第18讲 生物技术实践
[考纲热度]1.微生物的分离和培养(5年17考) 2.培养基对微生物的选择作用(5年10考)
3．利用微生物进行发酵来生产特定的产物以及运用发酵加工食品的基本方法(5年18考)
4．植物的组织培养(5年13考)
5.从生物材料中提取某些特定的成分(5年11考)
[诊断知识盲点]
1．消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害。(√) 2．在配制培养基时，除满足营养需求外，还应考虑pH、O2及特殊营养物质的需求。(√) 3．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。(√)
4．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则说明筛选到分解尿素的细菌。(×)
5．条件适宜时醋酸菌可将葡萄汁中的糖分解成醋酸。(√) 6．在果酒发酵后期，打开瓶盖的间隔时间可延长。(√) 7．在家庭中用鲜葡萄制作果酒时，向发酵装置通入空气。(×) 8．果醋发酵包括无氧发酵和有氧发酵。(×)
9．将长满毛霉的豆腐装瓶腌制时，底层和近瓶口处需加大用盐量。(×) 10．果酒、果醋和腐乳的制作中，腐乳制作所需要的适宜温度最高。(×) 11．在果酒自然发酵中，需人工添加酵母菌种。(×)
12．红葡萄酒中的红色是红葡萄皮中的色素进入发酵液产生的。(√) 13．变酸的酒的表面的菌膜是酵母菌大量繁殖形成的。(×)
14．在葡萄酒制作中，采摘的葡萄应反复冲洗，且要先除枝梗再冲洗。(×) 15．制作腐乳的菌种只有毛霉。(×)
16．在腐乳制作过程中加入香辛料既能调节风味，还具有防腐杀菌作用。(√) 17．在腐乳制作过程中，盐的用量要适宜，酒的含量一般控制在12%左右。(√) 18．泡菜制作的菌种主要是醋酸菌。(×) 19．泡菜制作的前期通氧，后期应严格厌氧。(×) 20．配制盐水时，盐与水的质量比为4∶1。(×) 21．愈伤组织是一团有特定结构和功能的薄壁细胞。(×)
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22．用人工薄膜将胚状体、愈伤组织等分别包装可制成人工种子。(×) 23．植物组织培养所需的外植体，可以来自于植物的任何细胞。(×) 24．植物组织培养应在无菌条件下进行。(√)
25．二倍体植株的花粉经脱分化与再分化后得到稳定遗传的植株。(×) 26．以花粉作为外植体可得到单倍体植株。(√)
27．不同阶段的培养基中细胞分裂素和生长素的比例不同。(√)
28．在剥离花药时，不要损伤花药，否则接种后不能脱分化形成愈伤组织。(×) 29．月季花药培养时得到的都是单倍体植株。(×)
30．蒸馏法的实验原理是利用水将芳香油溶解下来，再把水蒸发掉，剩余的就是芳香油。(×)
31．原料易焦糊和有效成分易水解的植物芳香油的提取，不宜采用水中蒸馏法，宜采用压榨法或萃取法。(√)
32．提炼玫瑰精油的玫瑰花应在花开的初期采取，因为此阶段的花含玫瑰精油最多。(×) 33．油水混合物中加入无水硫酸钠，有利于分离油层。(×) 34．乙醇和丙酮能够用于胡萝卜素的萃取。(×) 35．萃取的效率主要取决于萃取时的温度和时间。(×)
36．新鲜的胡萝卜含水量高，干燥时可采用高温以节省时间。(×)
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考点一 微生物的培养和利用
[高考领航]
1．(2016·高考全国乙卷)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：
①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)； ②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。 回答下列问题：
(1)该培养基中微生物所需的氮来源于________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。
(2)步骤③中，实验组的操作是________。
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(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________(填“正确”或“不正确”)。
解析：(1)牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。若要完成步骤②，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。(2)该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。(3)若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，导致实验变量不唯一，不能确定实验组平板上的菌落是否仅由教室内不同高度空气中的微生物形成，因此不能求出实验组的菌落平均数。
答案：(1)牛肉膏、蛋白胨 琼脂 (2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间 (3)污染 不正确
2．(2014·高考新课标全国卷Ⅱ)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是________________________；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为________。
(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是
________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________的利用率。
解析：(1)在涂布接种前，随机选取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格，不能留有杂菌。1 mL水稀释100倍之后的0.1 mL中3个平板菌落的平均数为38，1 L等于1 000 mL，则1 L水中含有38×10×100×1 000＝3.8×10。
