第5卷第4期 环境污染治理技术与设备 Techniques and Equipment for Environmental Pollution Control Vo1.5.No.4 2 0 0 4年4月 Apr.2 0 0 4 大型蚤毒理试验应用与研究进展 叶伟红 刘维屏 (浙江大学环境科学研究所,杭州310029) 摘 要 大型蚤作为国际公认的标准试验生物,其毒理试验被许多国家定为毒性必测项目,各国纷纷建立了自己的标 准方法,因此有着广阔的应用前景。在分析中,主要介绍了大型蚤的试验培养技术和国内外对其毒理试验方面的研究 概况。 关键词 大型蚤 生物测试进展 Application and study progress of toxicity test of daphnia magna Ye Weihong Liu Weiping (Institute of Environmental Science,Zhejiang University,Hangzhou 310029) Abstract The water flea daphnia magna straus is a generally acknowledged standard test aquatic,and the mea- sure of its toxicity test has been prescribed as the obligatory item by many countries.These countries have established their standard method in succession,SO the toxicity test of daphnia magna straus has the widely prospects of applica- tion.This article mainly introduces the cultivate technology of daphnia magna and the domestic and foreign situation of its toxicity test. Key words daphnia magna straus;toxicity test;progress 大型蚤(daphnia magna straus)生活于自然水域, 蚤种一水蚤属一栉水蚤亚属一大型蚤。大多分布 属于浮游甲壳类动物,是世界种。它具有生活周期 在我国长江流域以北地区 。 短、繁殖快、经济、方便易得、对毒物敏感和易于在实 大型蚤是一组器官俱全的透明体,解剖镜下可 验室培养等优点,加上它们在水域生态系统中的重 直接观察到中毒症状。试验蚤可以从其他实验室已 要性,因而得到众多国家的应用,已成为一种标准试 有的纯培养中挑取、引种,也可以从野外采集,野外 验生物,广泛地用于水生生物毒理试验。大型蚤毒 采集的蚤要经分离、纯化。通常情况下大型蚤采取 理试验不仅可以评价工业废水、农药、化学毒品和水 单性孤雌生殖方式,当培养液中大型蚤的密度太大 中沉积物对水环境的污染,为制定各种水质标准提 的时候,会造成大型蚤停止孤雌生殖而进行有性生 供科学依据,而且可以做为监测手段控制水环境的 殖。蚤类喜食藻类、细菌、酵母及有机碎屑等,我国 污染。该实验方法已受到国内外许多人士的重视, 国标方法推荐用实验室培养的栅藻作为大型蚤的饵 具有广泛的技术前景。 料 1 大型蚤概述 大型蚤是国际公认的标准试验生物,自从美国 环保局在1978年将大型蚤定为毒性试验的必测项 目,建立了大型蚤的毒性试验的标准方法后 ,日本 2 国外研究进展 大型蚤的应用起始于1928年,美国科学家Aimo Viehoever 首先把水蚤试验技术应用在药理毒理学 和许多欧洲国家也相继建立了自己的标准方法,我 基金项目:国家杰出青年基金资助项目(20225721);国家自然科学基 国于1991年建立了自己的大型蚤急性毒性测定方 法 。 金资助项目(30270767) 收稿日期:2003—07—03;修订日期:2003—09—12 大型蚤分类学如下:大型水蚤系浮游生物一浮 游动物一节肢动物门一甲壳动物纲一鳃足亚纲一双 甲目一枝角亚目一具枝角亚目一盘肠水蚤总科一水 作者简介:叶伟红(1979~),女,硕士研究生,主要从事环境化学和 毒理研究。E-mail:zjuywh@sohu.eom *通讯联系人 第4期 叶伟红等:大型蚤毒理试验应用与研究进展 5 研究上。