一种甲基化DNA检测的新方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105256018 A (43)申请公布日 2016.01.20

(21)申请号 201510652725.3(22)申请日 2015.10.11

(71)申请人苏州承美生物科技有限公司

地址215000 江苏省苏州市吴江市吴江经济

开发区科技创业园(72)发明人孙喜元(51)Int.Cl.

C12Q 1/68(2006.01)

权利要求书1页 说明书4页 附图1页

()发明名称

一种甲基化DNA检测的新方法(57)摘要

本发明经优化PCR引物的设计，使每个PCR扩增区域至少包含10个C盘G位点，所累积的变性温度差异将超过5度。温度通过加热，使PCR产物部分解链变性，即加热到一个特定温度，只使非甲基化DNA的PCR产物发生变性。用对单链DNA特异的核酸外切酶消化这样处理的PCR产物，非甲基化DNA的PCR产物将被消化，而甲基化DNA的PCR产物维持不变，从而可以提高甲基化DNA的检测灵敏度。本发明的有益效果是：本发明在甲基化DNA特异性多重PCR扩增技术的基础上，通过对引物序列的选择，使甲基化DNA的检测灵敏度得到提高，通过使用毛细管电泳检测PCR产物，有效提高甲基化DNA检测的稳定性和重复性，多重PCR一次性检测多个甲基化基因，提高检测效率，提高检测的灵敏度和检测的稳定性。 C N 1 0 5 2 5 6 0 1 8 A CN 105256018 A

权 利 要 求 书

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1.一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于：

第一步：筛选出一组12个基因，根据目标检测区域甲基化DNA经重亚硫酸盐处理转化后是的序列，设计PCR引物，使每条引物序列中包含2-3个CpG位点，以提高引物对甲基化DNA的偏向性扩增；使这一组基因的每个PCR扩增产物的长度，呈梯度分布；使每个PCR扩增区域含有至少10个CpG位点；使每个PCR扩增产物的变性温度在82-84度；

第二步：从人粪便样品中提取的DNA，用重亚硫酸钠处理并纯化；第三步：配制甲基化DNA的PCR扩增体系，包括PCR缓冲液、四种dNTP混合物，Taq DNA聚合酶；

第四步：加入步骤1所设计的引物混合，加入经重亚硫酸钠处理并纯化的样品DNA，进行第一次PCR扩增；

第五步：步骤四的PCR产物加热至80度，使PCR产物获得部分变性；第六步：用单链DNA特异性外切酶对步骤5的PCR产物进行消化处理；第七步：以步骤六的经消化处理的PCR产物为模板，与步骤一设计的PCR引物混合物，在步骤三的PCR扩增体系中，进行第二次PCR反应；

第八步：将步骤七的反应产物，用全自动毛细管电泳分析系统进行检测，根据DNA片段出现的时间，判断甲基化DNA的存在。

2.根据权利要求1所述的一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于：所述的第一步中一组12个基因，具体如下：SNCA、SPG20、ADAMTS1、SFRP5、SLC5A8、IGFBP3、GALR2、SLC16A12、SPOCK2、TLX2、HLTF、HPP1。

3.根据权利要求1所述的一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于：所述第四步中PCR反应条件是：预变性95度10分；热循环95度30秒，62度30秒，72度60秒，42个循环。

4.根据权利要求1所述的一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于：所述的第六步中单链DNA特异性外切酶是绿豆核酸酶。

5.根据权利要求4所述的一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于：所述绿豆核酸酶的反应条件是：1x绿豆核酸酶反应缓冲液，0.05u/ul绿豆核酸酶，反应温度为37度，30分。

6.根据权利要求1所述的一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于：所述第七步中PCR反应条件是：预变性95度10分；热循环95度30秒，62度30秒，72度60秒，25个循环。

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说 明 书

一种甲基化DNA检测的新方法

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技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及医学和分子生物学技术，即一种甲基化DNA检测的新方法。

[0001]

背景技术

近年来的研究发现，细胞癌变与基因的异常甲基化改变有关，通过对样品中甲基

化基因的检测，可以提示相应样品中癌细胞的存在。

[0003] 甲基化DNA是在DNA链的C残基上修饰有一个甲基。人类异常的DNA甲基化多发生在基因的转录区，引起相应基因转录的关闭，使基因丧失功能。多种癌症的发生与DNA异常甲基化有关，通过对DNA甲基化的检测，可以提供体内是否存在癌细胞的信息。

