第八小组 第八小组 (曹婉仪 (曹婉仪 蔡楚萍 蔡楚萍 贝 贝 张韵红) 张韵红)
一、取样
取三个经高压蒸汽灭菌的锥形瓶,于华师校园内湖中取水样。取三个经高压蒸汽灭菌的锥形瓶,于华师校园内湖中取水样。为使取样具有
代表性和全面性,分别选取三个取样点,取样点1:湖的东面,取样点2:中间湖边,取样点3:湖的西面,分别编号1.2.3,于水面以下1.2.3,于水面以下10cm,取水各10cm,取水各100mL,100mL,盖好瓶塞。 盖好瓶塞。
器具:三角瓶*3器具:三角瓶*3个
二、测水体pH值
为了大致地确定水体微生物的生长适宜pH(个人感觉这说法有点奇怪,好pH(个人感觉这说法有点奇怪,好像暗示测出来的pH就是适宜生长的pH似的,至少改为:为了了解华师湖水的pH吧,或者改为其他更好的说法),取好水样后,分别用pH计测量三个水样的值,每个水样各测量三次,取平均值。 值,每个水样各测量三次,取平均值。
将三个水样混合均匀,得到混合水样,用pH计测量pH三次,取平均值。 三次,取平均值。 器具:pH器具:pH计 三、分离提纯2
种微生物
1、材料:混合水样 混合水样 2、方法
操作名称 操作名称 配置牛肉膏蛋白胨
具体步骤 具体步骤
1、配置牛肉膏蛋白胨固体培养基
试剂和材料 试剂和材料 NaCl 2g 蛋白胨4g
牛肉膏1.2g 400mL水 1mol/LNaOH
器具(经高压器具(经高压蒸汽灭菌) 蒸汽灭菌) 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌锅 天平 天平 玻璃棒 玻璃棒
500ml大烧杯*1个
250ml三角瓶*2个 封口膜*2封口膜*2张 绳子*2绳子*2条 培养皿16套 试管*4试管*4个 胶塞/棉塞*4个 报纸多张 报纸多张
稀释涂布分离微生
物
1、取0.2ml混合水样进行稀释,设混合水样进行稀释,设混合水样 混合水样 置四个梯度:原液、×10置四个梯度:原液、×10、×10、×100、×100、100、蒸馏水 蒸馏水
恒温培养箱 恒温培养箱
1ml移液管*5
固体培养基400mL 400mL,分装于两个三角瓶400mL,分装于两个三角瓶 ,分装于两个三角瓶
2、高压蒸汽灭菌 、高压蒸汽灭菌 (灭菌材料:250ml三角瓶*5培养三角瓶*5,*5,皿*16,试管*16,试管*11,试管*11,*11,1ml移液管
*5,10mll1mol/L HCI *5,10mll量筒*1) 3、倒16个平板 4个平板 4支试管斜面(按支试管斜面(按 原来写的也要13个平板,怎么会是(pH7~7.6) 10个,而且还没有设置对照的平板;如果要作×10000,还要更多平板。我觉得做15~20个平板比较好。
×1000,分别装于1000,分别装于4个试管中,标明稀释度,每种稀释度5ml2、涂布5ml2、涂布8个平板 个平板
3、37℃恒温培养箱中倒置培养37℃恒温培养箱中倒置培养24h
空白平板*8空白平板*8个 个
10ml量筒 量筒
试管*4试管*4个酒精灯
酒精棉球 酒精棉球 涂布器 涂布器 标签纸 标签纸
平板划线分离微生物
1、选取稀释涂布平板操作中分离程度较好的两种微生物的平板菌落,
涂布分离的平恒温培养箱 恒温培养箱 板
酒精灯 酒精灯
进行平板划线,各划线2个平板 空白平板*4个平板 空白平板*4个 酒精棉球 酒精棉球
