培养 培养 观察 观察 配置糖发酵培养基：分别称取蛋白胨和NaCl溶于热水中，调pH至7.4，再7.4，再加入溴麝香草酚蓝（先用少量95%乙醇溶解后，再加水配成，加入糖95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液）1%水溶液）类，分装试管，装量4~5cm高，并倒放入一德汉氏小管（管口向下，管内充满培养液）。115℃湿热灭菌115℃湿热灭菌20min。灭菌时注意适当延长煮沸时间，尽量把冷空气排20min。灭菌时注意适当延长煮沸时间，尽量把冷空气排尽，以使德汉氏小管内不存在气泡。常用的糖类：如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖等（后两种糖的用量常加大为1.5%）1.5%） 七、配置菌悬液 八、探究pH对细菌生长的影响 1）第一次测量分光光度值 ）第一次测量分光光度值 (1)材料：上述菌悬液(1)材料：上述菌悬液 材料：上述菌悬液 (2)试剂(2)试剂:1mol/L 试剂:1mol/L NaOH 或NaOH 或1mol/L HCL调至pH分别为3、4、5、6、7、8、9牛肉膏蛋白胨液体培养基，自来水（需要热水溶解牛肉膏）。 (3)250ml三角瓶7个，试管7支，配置牛肉膏蛋白胨液体培养基7个，pH个，pH计，大烧杯（是否需要校准），恒温摇床。 ，恒温摇床。 (4)步骤(4)步骤: 步骤: 操作 操作 配置牛肉膏蛋白胨液体培养基 配置牛肉膏蛋白胨液体培养基 试剂或用具 试剂或用具 NaCl 8g 蛋白胨NaCl 8g 蛋白胨16g 牛肉膏16g 牛肉膏4.8g 无菌生理盐水1600ml 7个250ml三角瓶 试管7支 ，每个三角瓶中倒入200ml液体培养基，其余分装试管（约25ml/支）25ml/支） 支） 1mol/l NaCl或 HCI溶液 pH溶液 pH计 调pH值 包扎培养基并且灭菌 高压灭菌锅121摄氏度20min 包扎培养基并且灭菌 接种（无菌操作）：移液管移取0.5ml移液管 移液管 吸气球 吸气球 牛肉膏蛋白胨液体培菌悬液于不同pH的三角瓶中 的三角瓶中 置于37度恒温箱中培养24h 测分光光度值 测分光光度值

记录数据并且描绘关系图 记录数据并且描绘关系图

2）第二次测量分光光度值 ）第二次测量分光光度值 (1)材料：重新配置的菌悬液(1)材料：重新配置的菌悬液 材料：重新配置的菌悬液

养基 养基

恒温摇床 恒温摇床

分光光度计OD600

(2)试剂(2)试剂:1mol/L NaOH 试剂:1mol/L NaOH 或:1mol/L NaOH 或1mol/L HCL调至pH分别为6、6.4、6.4、6.8、6.8、7.2、7.2、7.6、7.6、8(假设8(假设1)中最适1)中最适pH为7)牛肉膏蛋白胨液体培养基，7)牛肉膏蛋白胨液体培养基，自来水（需要热水溶解牛肉膏）。

(3)250ml三角瓶5个，试管5支，配置牛肉膏蛋白胨液体培养基5个，pH个，pH计，大烧杯（是否需要校准），恒温摇床。 ，恒温摇床。 (4)步骤(4)步骤: 步骤: 操作 试剂或用具 操作 试剂或用具 配置牛肉膏蛋白胨液体培养基 配置牛肉膏蛋白胨液体培养基

NaCl 5.5g NaCl 5.5g 蛋白胨5.5g 蛋白胨11g 牛肉膏11g 牛肉膏3.3g 无3.3g 无

菌生理盐水1100ml 5个250ml三角瓶 三角瓶 试管5支 ，每个三角瓶中倒入200ml液体培养基，其余分装试管（约20ml/支） 支）

1mol/l NaCl或 HCI溶液 pH溶液 pH计 高压灭菌锅121摄氏度20min

调pH值

包扎培养基并且灭菌 包扎培养基并且灭菌

接种（无菌操作）：移液管移取0.5ml移液管 移液管 吸气球 吸气球 牛肉膏蛋白胨液体培菌悬液于不同pH的三角瓶中 养基 的三角瓶中 养基 置于37度恒温箱中培养24h 恒温摇床 恒温摇床 测分光光度值 分光光度计OD600 测分光光度值

记录数据并且描绘关系图 记录数据并且描绘关系图

附： 附：

（1） 牛肉膏蛋白胨液体培养基的：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，3g，10g，5g，1000ml，

pH7~7.6

（2） 淀粉培养基：蛋白胨10g，10g，NaCl 5gNaCl 5g，牛肉膏5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水2g，蒸馏水

1000ml，琼脂1000ml，琼脂15~20g，15~20g，121摄氏度灭菌20min。20min。

（3） 糖发酵培养基：蛋白胨0.2g，0.2g，NaCl 0. 5g，NaCl 0. 5g，K2HPO4 0.02g水100ml，溴麝100ml，溴麝

香草酚蓝（1%香草酚蓝（1%水溶液）1%水溶液）0.3ml水溶液）0.3ml，糖类0.3ml，糖类1g。分别称取蛋白胨和氯化钠溶于热1g。分别称取蛋白胨和氯化钠溶于热水中，调水中，调pH至7.4，7.4，再加入溴麝香草酚蓝（先用少量再加入溴麝香草酚蓝（先用少量95%乙醇溶解后，95%乙醇溶解后，再乙醇溶解后，再

加水配成1%水溶液），加入糖类，分装试管，装量4~5cm高，并倒放入一1%水溶液）

德汉氏小管（关口向下，管内充满培养液）。115摄氏度湿热灭菌20min。 20min。