首次将水蚤类毒性实验应用在防止工业废 在这个时候,研究学者们陆续发现大型蚤对光 水污染工作上的是英国的学者Anderson ,他认为 有一定的反应,对其展开了初步的研究,如:De 水蚤类比鱼类更为敏感,先后报道了有关工业废水 Meester等 发现,受鱼类kairomones胁迫,大型蚤趋 中25种毒物的毒性试验。 光性(phototactic)参数值随时问增长明显地成直线下 20世纪50~60年代,人们主要是研究一些毒物 降,然而这个反应过程是很短的,只有2 h。Storz 对大型蚤生存的影响,到了20世纪70年代,随着大 等 研究结果表明,大型蚤在260~380 nm的紫外 型蚤毒理试验的发展,一些学者开始重视大型蚤的 光下具有消极的趋光性,其最大敏感光谱为340 慢性毒性试验研究。20世纪80年代以来,大型蚤 nm,而在420~600 nm的可见光照射下为积极的趋 毒理试验得到很大重视和发展,大型蚤的繁殖、生长 等慢性毒性试验开展起来,许多学者还进行了大型 蚤的富集及代谢试验。用大型蚤对毒物进行慢性毒 性效应的研究受到了很大重视,研究了各种金属对 大型水蚤生存繁殖和生长的影响。大型水蚤对毒物 是否有蓄积性,可通过富集实验加以验证,因此水蚤 的富集试验受到了国际上的重视 。 到了20世纪90年代,水蚤的毒理试验得到了 更广泛的研究。在大型蚤的急慢性毒性上,大型蚤 的生物测试技术已广泛地用于各种新有机物和对环 境和人体有生理影响的物质的测试,如对甘菊蓝 (azulene)和长叶烯(1ongifolene)、植物生长调节剂、邻 苯二甲酸酯增塑剂、烷烃酚类、麝香二甲苯衍生物、 急性麻醉剂(narcotic)、对硫磷(parathion)、杀虫剂二 嗪农等对大型蚤的急毒性实验,并把这些毒性实验 应用于工农业和生活污水处理上。如:Villegas Navar— ro等 研究用大型蚤测试处理过的工业废水和未经 处理的医院排水的LC50,并对其毒性进行对比。在 联合毒性方面。Penttinen等 用大型蚤来研究溶解 的有机物(DOM)和水硬度与cd的联合毒性,发现在 软水中,DOM对Cd起拮抗作用,而在硬水中(主要 是Ca 的增加)。由于Ca 与Cd 竞争在DOM上的 键合位置使得参照水和含腐殖质水中cd的急性毒 性并无差别。除了以上大型蚤宏观的研究外,发展 性地研究了大型蚤在毒物胁迫下其分子水平结构的 影响,如:Strum等 研究了环境中污染物胁迫下,大 型蚤体中氧化胆碱脂酶浓度的变化,试图找出这种 生物化学指标是否可以作为大型蚤亚致死毒性实验 的变量参数。Atienzar等 使用随机扩大的多形态 的DNA定量地评估苯并芘对大型蚤的基因毒性,结 果发现随机扩大的多形态的DNA方法不仅能快速、 可重现性地评价毒性.DNA诱导效应,而且可以定量 地测定基因组模板稳定性和传统健康指标的关系, 这个结果的发现对将来的生态毒理学研究具有重要 意义。 光性,其最大敏感光谱由光强决定等。 些研究学者 对大型蚤在不同条件下的生 长、繁殖特点进行了广泛的研究,研究了眼睛在大型 蚤移动速率中的作用,表明大型蚤眼睛中的光保护 色素的变化决定其垂直移动节律;Sakwinska L1 的实 验结果表明,捕食者的分泌物常常引起大型蚤的早 熟以此来保护自己免受捕食,而其昼夜的垂直移动 也是它的保护措施,但垂直游动经历的温度变化会 使其内禀增长率下降,这个实验目的在于找出大型 蚤对这2种情况的最适选择;Paul等 报道了缺氧 条件下大型蚤全身和新陈代谢反应情况,结果进一 步证实了大型蚤对低氧情况有很强的忍受力;Gur. buz等 发现不同培养基中大型蚤的生长情况有显 著的不同,其结果可供不同研究者借鉴;Slusarczyk 等 ‘研究了大型蚤在捕食者存在下、同种问竞争、 两种化学信号都存在或都不存在情况下都能产生雄 体,但只有在2种化学信号都存在下才会产生休眠 卵;Baillieu等¨ 研究了水中咸度对大型蚤游泳速率 的影响,其结果显示蚤身长的影响可用于计算游泳 速率,并且身体形态和游泳速率分析可作为检测其 是否背离了正常的生理学指标。这些结果使人们对 大型蚤的认识更进了一步。 在对一系列有机物的毒性实验中,研究学者们 开始把定量结构与活性关系(QSAR)应用于大型蚤 毒性实验,估测化合物的生物效应,取得一定的进 展。如:Wong等 研究了9种醇乙氧基化物表面活 性剂对蚤的毒性随烷基链长度和乙烯氧化物的增加 而加强,与OSAR模型的预测结果相似。通过这些 模型的建立。人们就能根据化合物较易测量或计算 的理化参数对其毒性进行定量估算,为风险评价提 供科学依据。 到了21世纪,研究学者们对大型蚤的毒性试验 更向纵、深方向发展了。在这一阶段,研究学者们运 用了各种不同的分析方法来测定大型蚤生物试验。 