2、37℃恒温培养箱中倒置培养℃恒温培养箱中倒置培养24h 接种环 37接种环
标签纸 标签纸
平板划线分离微生
物
1、两种微生物均选取划线操作效果好的菌落,进行第二次平板划线操作,各划线2个平板 个平板
第一次划线分恒温培养箱 恒温培养箱
离的不同菌种酒精灯 酒精灯 的平板*2酒精棉球 的平板*2个 酒精棉球
2、 37℃恒温培养箱中倒置培养空白平板*4空白平板*4个 接种环 接种环
平板菌种接种到试管保藏 管保藏
24h 标签纸 标签纸
1、用接种环把菌种接种到试管斜第二次划线分恒温培养箱 恒温培养箱 面,每个菌种接种2个斜面 个斜面 2、37℃恒温培养箱中培养37℃恒温培养箱中培养24h
离的不同菌种冰箱 冰箱
的平板*2酒精灯 的平板*2个 酒精灯
3、待菌种在固体斜面培养基上生长空白斜面培养酒精棉球 酒精棉球 丰满后,注明菌类或菌种名、保藏基*4个 接种环 接种环 日期、保藏人,然后置于4~8℃的冰标签纸 4~8℃的冰标签纸 箱中保存 箱中保存
四、革兰氏染色
细菌的革兰氏染色 细菌的革兰氏染色
1.实验材料1.实验材料 实验材料
1.1材料 材料
第二次划线分离的不同菌种的平板 第二次划线分离的不同菌种的平板*2第二次划线分离的不同菌种的平板*2个 1.2试剂: 试剂:
无菌水、结晶紫、碘液、 无菌水、结晶紫、碘液、95%无菌水、结晶紫、碘液、95%乙醇、番红95%乙醇、番红 乙醇、番红 1.3器具 器具
载玻片、接种环、酒精灯 载玻片、接种环、酒精灯 载玻片、接种环、酒精灯 2.实验方法2.实验方法 实验方法 步骤序号 步骤序号 操作名称 操作名称 1 制片
操作方法
①涂片:滴1滴无菌水于载玻片,挑取少许菌体与水滴均匀混合 少许菌体与水滴均匀混合 ②干燥:火焰上方略加温 ②干燥:火焰上方略加温
③固定:用加热法,通过火焰3次
2 染色
结晶紫初染1min,水洗;碘液媒染1min,1min,1min,水洗;95%水洗;95%乙醇脱色95%乙醇脱色20~30s,水洗;番20~30s,水洗;番红复染1min,水洗1min,水洗 显微镜油镜观察
3
镜检
五、观察细菌的形态特征
在高倍镜和油镜下观察细菌形态,拍下照片,画图,描述形态特征
器具:显微镜 器具:显微镜
六、生理生化试验(淀粉水解、糖酵解)
(1)淀粉水解实验
操作名称 操作名称
接种 接种 培养 培养
实验方法 实验方法
以无菌操作技术,把两个菌种接种到同一个平板上,划成“+”字
形,平板的一边接一个种
在平皿底部做好记号,盖上盖,37在平皿底部做好记号,盖上盖,37℃恒温培养箱中倒置培养37℃恒温培养箱中倒置培养24h
检验 检验
平皿盖打开,滴加卢卡氏碘液于接种处 平皿盖打开,滴加卢卡氏碘液于接种处
有水解圈:淀粉水解实验阳性,用+有水解圈:淀粉水解实验阳性,用+表示;无水解圈:淀粉水
解实验阴性,用-解实验阴性,用-表示 表示
记录结果 记录结果
(2)糖酵解实验(2)糖酵解实验 糖酵解实验 1 实验材料1 实验材料 实验材料 1.1实验材料 实验材料
第二次划线分离的不同菌种的平板 第二次划线分离的不同菌种的平板*2第二次划线分离的不同菌种的平板*2个、空白平白*1个、空白平白*1个、试管*5个、试管*5个 1.2实验试剂 实验试剂