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(2)用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后的划线时，从上一次划线末端开始划线，目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)稀释涂布平板法接种培养后得到的结果应为图B。(4)振荡可以使细菌分散，更有利于细菌利用培养液中的营养物质，并且可以使培养液中的溶解氧增多。
答案：(1)检测培养基平板灭菌是否合格 3.8×10 (2)灼烧 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落 (3)B (4)溶解氧 营养物质
3．(2014·高考新课标全国卷Ⅰ)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：
(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将________分解成________。
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成______________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：
培养基甲 培养基乙 酵母膏 ＋ ＋ 无机盐 ＋ ＋ 淀粉 ＋ ＋ 纤维素粉 ＋ － 琼脂 － ＋ CR溶液 ＋ ＋ 水 ＋ ＋ 7
注：“＋”表示有，“－”表示无。 据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_____________________________________________________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是
________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 解析：(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分：C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解成葡萄糖。(2)刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。用含有刚果红的纤维素培养基培养纤维素分解菌时，由于纤维素被分解，红色复合物无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌菌落为中心的透明圈。(3)培养基甲未使用琼脂，为液体培养基，不能用于分离单菌落。含有纤维素和刚果红(CR)的固体培养基可分离和鉴别纤维素分解菌。
答案：(1)纤维二糖 葡萄糖 (2)红 透明圈 (3)不能 液体培养基不能用于分离单菌落 不能 培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物，即使出现单菌落也
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不能确定其为纤维素分解菌
[核心探究]
1．培养基中主要营养物质
碳源、氮源、水、无机盐和特殊营养物质。 2．无菌技术包括消毒和灭菌
(1)无菌技术的选择原则：考虑效果和被操作对象的承受能力。 (2)实验操作要在酒精灯火焰附近进行。 3．选择微生物接种方法的原则
(1)纯化微生物：平板划线法和稀释涂布平板法均可。 (2)计数微生物：只能选择稀释涂布平板法。 4．选择培养基
对微生物具有选择作用的培养基。 5．微生物的鉴定需要配制鉴别培养基
(1)分解尿素的细菌可使添加酚红指示剂的培养基变红。
(2)纤维素分解菌可在含有刚果红的培养基上长出周围存在透明圈的菌落。
[题点突破]
1．微生物培养与分离技术是生物学中重要的实验技术。根据有关微生物的知识，分析回答问题：
(1)培养基的制备需经过计算、称量、溶化和B：________、A：________等过程，上述过程中需要在超净工作台上操作的是________。
(2)纯化菌种时为得到单菌落，常采用的接种方法是平板划线法和D：____________，其中需用接种环进行操作的是____________。
(3)为达到筛选土壤中分解尿素细菌的目的，平板内的固体培养基应以尿素作为唯一的________，培养基中加入________指示剂培养后，若变红则其中含有所需细菌。若筛选纤维素分解菌，在选择培养后须进行E：________和F：________过程，一般通过观察________的有无挑选出所需菌种。
解析：(1)培养基的制备需经过计算、称量、溶化、[B]灭菌、[A]倒平板等过程，其中倒平板需要在超净工作台上操作。(2)常采用的微生物接种方法是平板划线法和[D]稀释涂布
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平板法。其中平板划线法需用接种环进行操作。(3)欲筛选土壤中分解尿素的细菌，培养基中应以尿素作为唯一的氮源，需要在培养基中加入酚红指示剂进行鉴定。若筛选纤维素分解菌，在选择培养后须进行[E]梯度稀释→[F]涂布平板→挑选产生透明圈的菌落等过程。
答案：(1)灭菌 倒平板 倒平板 (2)稀释涂布平板法 平板划线法
(3)氮源 酚红 梯度稀释 涂布平板 透明圈
2．尿素是一种重要的农业肥料，经微生物分解后能更好地被植物利用。某生物兴趣小组试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计实验并成功筛选到能高效分解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示。将表中物质溶解后，用蒸馏水定容到100 mL。实验过程如图所示：
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 1.4 g 2.1 g 0.2 g 10 g 1 g 15 g
回答下列问题：
(1)该培养基能筛选出目的菌的原因是______________________。
(2)图中将细菌转到固体培养基上接种时，可采用的方法是_____________。初步筛选出来的菌种还需要进一步的鉴定：在培养基中加入________指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若指示剂变成________色，则可说明该菌种能够分解尿素。