如:Araki等 用4.甲基.氨基氢化物(TMAH)存在下 6 环境污染治理技术与设备 第5卷 的热解一GC/MS法分析大型蚤对工厂废水中的三氯 试法较灵敏、精确;王连生等 报道的47种芳烃类 甲基邻苯二酚的生物蓄积,此方法简单、快速、时间 有机物结构与活性相关的模式参数研究,从理论上 短,因此可以用于评价工厂废水的毒性物质的生物 表述了有机物生物活性效应取决于有机物与生物靶 蓄积效应;Den Besten等 研究用中性红残留试验 分子的结合量和反应过程中靶分子含量,得出芳烃 (测溶酶体的稳定性)和成彗星状谱带分析(测DNA 类有机物分子对生物活性的贡献顺序,给出了多元 的完整性)的相互关系为指标,测定毒物对大型蚤生 优化方程;靳立军等 研究了取代苯甲醛衍生物的 命活动的影响,这个实验结果为将来用中性红残留 定量结构一活性关系(QSAR),发现其毒性主要取决 实验和成彗星状谱带分析方法来早期预测毒物对蚤 于苯环上取代基的Hammett电效应常数;陈景文 类影响做了基础研究,这些都为今后的试验提供了 多方面的测试方法。 Guilhermino等 通过对大型蚤急性试验,找出 毒物对蚤和哺乳动物(鼠)毒性相关性,可作为哺乳 动物毒性实验前的预先审查,对减少实验动物数量 有重要意义。 3国内研究进展 我国对大型蚤的毒性试验起始于20世纪60年 代。1962年,中国预防医学科学院的修瑞琴老师开 始从事大型蚤的有关研究,积累了大量资料,并和其 研究组高世荣老师等对大型蚤毒性技术进行了全面 系统的研究,不仅为我国建立了62D.M.大型蚤生 物株,而且在方法学上做了大量探索,发表了一系列 关于大型蚤的急慢性研究论文。20世纪80年代, 我国其他一些学者开始研究大型蚤,到了20世纪90 年代系列文章的报道增加了很多。20世纪90年代 初,我们对大型蚤的研究主要是急性毒性试验,如: 修瑞琴等 、高世荣等 研究了大型蚤对农药溴氰 菊酯,氰渣、锑冶炼碱渣的急性毒性实验,郭叶华 j 做了十二烷基苯磺酸钠对幼鱼及大型蚤急性致毒实 验。接着许多学者做了大型蚤的慢性毒性实验和富 集实验,中国科学院水生生物研究所报道了大型蚤 HB对五氯苯酚的富集与释放动力学研究 。到20 世纪90年代中期,人们开始了联合毒性研究,发表 了一系列关于这方面的文章,如傅迎春等 ’ 用相 加指数法和毒性单位分析法研究了氟和砷,氟与硒 都为拮抗作用。袁振华等 。开始把这些研究成果 初步地应用于工业废水和毒物毒性研究。 到20世纪90年代末和2l世纪初,大型蚤的毒 理实验得到广泛地开展。在原有的急慢性实验上, 发展了对酶活性和结构活性关系的研究,如黎艳霞 等 。研究的4种杀虫药剂对大型蚤的毒性和酶活 性影响的比较,结果表明,不同的杀虫剂对不同酶的 酶活性有着不同程度的影响,并证明了生化毒理测 等 研究了取代氮杂环类化合物对大型蚤的定量 结构一活性关系,结果表明,分子体积和偶极性一极化 性是该类化合物毒性的主要影响因素,得出了该类 化合物的定量构效关系方程,这些方程可以用来进 行该类化合物危害性的初评。人们可以利用上述得 到的QSAR表达式对其对应的化合物进行预测,推 测它们的环境行为。 我国研究学者们也开始运用各种不同的分析方 法来测定大型蚤生物试验。IJi等 j报道了,通过一 些标准测定方法(MBAS,BIAS,DSBAS等)和质谱法 测定表面活性剂对大型蚤的毒性试验,并进行比较, 证实质谱法更具数字上的可靠性。 随着大型蚤毒理试验的推广,它在实际中的应 用也得到迅速地发展,如:徐立红等 用水毒理学 方法评价了家用洗涤剂的潜在危害,程静等 研究 了生活与工业污水混合处理系统中关键毒物追踪。 4 结 语 应用大型蚤生物测试技术进行毒理试验在国外 已经进行了广泛而深入的研究,所见的报道甚多,我 国在20世纪80年代后陆续在大型蚤生物测试技术 上展开了研究,取得了一定的成果,但是其研究水平 比起国际水平还有一定的差距。目前,大型蚤的测 试技术已引起了我国研究人员的极大重视,他们已 经广泛地研究了大型蚤的生长、繁殖、富集的慢性试 验,并把这些实验结果应用于各个领域,初步地发展 了其代谢试验和测试方法,但是对化学毒物的致畸、 致突变性研究未见报道,如果能建立用大型蚤测试 环境化学物质的致突变性等方法,那么它的应用价 值将会更大,更有意义。 参考文献 [1]EPA.Water Quality Criteria,National Academy of Sciences. 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