目前，对甲基化基因的检测，通常是用重亚硫酸盐处理样品DNA，将DNA链上所有不发生甲基化的C碱基转变为U，而一般DNA聚合酶识别U为T。对经重亚硫酸钠处理过的DNA进行PCR扩增所得到的PCR产物，DNA链上所有未发生甲基化的C，均置换为T，使得非甲基化DNA的PCR产物的变性温度比甲基化DNA的PCR产物的变性温度显著降低，据测定，每个甲基化CpG位点与相应的非甲基化位点相比，经重亚硫酸钠处理之后，将导致其PCR产物的变性温度产生0.5度的差异。当对这些PCR产物加热时，非甲基化DNA的PCR产物将先于甲基化DNA的PCR产物而发生解链变性。

[0002]

发明内容

本发明旨在提供一种甲基化DNA检测的新方法，其目的在于提高检测样品中的甲

基化DNA的灵敏度和检测的稳定性提供一种新方法。[0005] 为了解决上述问题，本发提供的一种甲基化DNA检测的新方法采用了如下的技术方案：

本发明经优化PCR引物的设计，使每个PCR扩增区域至少包含10个C盘G位点，所累积的变性温度差异将超过5度。温度通过加热，使PCR产物部分解链变性，即加热到一个特定温度，只使非甲基化DNA的PCR产物发生变性。用对单链DNA特异的核酸外切酶消化这样处理的PCR产物，非甲基化DNA的PCR产物将被消化，而甲基化DNA的PCR产物维持不变，从而可以提高甲基化DNA的检测灵敏度。[0006] 一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于：

第一步：筛选出一组12个基因，根据目标检测区域甲基化DNA经重亚硫酸盐处理转化后是的序列，设计PCR引物，使每条引物序列中包含2-3个CpG位点，以提高引物对甲基化DNA的偏向性扩增；使这一组基因的每个PCR扩增产物的长度，呈梯度分布；使每个PCR扩增区域含有至少10个CpG位点；使每个PCR扩增产物的变性温度在82-84度；

第二步：从人粪便样品中提取的DNA，用重亚硫酸钠处理并纯化；第三步：配制甲基化DNA的PCR扩增体系，包括PCR缓冲液、四种dNTP混合物，Taq DNA聚合酶；

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说 明 书

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第四步：加入步骤1所设计的引物混合，加入经重亚硫酸钠处理并纯化的样品DNA，进行第一次PCR扩增；

第五步：步骤四的PCR产物加热至80度，使PCR产物获得部分变性；第六步：用单链DNA特异性外切酶对步骤5的PCR产物进行消化处理；第七步：以步骤六的经消化处理的PCR产物为模板，与步骤一设计的PCR引物混合物，在步骤三的PCR扩增体系中，进行第二次PCR反应；

第八步：将步骤七的反应产物，用全自动毛细管电泳分析系统进行检测，根据DNA片段出现的时间，判断甲基化DNA的存在。[0007] 优选的，所述的第一步中一组12个基因，具体如下：SNCA、SPG20、ADAMTS1、SFRP5、SLC5A8、IGFBP3、GALR2、SLC16A12、SPOCK2、TLX2、HLTF、HPP1。[0008] 优选的，所述第四步中PCR反应条件是：预变性95度10分；热循环95度30秒，62度30秒，72度60秒，42个循环。[0009] 优选的，所述的第六步中单链DNA特异性外切酶是绿豆核酸酶。[0010] 优选的，所述绿豆核酸酶的反应条件是：1x绿豆核酸酶反应缓冲液，0.05u/ul绿豆核酸酶，反应温度为37度，30分。[0011] 优选的，所述第七步中PCR反应条件是：预变性95度10分；热循环95度30秒，62度30秒，72度60秒，25个循环。[0012] 本发明的有益效果是：本发明在甲基化DNA特异性多重PCR扩增技术的基础上，通过对引物序列的选择，使设计的引物不仅保证PCR产物的长度呈梯度分布，各PCR产物的退火温度保持接近，实现多重PCR条件下的非甲基化DNA的PCR产物在特定温度下的部分变性，从而可以被单链DNA特异性外切核酸酶消化移除，使甲基化DNA的检测灵敏度得到提高，通过使用毛细管电泳检测PCR产物，有效提高甲基化DNA检测的稳定性和重复性，多重PCR一次性检测多个甲基化基因，提高检测效率，提高检测的灵敏度和检测的稳定性。附图说明

图1人通用甲基化DNA和非甲基化DNA标准品的PCR扩增产物在毛细管电泳检测系统的迁移时间图。

[0014] 图2大肠癌患者粪便中甲基化DNA检测实例。

[0013]