(3)在实验中，下列材料或用具需要灭菌的是________，需要消毒的是________(填序号)。
①培养细菌的培养基与培养皿 ②玻棒、试管、锥形瓶和吸管 ③实验操作者的双手
(4)在进行分离分解尿素的细菌实验时，A同学从培养基上筛选出大约50个菌落，而其他同学只选择出大约20个菌落。A同学的实验结果产生的原因可能有________(填序号)。
①所取土样不同
②培养基被污染
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③接种操作错误 ④没有设置对照实验
(5)实验结束后，使用过的培养基应该进行________处理后，才能倒掉。
解析：(1)分析该培养基的成分表可知，尿素为该培养基中的唯一氮源，只有能利用尿素的微生物才能在该培养基中生长。(2)接种微生物时，常采用平板划线法或稀释涂布平板法。能分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会导致培养基的pH升高，使酚红指示剂变红。所以，欲鉴定初步筛选出来的菌种，可在培养基中加入酚红指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若指示剂变成红色，说明该菌种能够分解尿素。(3)在实验过程中，为了防止杂菌污染，需要对培养基、培养皿、玻棒、试管、锥形瓶、吸管等进行灭菌处理，即需要对①和②灭菌；需要对实验操作者的双手进行消毒，即对③进行消毒。(4)在实验时，如果取样不同、培养基污染、操作失误即①②③等都会导致分离筛选的菌落数多。(5)为了防止造成环境污染，实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理后，才能倒掉。
答案：(1)尿素是唯一的氮源，只有能利用尿素的微生物才能生长 (2)平板划线法或稀释涂布平板法 酚红 红 (3)①和② ③ (4)①②③ (5)灭菌
考点二 传统发酵技术的应用
[高考领航]
1．(2016·高考全国甲卷)苹果醋是以苹果汁为原料经发酵而成的。回答下列问题：
(1)酵母菌的呼吸代谢途径如图所示。图中过程①和②是苹果醋生产的第一阶段，在酵母菌细胞的________中进行，其产物乙醇与________试剂反应呈现灰绿色，这一反应可用于乙醇的检验；过程③在酵母菌细胞的________中进行。与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增殖速度________。
(2)第二阶段是在醋酸杆菌的作用下将第一阶段产生的乙醇转变为醋酸的过程，根据醋酸杆菌的呼吸作用类型，该过程需要在________条件下才能完成。
(3)在生产过程中，第一阶段和第二阶段的发酵温度不同，第一阶段的温度________(填“低于”或“高于”)第二阶段的。
(4)醋酸杆菌属于____核生物，其细胞结构中_____(填“含有”或“不含有”)线粒体。 解析：(1)图中过程①和②是酵母菌无氧呼吸产生乙醇的过程，无氧呼吸的场所是细胞质基质。乙醇可用酸性重铬酸钾试剂检测，颜色由橙色变为灰绿色。过程③为有氧呼吸的第二和第三阶段，场所为线粒体。在有氧条件下酵母菌进行有氧呼吸，产生更多的能量供酵母菌繁殖利用，故有氧条件下酵母菌的繁殖速度更快。(2)醋酸杆菌是好氧型细菌，因此，在
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醋酸杆菌作用下，将乙醇转变为醋酸的过程需要在有氧条件下才能完成。(3)在生产过程中，第一阶段酵母菌产生乙醇的适宜温度为18～25 ℃，第二阶段醋酸杆菌产生醋酸的适宜温度为30～35 ℃，第一阶段的温度低于第二阶段的。(4)醋酸杆菌属于原核生物，原核细胞中的细胞器只有核糖体一种，不含线粒体。
答案：(1)细胞质基质 重铬酸钾 线粒体 快 (2)有氧 (3)低于 (4)原 不含有 2．(2015·高考广东卷)泡菜是我国的传统食品之一，但制作过程中产生的亚硝酸盐对人体健康有潜在危害，某兴趣小组准备参加“科技创新大赛”，查阅资料得到下图。
(1)制作泡菜时，泡菜坛一般用水密封，目的是________。乳酸菌发酵第一阶段的产物有________。
(2)据上图，与第3天相比，第8天后的泡菜更适于食用，因为后者________；pH呈下降趋势，原因是________________。
(3)该小组得到一株“优选”乳酸菌(亚硝酸盐还原酶活力比普通乳酸菌高5倍)，拟参照资料的实验方案和食盐浓度(4%～10%)，探究与普通乳酸菌相比用“优选”乳酸菌制作泡菜过程中亚硝酸盐含量的高低，并确定其最适条件。请你设计一个实验结果记录表，并推测实验结论。
解析：(1)制作泡菜时，泡菜坛要选择密封性好的容器，一般用水密封，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。乳酸菌发酵第一阶段的产物有丙酮酸、[H]和少量ATP。(2)第3天时，泡菜中亚硝酸盐含量达到最高，在第8天后的泡菜中，亚硝酸盐含量降到最低，故第8天后的泡菜更适于食用。乳酸菌无氧呼吸产生的乳酸会导致pH下降。(3)设计的记录表中要包含乳酸菌类型、食盐浓度和发酵时间等自变量，因变量为亚硝酸盐的含量。通过相互对照确定用“优选”乳酸菌制作泡菜过程中亚硝酸盐含量的高低，并确定最适发酵条件。
答案：(1)创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵 丙酮酸、[H](少量ATP) (2)亚硝酸盐含量低 乳酸菌无氧呼吸产生了乳酸 (3)两种乳酸菌在泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量变化表
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推测实验结论：与普通乳酸菌相比，“优选”乳酸菌制作泡菜时，相同条件下产生的亚硝酸盐含量低。
3．(2016·高考全国丙卷)某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：
(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是______________________________________________________________________