卢卡氏碘液, 卢卡氏碘液, 葡萄糖发酵培养基试剂, 葡萄糖发酵培养基试剂[葡萄糖发酵培养基试剂[蛋白胨0.1g,NaCl 0.25g, K2HPO4 0.01g,水(1%水溶液) 0.15ml,葡萄糖 0.5g] 0.01g,水 50ml,溴麝香草酚蓝 50ml,溴麝香草酚蓝1%水溶液) 0.15ml,葡萄糖 0.5g] 1.3实验器具 实验器具
恒温培养箱、酒精灯、酒精棉球、接种环、标签纸 恒温培养箱、酒精灯、酒精棉球、接种环、标签纸 恒温培养箱、酒精灯、酒精棉球、接种环、标签纸 2 实验方法2 实验方法 实验方法
操作名称 操作名称 配置糖发酵培养基 配置糖发酵培养基 接种 接种 操作方法 操作方法 配置葡萄糖发酵培养基50ml,分装50ml,分装5支试管中,高压蒸汽灭菌 支试管中,高压蒸汽灭菌 取葡萄糖发酵培养基试管3支,分支,分别接入两种菌种,用标签纸标明菌类或别接入两种菌种,用标签纸标明菌类或菌名、发酵培养基名称,第3支不接种,作为对照。接种后,轻摇试管,使混合均匀 均匀 37℃恒温培养箱中静止培养37℃恒温培养箱中静止培养24h 记录结果:黄色、有气泡:产酸产 气,用0表示 表示 黄色、无气泡:产酸不 黄色、无气泡:产酸不产气,用+产气,用+表示 表示 紫色、无气泡:不产酸 紫色、无气泡:不产酸不产气,用-不产气,用-表示 表示 培养 培养 观察 观察 配置糖发酵培养基:分别称取蛋白胨和NaCl溶于热水中,调pH至7.4,再7.4,再加入溴麝香草酚蓝(先用少量95%乙醇溶解后,再加水配成,加入糖95%乙醇溶解后,再加水配成1%水溶液)1%水溶液)类,分装试管,装量4~5cm高,并倒放入一德汉氏小管(管口向下,管内充满培养液)。115℃湿热灭菌115℃湿热灭菌20min。灭菌时注意适当延长煮沸时间,尽量把冷空气排20min。灭菌时注意适当延长煮沸时间,尽量把冷空气排尽,以使德汉氏小管内不存在气泡。常用的糖类:如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖等(后两种糖的用量常加大为1.5%)1.5%) 七、配置菌悬液 八、探究pH对细菌生长的影响 1)第一次测量分光光度值 )第一次测量分光光度值 (1)材料:上述菌悬液(1)材料:上述菌悬液 材料:上述菌悬液 (2)试剂(2)试剂:1mol/L 试剂:1mol/L NaOH 或NaOH 或1mol/L HCL调至pH分别为3、4、5、6、7、8、9牛肉膏蛋白胨液体培养基,自来水(需要热水溶解牛肉膏)。 (3)250ml三角瓶7个,试管7支,配置牛肉膏蛋白胨液体培养基7个,pH个,pH计,大烧杯(是否需要校准),恒温摇床。 ,恒温摇床。 (4)步骤(4)步骤: 步骤: 操作 操作 配置牛肉膏蛋白胨液体培养基 配置牛肉膏蛋白胨液体培养基 试剂或用具 试剂或用具 NaCl 8g 蛋白胨NaCl 8g 蛋白胨16g 牛肉膏16g 牛肉膏4.8g 无菌生理盐水1600ml 7个250ml三角瓶 试管7支 ,每个三角瓶中倒入200ml液体培养基,其余分装试管(约25ml/支)25ml/支) 支) 1mol/l NaCl或 HCI溶液 pH溶液 pH计 调pH值 包扎培养基并且灭菌 高压灭菌锅121摄氏度20min 包扎培养基并且灭菌 接种(无菌操作):移液管移取0.5ml移液管 移液管 吸气球 吸气球 牛肉膏蛋白胨液体培菌悬液于不同pH的三角瓶中 的三角瓶中 置于37度恒温箱中培养24h 测分光光度值 测分光光度值