具体实施方式

[0015] 为了更清楚的理解本发明提供的技术方案,下面结合具体的实施例对技术方案做进一步的说明。实施例

近年来的研究发现，细胞癌变与基因的异常甲基化改变有关，通过对样品中甲基

化基因的检测，可以提示相应样品中癌细胞的存在。对甲基化基因的检测，通常是用重亚硫酸盐处理样品DNA，将DNA链上所有不发生甲基化的C碱基转变为U，而一般DNA聚合酶识别U为T。对经重亚硫酸钠处理过的DNA进行PCR扩增所得到的PCR产物，DNA链上所有未发生甲基化的C，均置换为T，使得非甲基化DNA的PCR产物的变性温度比甲基化DNA的PCR

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说 明 书

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产物的变性温度显著降低，据测定，每个甲基化CpG位点与相应的非甲基化位点相比，经重亚硫酸钠处理之后，将导致其PCR产物的变性温度产生0.5度的差异。当对这些PCR产物加热时，非甲基化DNA的PCR产物将先于甲基化DNA的PCR产物而发生解链变性。本发明经优化PCR引物的设计，使每个PCR扩增区域至少包含10个C盘G位点，所累积的变性温度差异将超过5度。温度通过加热，使PCR产物部分解链变性，即加热到一个特定温度，只使非甲基化DNA的PCR产物发生变性。用对单链DNA特异的核酸外切酶消化这样处理的PCR产物，非甲基化DNA的PCR产物将被消化，而甲基化DNA的PCR产物维持不变，从而可以提高甲基化DNA的检测灵敏度。

[0017] 本发明的实施例的技术方案是：

第一步：筛选出一组12个基因，根据目标检测区域甲基化DNA经重亚硫酸盐处理转化后是的序列，设计PCR引物，使每条引物序列中包含2-3个CpG位点，以提高引物对甲基化DNA的偏向性扩增；使这一组基因的每个PCR扩增产物的长度，呈梯度分布；使每个PCR扩增区域含有至少10个CpG位点；使每个PCR扩增产物的变性温度在82-84度；

第二步：从人粪便样品中提取的DNA，用重亚硫酸钠处理并纯化；第三步：配制甲基化DNA的PCR扩增体系，包括PCR缓冲液、四种dNTP混合物，Taq DNA聚合酶；

第四步：加入步骤1所设计的引物混合，加入经重亚硫酸钠处理并纯化的样品DNA，进行第一次PCR扩增；

第五步：步骤四的PCR产物加热至80度，使PCR产物获得部分变性；第六步：用单链DNA特异性外切酶对步骤5的PCR产物进行消化处理；第七步：以步骤六的经消化处理的PCR产物为模板，与步骤一设计的PCR引物混合物，在步骤三的PCR扩增体系中，进行第二次PCR反应；

第八步：将步骤七的反应产物，用全自动毛细管电泳分析系统进行检测，根据DNA片段出现的时间，判断甲基化DNA的存在。[0018] 在本实施例中，所述的第一步中一组12个基因，具体如下：SNCA、SPG20、ADAMTS1、SFRP5、SLC5A8、IGFBP3、GALR2、SLC16A12、SPOCK2、TLX2、HLTF、HPP1。[0019] 在本实施例中，所述第四步中PCR反应条件是：预变性95度10分；热循环95度30秒，62度30秒，72度60秒，42个循环。[0020] 在本实施例中，所述的第六步中单链DNA特异性外切酶是绿豆核酸酶。[0021] 在本实施例中，所述绿豆核酸酶的反应条件是：1x绿豆核酸酶反应缓冲液，0.05u/ul绿豆核酸酶，反应温度为37度，30分。[0022] 在本实施例中，所述第七步中PCR反应条件是：预变性95度10分；热循环95度30秒，62度30秒，72度60秒，25个循环。[0023] 在本实施例中，所述PCR反应体系为：1xPCR缓冲液，含2mM的MgCl2，NTP各0.3mM，引物混合物0.1-1uM，Taq DNA聚合酶0.04u/ul，模板DNA为经重亚硫酸钠处理并纯化的大肠癌患者粪便DNA样品，或人通用甲基化/非甲基化DNA标准品。

[0024]

在本实施例中，所述全自动毛细管电泳分析系统是美国 Advanced Analogic Technologies, Inc. (AATI)公司的产品。

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说 明 书

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如图1所示，甲基化DNA和非甲基化DNA标准品的PCR扩增产物在毛细管电泳检测系统的迁移时间不同，甲基化DNA的PCR产物在毛细管电泳检测系统中的迁移率比非甲基化DNA的要快，本发明优化甲基化DNA的PCR扩增效率，非甲基化DNA模板通常不能被扩增。

[0026] 如图2所示，大肠癌患者粪便中甲基化DNA检测过程中，甲基化DNA的PCR产物在毛细管电泳检测系统中的迁移率比非甲基化DNA的要快，本发明优化甲基化DNA的PCR扩增效率，非甲基化DNA模板通常不能被扩增。

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说 明 书 附 图

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图1

图2

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