________________________________________________________________________。 (2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有________和________。分离纯化时应挑选出________的菌落作为候选菌。
(3)乳酸菌在－20 ℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的________(填“蒸馏水”、“甘油”或“碳酸钙”)。
解析：(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释，这样既可避免杂菌污染，又可将乳酸菌分散成单个细胞，以便在培养基表面形成单个菌落。(2)乳酸的积累影响乳酸菌的增殖，加入碳酸钙可以中和乳酸菌代谢(无氧呼吸)过程中产生的乳酸，另外，乳酸和碳酸钙反应，进而导致碳酸钙分解形成透明圈，有利于乳酸菌的鉴别和分离。(3)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在3 mL的甘油瓶中，装入1 mL甘油后灭菌。将1 mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20 ℃的冷冻箱中保存。
答案：(1)无菌水 泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落 (2)鉴别乳酸菌 中和产生的乳酸(或酸) 具有透明圈 (3)甘油
[核心探究]
1．传统发酵食品的发酵类型
(1)果酒制作和泡菜制作：无氧发酵，应控制无氧条件。 (2)果醋制作和腐乳制作：有氧发酵；腐乳制作后期为无氧发酵。
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2．发酵菌种类型
(1)果酒制作和腐乳制作的发酵菌种：真菌。(真菌，细菌) (2)果醋制作和泡菜制作的发酵菌种：细菌。(真菌，细菌) 3．腐乳发酵的原理
毛霉等微生物产生的蛋白酶和脂肪酶将蛋白质和脂肪分解为小分子有机物。 4．控制杂菌
包括发酵条件、盐、酒和香辛料(调味料)等因素。
[题点突破]
1．根据相关知识，回答关于果酒、果醋和腐乳制作的相关问题： (1)当________时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。
(2)在________条件下，重铬酸钾与酒精发生反应呈现________色。 (3)下图为腐乳制作的实验流程示意图，据图回答下列问题：
①图中A代表________，其主要目的是_____________，同时还能________________。 ②在配制卤汤中酒的含量一般控制在____________左右，酒精含量过高腐乳成熟时间将会________；酒精含量过低，________，可能导致豆腐腐败。
解析：在氧气、糖源都充足的条件下，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精发生反应呈现灰绿色。在腐乳制作过程中，在豆腐上长出毛霉后需加盐腌制，盐的作用是析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬，还能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质。卤汤中加酒需适量，酒精含量过高使腐乳成熟时间延长，酒精含量低，不足以抑制微生物的生长。
答案：(1)氧气、糖源都充足 (2)酸性 灰绿
(3)①加盐腌制 析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬 抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质 ②12% 延长 不足以抑制微生物的生长
2．回答下列有关泡菜制作的问题：
(1)制作泡菜时，所用盐水需煮沸，其目的是____________。为了缩短制作时间，有人还会在冷却后的盐水中加入少量陈泡菜液，加入陈泡菜液的作用是________________。
(2)泡菜制作过程中，乳酸发酵的过程即为乳酸菌进行________________的过程，该过程发生在乳酸菌细胞的________中。
(3)泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素有________、________和________等。 (4)从开始制作到泡菜品质最佳这段时间内，泡菜液逐渐变酸。这段时间内泡菜坛中乳酸菌和其他杂菌的消长规律是__________________，原因是__________________。
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解析：(1)细菌分布广泛，制作泡菜时，需要利用乳酸菌进行发酵，为防止杂菌污染，所用盐水需要煮沸；加入陈泡菜液，可以增加乳酸菌数量，加速乳酸产生。(2)乳酸菌为原核生物，可进行无氧呼吸将葡萄糖分解为乳酸，其无氧呼吸的过程发生在乳酸菌的细胞质中。(3)在泡菜制作过程中，要注意控制腌制的时间、温度和食盐的用量等。(4)由于乳酸菌比杂菌更为耐酸，所以在酸性环境中，乳酸菌能够正常地增殖，而其他杂菌繁殖将受到抑制，所以在此过程中，乳酸菌数量增多，杂菌数量减少。
答案：(1)杀灭杂菌 增加乳酸菌数量 (2)无氧呼吸 细胞质 (3)温度 腌制时间 食盐用量
(4)乳酸菌数量增多，杂菌数量减少 乳酸菌比杂菌更为耐酸
考点三 植物组织培养
[高考领航]
(2014·高考江苏卷)为了获得植物次生代谢产物，先用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中悬浮培养。请回答下列问题：
(1)外植体经诱导后形成愈伤组织的过程称为________。
(2)在愈伤组织悬浮培养时，细胞干重、蔗糖浓度和pH的变化如下图所示。细胞干重在12 d后下降的原因有__________________；培养液中蔗糖的作用是________、________。