记录数据并且描绘关系图 记录数据并且描绘关系图
2)第二次测量分光光度值 )第二次测量分光光度值 (1)材料:重新配置的菌悬液(1)材料:重新配置的菌悬液 材料:重新配置的菌悬液
养基 养基
恒温摇床 恒温摇床
分光光度计OD600
(2)试剂(2)试剂:1mol/L NaOH 试剂:1mol/L NaOH 或:1mol/L NaOH 或1mol/L HCL调至pH分别为6、6.4、6.4、6.8、6.8、7.2、7.2、7.6、7.6、8(假设8(假设1)中最适1)中最适pH为7)牛肉膏蛋白胨液体培养基,7)牛肉膏蛋白胨液体培养基,自来水(需要热水溶解牛肉膏)。
(3)250ml三角瓶5个,试管5支,配置牛肉膏蛋白胨液体培养基5个,pH个,pH计,大烧杯(是否需要校准),恒温摇床。 ,恒温摇床。 (4)步骤(4)步骤: 步骤: 操作 试剂或用具 操作 试剂或用具 配置牛肉膏蛋白胨液体培养基 配置牛肉膏蛋白胨液体培养基
NaCl 5.5g NaCl 5.5g 蛋白胨5.5g 蛋白胨11g 牛肉膏11g 牛肉膏3.3g 无3.3g 无
菌生理盐水1100ml 5个250ml三角瓶 三角瓶 试管5支 ,每个三角瓶中倒入200ml液体培养基,其余分装试管(约20ml/支) 支)
1mol/l NaCl或 HCI溶液 pH溶液 pH计 高压灭菌锅121摄氏度20min
调pH值
包扎培养基并且灭菌 包扎培养基并且灭菌
接种(无菌操作):移液管移取0.5ml移液管 移液管 吸气球 吸气球 牛肉膏蛋白胨液体培菌悬液于不同pH的三角瓶中 养基 的三角瓶中 养基 置于37度恒温箱中培养24h 恒温摇床 恒温摇床 测分光光度值 分光光度计OD600 测分光光度值
记录数据并且描绘关系图 记录数据并且描绘关系图
附: 附:
(1) 牛肉膏蛋白胨液体培养基的:牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,水1000ml,3g,10g,5g,1000ml,
pH7~7.6
(2) 淀粉培养基:蛋白胨10g,10g,NaCl 5gNaCl 5g,牛肉膏5g,牛肉膏5g,可溶性淀粉5g,可溶性淀粉2g,蒸馏水2g,蒸馏水
1000ml,琼脂1000ml,琼脂15~20g,15~20g,121摄氏度灭菌20min。20min。
(3) 糖发酵培养基:蛋白胨0.2g,0.2g,NaCl 0. 5g,NaCl 0. 5g,K2HPO4 0.02g水100ml,溴麝100ml,溴麝
香草酚蓝(1%香草酚蓝(1%水溶液)1%水溶液)0.3ml水溶液)0.3ml,糖类0.3ml,糖类1g。分别称取蛋白胨和氯化钠溶于热1g。分别称取蛋白胨和氯化钠溶于热水中,调水中,调pH至7.4,7.4,再加入溴麝香草酚蓝(先用少量再加入溴麝香草酚蓝(先用少量95%乙醇溶解后,95%乙醇溶解后,再乙醇溶解后,再
加水配成1%水溶液),加入糖类,分装试管,装量4~5cm高,并倒放入一1%水溶液)
德汉氏小管(关口向下,管内充满培养液)。115摄氏度湿热灭菌20min。 20min。
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