(3)多倍体愈伤组织细胞产生的次生代谢产物量常高于二倍体。二倍体愈伤组织细胞经________处理，会产生染色体加倍的细胞。为检测愈伤组织细胞染色体数目，压片前常用纤维素酶和________酶解离愈伤组织。若愈伤组织细胞(2n)经诱导处理后，观察到染色体数为8n的细胞，合理的解释是______________________、________________。
(4)为了更好地获得次生代谢产物，生产中采用植物细胞的固定化技术，其原理与酵母细胞固定化类似。下列说法正确的有________(填序号)。
①选取旺盛生长的愈伤组织细胞包埋 ②必须在光照条件下培养 ③培养过程中需通空气 ④固定化后植物细胞生长会变慢
解析：本题考查植物组织培养、诱导染色体加倍、有丝分裂、细胞的固定化技术。(1)外植体在人工、无菌条件下，经脱分化可形成愈伤组织。(2)由图蔗糖浓度下降可知，外植体离体培养过程中需要消耗蔗糖，12天后蔗糖浓度较低；pH下降会影响酶的活性，愈伤组
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织细胞对物质的合成少于分解，细胞干重下降。植物组织培养过程中，蔗糖既能维持一定的渗透压，又能提供植物细胞生命活动必需的营养物质(能量)。(3)一定浓度的秋水仙素或低温都可抑制纺锤体的形成，使子染色体不能移向两极，从而使细胞中染色体数目加倍。植物细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，可通过纤维素酶、果胶酶破坏细胞壁，从而使愈伤组织细胞分离。在用秋水仙素或低温处理后，会出现染色体为2n、4n、8n等的细胞，4n的细胞在有丝分裂后期着丝点分裂，染色体数目加倍至8n；8n的细胞在有丝分裂中期能清晰看出8n条染色体。(4)为了更好地获得次生代谢产物，应选用生长旺盛的愈伤组织细胞。愈伤组织不能进行光合作用，因此要通入无菌空气确保其正常的生命活动。细胞的固定化通常使用包埋法，由于包埋材料的影响，营养物质和氧气的扩散都受到一定的限制，所以固定化细胞生长速度会变慢。
答案：(1)脱分化
(2)蔗糖浓度下降，pH降低 提供能源 调节渗透压
(3)秋水仙素(低温) 果胶 经加倍到4n的细胞处于有丝分裂后期 经加倍到8n的细胞处于有丝分裂中期
(4)①③④
[核心探究]
1．MS培养基中的营养物质包括
大量元素、微量元素和有机物，其主要营养物质为无机盐。 2．植物组织培养的关键环节 脱分化和再分化。 3．生长素和细胞分裂素
是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。
(1)生长素与细胞分裂素的使用顺序不同，培养物的发育方向不同。 (2)生长素与细胞分裂素的用量比例影响培养物的发育方向。 4．植物组织培养过程需要无菌技术 (1)培养基用高压蒸汽灭菌。
(2)外植体需要利用酒精和HgCl2消毒。 (3)接种要在酒精灯火焰附近进行。 5．产生花粉植株的途径
可通过愈伤组织或胚状体两种途径。 6．鉴定花粉发育期的方法 醋酸洋红法和焙花青—铬矾法。
[题点突破]
1．用多倍体育种的方法培育三倍体无子西瓜，每年都要制种，很麻烦。某活动小组同
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学们，想到了利用植物组织培养的方法来解决此难题。请回答与此实验相关的问题。
(1)离体的组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的一种培养基是________，其主要成分包括：大量元素、微量元素、有机物，还常常需要添加________；对培养基要进行________灭菌。
(2)选取合适的外植体作为实验材料，接种前还要对其进行________处理。为提高组织培养成功率，常选择________的材料做外植体。
(3)如果外植体选取的材料为茎段，插入培养基时应注意________。培养一段时间后，会通过________形成愈伤组织，愈伤组织的特点是________________________。
解析：(1)植物组织培养的基本培养基为MS固体培养基，其主要成分包括大量元素、微量元素、有机物和植物激素。为了防止杂菌污染，配制好的培养基要采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。(2)为了防止外植体上的杂菌污染，接种前要对其进行消毒处理。由于材料的年龄影响培养的成功率，因此通常选择幼嫩的材料做外植体。(3)利用茎段做外植体，插入培养基时要注意不要倒插，否则不易形成愈伤组织。愈伤组织是外植体通过脱分化形成的，其特点是排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞。
答案：(1)MS固体培养基 植物激素 高压蒸汽 (2)消毒 幼嫩(或答分裂能力强，分化程度低)
(3)不能倒插 脱分化 排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞 2．如图是花药培养产生花粉植株的两种途径，回答下列相关问题：
(1)通过花药培养产生花粉植株有两种途径，一种是花粉通过A________阶段发育成植株，另一种是花粉在诱导培养基上先形成B，再将其诱导分化成植株。这两种途径并没有绝对的界限，主要取决于培养基中________________________________。
(2)诱导花粉植株能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中主要的影响因素是________与________。提高诱导成功率的另一个重要因素是____________________。
(3)材料消毒过程中用到的试剂有________、0.1%的氯化汞溶液、无菌水。
(4)灭菌后的花蕾，要在________条件下接种到培养基上。培养过程中不需要光照，同时要控制好温度。
(5)在花药培养中，常常会出现____________的变化，因此需要对培养出来的植株做进一步的________。
解析：(1)图中A通过分化形成丛芽，则A应为胚状体。形成花粉植株两条途径的不同主要取决于培养基中激素的种类和浓度的配比。(2)诱导花粉植株能否成功及诱导成功率的高低的主要影响因素是材料的选择和培养基的组成。另外，选择合适的花粉发育时期也是影
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响诱导成功率的另一个重要因素。(3)材料消毒用的试剂主要是70%的酒精、0.1%的氯化汞溶液和无菌水等。(4)植物组织培养的有关操作均需要在无菌条件下进行。(5)在花药培养中，常常会出现染色体倍性的变化，因此需要对培养出的植株做进一步的鉴定和筛选。
答案：(1)胚状体 激素的种类和浓度的配比
(2)材料的选择 培养基的组成 选择合适的花粉发育时期 (3)70%的酒精 (4)无菌
(5)染色体倍性 鉴定和筛选
考点四 植物芳香油的提取
[高考领航]
1．(2015·高考全国卷Ⅰ·节选)已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：
(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用________染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用________(填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。
解析：(1)油脂可被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色，被苏丹Ⅳ染液染成红色，因此油脂通常用苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染色。不易挥发的物质大多采用萃取法进行提取，水蒸气蒸馏法一般用来提取易挥发的物质。
答案：(1)苏丹Ⅲ(或苏丹Ⅳ) 萃取法
2．(2015·高考全国卷Ⅱ)回答与胡萝卜素有关的问题：
(1)胡萝卜含有的胡萝卜素中，最主要的是________(填“α胡萝卜素”、“β胡萝卜素”或“γ胡萝卜素”)，该胡萝卜素在人体内可以转变成两分子________，后者缺乏会引起人在弱光下视物不清的病症，该疾病称为________，胡萝卜素是________(填“挥发性”或“非挥发性”)物质。
(2)工业生产上，用养殖的岩藻作为原料提取胡萝卜素时，________(填“需要”或“不需要”)将新鲜的岩藻干燥。
(3)现有乙醇和乙酸乙酯两种溶剂，应选用其中的______作为胡萝卜素的萃取剂，不选用另外一种的理由是________________。
解析：(1)胡萝卜含有的胡萝卜素有三类，其中最主要的是β胡萝卜素，β胡萝卜素在人体内可以转变成维生素A，维生素A缺乏会导致夜盲症。胡萝卜素是非挥发性物质。(2)胡萝卜素的提取一般采用萃取法，萃取前需要对材料进行干燥处理，以提高萃取的效率。(3)萃取胡萝卜素的有机溶剂应该具有很高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶，如乙酸乙酯。乙醇是水溶性有机溶剂，因萃取过程中能与水混溶而影响萃取效果，所以不用它作萃取剂。
答案：(1)β胡萝卜素 维生素A 夜盲症 非挥发性
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(2)需要
(3)乙酸乙酯 萃取胡萝卜素的有机溶剂应不与水混溶，而乙醇为水溶性有机溶剂
[核心探究]
1．依据植物有效成分的特性选择提取方法 (1)提取挥发性强的植物芳香油：蒸馏法。 (2)提取易溶于有机溶剂的植物有效成分：萃取法。 (3)提取原料中含量高的植物有效成分：压榨法。 2．物质分离的方法
(1)分离油水混合物可以采用分液的方法。
(2)除去压榨液中的固体物和残渣通常采用过滤的方法。 (3)除去液体中质量较小的固体残留物通常采用离心的方法。 (4)除去芳香油中的残留水分常采用加入无水硫酸钠后过滤的方法。 (5)除去不易挥发的植物有效成分中的有机溶剂常采用蒸馏法。
[题点突破]
1．生物组织中存在多种有机物，不同的有机物其提取与鉴定方法不尽相同。根据所学知识，请回答下列问题。
(1)采用蒸馏法提取玫瑰精油时，向初步提取的乳化液中加入________________，作用是______________________。
(2)采用压榨法提取橘皮精油时，提取之前需用________浸泡，以提高出油率。为了使橘皮油易与水分离，还要分别加入相当于橘皮质量0.25%的________和5%的________，并调节pH至7～8。
(3)采用萃取法从胡萝卜中提取胡萝卜素的主要步骤为粉碎、干燥、萃取、________、________。干燥时，要注意控制________，否则会引起胡萝卜素的分解；萃取的效率主要取决于萃取剂的________，同时还受原料颗粒的大小、含水量等条件的影响；在对提取的胡萝卜素粗品通过纸层析法进行鉴定时，应与____________作对照。
解析：(1)用蒸馏法提取玫瑰精油时，获得的乳化液是油水混合物，需要加入NaCl以增加盐的浓度，促进油水分层。(2)采用压榨法提取橘皮精油时，提取之前需用石灰水浸泡，以除去果胶、果蜡，提高出油率。为了使橘皮油易与水分离，还要分别加入相当于橘皮质量0.25%的NaHCO3和5%的Na2SO4，并调节pH至7～8。(3)采用萃取法从胡萝卜中提取胡萝卜素的主要步骤为粉碎、干燥、萃取、过滤、浓缩。干燥时，由于温度过高会导致胡萝卜素的分解，因此要注意控制温度和时间。萃取的效率主要取决于萃取剂的性质和使用量，同时还受原料颗粒的大小、含水量等条件的影响；在对提取的胡萝卜素粗品通过纸层析法进行鉴定时，应与标准样品作对照。
答案：(1)NaCl 增加盐的浓度，有利于油水分层
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(2)石灰水 NaHCO3 Na2SO4
(3)过滤 浓缩 温度和时间 性质和使用量 标准样品 2．下列是与芳香油提取相关的问题，请回答：
(1)玫瑰精油适合用水蒸气蒸馏法提取，其理由是玫瑰精油具有___________的性质。蒸馏时收集的蒸馏液________(填“是”或“不是”)纯的玫瑰精油，原因是______________
________________________________________________________________________。 (2)当蒸馏瓶中的水和原料量一定时，蒸馏过程中，影响精油提取量的主要因素有蒸馏时间和________。
(3)如果蒸馏过程中不进行冷却，则精油提取量会________，原因是______________。 (4)密封不严的瓶装玫瑰精油保存时最好存放在温度________的地方，目的是_______。 解析：(1)易挥发的植物精油能与水蒸气一起蒸馏，不溶于水的植物精油易与水分离，化学性质稳定的精油才能在蒸馏时不会被分解，因此只有易挥发、难溶于水且化学性质稳定的植物精油才适合用蒸馏法提取。蒸馏时收集的蒸馏液是油水混合物，而不是纯的玫瑰精油。(2)当蒸馏瓶中的水和原料量一定时，蒸馏时间和蒸馏温度是影响精油提取量的主要因素。(3)如果蒸馏过程中不进行冷却，则部分精油会挥发掉，从而使提取量下降。(4)由于温度越高，玫瑰精油的挥发速度越快，因此密封不严的瓶装玫瑰精油保存时最好存放在温度较低的地方以减少挥发。
答案：(1)易挥发、难溶于水、化学性质稳定 不是 玫瑰精油随水蒸气一起蒸馏出来，所得到的是油水混合物
(2)蒸馏温度
(3)下降 部分精油会随水蒸气挥发而流失 (4)较低 减少挥发
限时规范训练 (建议用时：40分钟)
1．如图是植物组织培养过程示意图，请回答有关问题： ①②③④外植体――→愈伤组织――→长出丛芽――→生根――→移栽成活
(1)外植体若是菊花茎段组织，则在配制MS固体培养基时，________(填“必需”或“不必”)添加植物激素。
(2)外植体若是月季的花药，则图中的①过程________(填“需要”或“不需要”)光照，而经②③④过程培养出的植物一般称为________植株。该植株产生的途径除了图中所示外，还可以是花粉通过________阶段发育而来。
(3)外植体若是菊花的根尖组织，则在正常环境下培养成的新菊花植株叶片的颜色是________，该过程体现了植物细胞具有________。
(4)植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂和分化的关键性激素，在植物组织
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培养过程中：①若先使用细胞分裂素，后使用生长素，实验结果是细胞__________。②当同时使用这两种激素时，生长素用量比细胞分裂素用量的比值________(填“高”、“低”或“适中”)时，促进愈伤组织的形成。
解析：(1)由于菊花茎段的组织培养比较容易，因此在配制MS固体培养基时，不必添加植物激素。(2)图中的①过程表示脱分化，花药培养的脱分化过程中不需要光照。通过花药离体培养获得的是单倍体植株。该植株产生的途径除了图中所示外，还可以是花粉通过胚状体阶段发育而来。(3)外植体若是菊花的根尖组织，由于植物细胞具有全能性，根尖细胞具有全套的遗传物质，则在正常环境下培养成的新菊花植株叶片的颜色是绿色。(4)①植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势，分化频率高。在植物组织培养过程中，若先使用细胞分裂素，后使用生长素，实验结果是细胞既分裂也分化。②生长素用量与细胞分裂素用量，比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化，抑制根的形成；比例适中时，促进愈伤组织的形成。
答案：(1)不必 (2)不需要 单倍体(花粉) 胚状体 (3)绿色 全能性 (4)①既分裂也分化 ②适中
2．辣椒素作为一种生物碱广泛用于食品保健、医药工业等领域。辣椒素的获得途径如图：
(1)图中①和②分别表示辣椒组织培养中细胞的________和________过程。
(2)图中培养外植体的培养基中常用的凝固剂是________。培养基中的生长素和细胞分裂素用量的比值________(填“高”或“低”)时，有利于芽的分化。对培养基彻底灭菌时，应采取的灭菌方法是____________。
(3)图中外植体的消毒所需酒精的体积分数是________。用酶解法将愈伤组织分离成单细胞时，常用的酶是________和纤维素酶。
(4)提取辣椒素过程中，萃取加热时需安装冷凝回流装置，其目的是_____________。 解析：(1)将外植体培养成愈伤组织，属于脱分化过程，再生根、芽为再分化过程。(2)固体培养基的凝固剂多为琼脂。利于芽分化的激素比例为生长素低于细胞分裂素，高压蒸汽灭菌可以杀死环境中的一切细胞、芽孢、孢子。(3)体积分数为70%的酒精可以杀死外植体表面的微生物。植物细胞间质为果胶和纤维素，可以用果胶酶和纤维素酶使愈伤组织分散为单个细胞。(4)冷凝可以防止有机溶剂的挥发。
答案：(1)脱分化(或去分化) 再分化
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(2)琼脂 低 高压蒸汽灭菌
(3)70% 果胶酶 (4)防止有机溶剂的挥发
3．如图表示金花茶茎段的离体培养过程。请回答下列问题：
(1)金花茶组织培养利用的原理是____________，常用的一种培养基是________。在该培养基配制好后，常需要添加________。
(2)在接种前需要对金花茶茎段进行________。为确定培养基是否灭菌彻底，检测的方法是将未接种的培养基________。若用金花茶的花药进行离体培养，从花粉粒的选择上看，应选择________期的花粉粒为宜。
(3)某人在探究植物激素对细胞脱分化和再分化的影响实验时，得到如下实验结果：①只有细胞分裂素时，组织块产生愈伤组织；②细胞分裂素＝生长素时，愈伤组织不分化；③细胞分裂素>生长素时，愈伤组织分化出芽；④细胞分裂素<生长素时，愈伤组织分化出根。
由实验结果，你能得出的结论是______________________________________。 解析：(1)植物组织培养利用的原理是植物细胞的全能性，其常用的一种培养基是MS固体培养基。在配制好的培养基中，常常需要添加植物激素，其中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。(2)接种前，需要对茎段(外植体)进行消毒处理。为确定培养基是否灭菌彻底，可将未接种的培养基在适宜环境中放置一段时间，并观察培养基上是否有菌落出现，若有则证明培养基灭菌不彻底。一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧，花粉培养成功率最高。单核期以前的花药质地幼嫩，极易破碎；单核期以后的花药所在植株的花瓣已有些松动，材料不易消毒。(3)根据结果①，可知细胞分裂素可调节组织块产生愈伤组织；根据结果②③④，可知细胞分裂素和生长素含量不同，调节愈伤组织的分化方向不同。
答案：(1)植物细胞的全能性 MS固体培养基 植物激素 (2)消毒 在37 ℃恒温箱中放置24小时(或在适宜温度下放置一段时间)后，观察是否有菌落出现 单核 (3)植物激素的种类和含量不同，对愈伤组织的形成和分化的影响不同
4．请回答下列与实验室提取芳香油有关的问题：
(1)提取植物芳香油时可采用的方法有萃取法、________和________。
(2)玫瑰油被称为“液体黄金”，是世界香料工业中不可取代的原料，多用于制造高级香水等化妆品。下图表示提取玫瑰油的流程，其中A表示________；B表示________，其中加入NaCl的作用是__________________________。
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(3)植物芳香油溶解性的特点是不溶于________，易溶于________，因此可用其作为提取剂来提取植物芳香油。
(4)柠檬油是一种广谱性的杀虫剂，通常以柠檬花与柠檬果皮为原料进行提取，但方法不同，其中以柠檬果皮为原料时常采用________法提取柠檬油。
解析：(1)提取植物芳香油时可采用的方法有压榨法、蒸馏法、萃取法。(2)因为水和芳香油沸点不同，可利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，混合物又会重新分出油层和水层，因此，一般采用的提取玫瑰油的方法是水蒸气蒸馏法。A表示水蒸气蒸馏，B表示无水硫酸钠，加入NaCl会增加盐的浓度，使油和水出现明显的分层。(3)植物芳香油不溶于水，易溶于有机溶剂。(4)以柠檬果皮为原料时常采用压榨法。
答案：(1)蒸馏法 压榨法(两空答案顺序可颠倒) (2)水蒸气蒸馏 无水硫酸钠 增加盐的浓度，使油和水出现明显的分层 (3)水 有机溶剂 (4)压榨
5．回答下列有关从生物材料中提取某些特定成分的问题：
(1)薄荷油和玫瑰精油的化学性质相似，因此适合选用________法来提取。用此方法收集到的液体________(是/不是)纯的薄荷油，原因是_________________。在此过程中，影响薄荷油提取量的主要因素有________和________。
(2)从胡萝卜中提取胡萝卜素常用的方法是________法。用这种方法提取胡萝卜素的主要步骤是：粉碎、干燥、萃取、________、________。
(3)如图是某同学对萃取的胡萝卜素样品所做的鉴定实验的结果。图中实验组是________，实验得出的结论是________。
解析：(1)薄荷油和玫瑰精油都是芳香油，易挥发、难溶于水、化学性质稳定，因此可用水蒸气蒸馏法进行提取。由于薄荷油随水蒸气一起蒸馏出来，所得到的是油水混合物，不是纯的薄荷油。蒸馏温度太高、时间太短，产品品质就比较差。(2)胡萝卜素易溶于有机溶剂，可用有机溶剂进行萃取，步骤是：粉碎→干燥→萃取→过滤→浓缩。(3)胡萝卜素萃取后溶于有机溶剂，图中实验组是B、C，对照组是A、D。
答案：(1)水蒸气蒸馏 不是 薄荷油随水蒸气一起蒸馏出来，所得到的是油水混合物 蒸馏时间 蒸馏温度
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(2)萃取 过滤 浓缩
(3)B、C 萃取样品中不含β胡萝卜素
6．将植物中的有效成分提取出来，有很多用途，可显著提高其利用价值。请结合所学知识回答：
(1)许多植物芳香油的提取在原理和程序上具有相似性，某同学结合玫瑰精油的提取，设计提取茉莉油的实验流程如下：
茉莉花＋水→A→油水混合物→B→加C→D→茉莉油
流程图中的A表示______过程，B过程常需要用到的仪器是______，C物质是______，加C的目的是____________________________。茉莉油的提取能否采用这一流程进行生产，应该考虑茉莉油是否像玫瑰油一样具有较强的________，还应考虑茉莉花在水中蒸馏是否会出现________________________等问题。
(2)辣椒素的提取与胡萝卜素的提取有类似之处。可采用萃取法进行提取。提取时若需要加热，应采用水浴加热的方法，原因是______________________________；加热时，还要在瓶口安装冷凝回流装置，其目的是____________________。
解析：(1)玫瑰精油的提取方法为水蒸气蒸馏法。流程图中的A过程为水蒸气蒸馏过程。蒸馏获得的油水混合物需借助分液漏斗分离油层和水层。油水分层后需用无水Na2SO4除水。水蒸气蒸馏法提取植物芳香油的原理是利用了植物芳香油所具有的挥发性，随水蒸气一起蒸馏，但是对原料易焦糊和有效成分易水解的植物芳香油则不能用该方法提取。(2)用有机溶剂萃取时，由于有机溶剂易挥发，且易燃易爆，因此不能直接使用明火加热，应采用水浴加热的方法，否则容易引起燃烧、爆炸。萃取时冷凝回流装置的作用是防止有机溶剂的挥发。
答案：(1)水蒸气蒸馏 分液漏斗 无水Na2SO4 除水 挥发性 原料焦糊和有效成分水解 (2)有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧、爆炸 防止有机溶剂的挥发
7．自印度科学家培养曼陀罗花药获得单倍体植株后，花药离体培养技术迅速发展，据记载，现在已经有250多种高等植物的花药培养成功。
(1)细胞分裂素和生长素的使用顺序和用量会影响到植物细胞的发育方向。如为了有利于细胞分裂而不分化，两种激素的使用顺序为：
________________________________________________________________________。 花粉植株产生的途径有两种：一种是花粉脱分化形成愈伤组织，另一种是形成___。 (2)进行月季花药离体培养一般选择在五月初到五月中旬。对于花粉而言，要采用____期的花粉，为了鉴定该时期的花粉，常采用醋酸洋红法进行染色鉴定。若是某些植物花粉细胞不易着色，常采用________法染色，能将花粉的细胞核染成________色。
(3)消毒后的花蕾，在无菌条件下除去萼片与花瓣，剥离花药时，尽量不要损伤花药，同时要将________彻底去除。
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解析：(1)先使用生长素，后使用细胞分裂素，有利于细胞分裂而不分化。花粉植株产生的途径有两种：一种是花粉脱分化形成愈伤组织，另一种是形成胚状体。(2)单核期的花粉对离体刺激比较敏感，因此一般选择单核期的花粉作为外植体。鉴定花粉发育时期的方法有醋酸洋红法和焙花青—铬矾法。焙花青—铬矾法可以将不易着色的花粉细胞的细胞核染成蓝黑色。(3)花丝影响外植体的发育，因此剥离花药时要将花丝彻底去除。
答案：(1)先使用生长素，后使用细胞分裂素 胚状体 (2)单核 焙花青—铬矾 蓝黑 (3)花丝
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