1 实验目的
综合应用微生物学基本原理和基本实验技术，独立完成培养基的制备与灭菌操作及微生物的分离、观察、描述，掌握多管发酵法测定珠江水的总大肠杆菌群数的实验方法与技术。
2 实验材料
2.1 实验仪器
超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、显微镜、天平等。
培养基：乳糖蛋白胨培养液（分装于10支25ml试管中，内含倒置德汉氏小倒管）、伊红—美蓝（EMB）培养基。 2.2 染色剂
结晶紫液、碘液、95%乙醇、番红溶液 2.3 水样
珠江水样 2.4 其他
报纸、橡皮筋、棉塞、标签纸、无菌水、10.0ml移液管、吸耳球、250ml和100ml锥形瓶、移液枪、培养皿、载玻片、油性笔、接种环、酒精灯、香柏油等
3 实验步骤
3.1 初发酵试验
3.1.1 乳糖蛋白胨培养液的配制与灭菌
将2.76g乳糖蛋白胨粉末溶解于装有120mL蒸馏水的锥形瓶中，充分混匀，然后分装于10支试管中，每支试管装10ml培养液，再用镊子夹取德汉氏小套管，并用小滴管灌满培养液后倒置放入试管中，塞上棉塞，并用报纸包扎好，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，待冷却后使用。 3.1.2 灭菌水的制备
用100ml锥形瓶装80ml自来水，塞上棉塞并用报纸包扎好，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，待冷却后使用。 3.1.3 实验器皿的包扎与灭菌
用报纸将初发酵实验用到的10个移液枪头、一支10.0ml移液管包扎好，121℃高压灭菌器中灭菌15min，待冷却后使用。 3.1.4 稀释水样
取5个装有9ml灭菌水的灭菌试管。取1ml水样注入第一管9ml灭菌水内，摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第五管，稀释度分别为10-1，10-2,10-3,10-4,10-5。并贴上做对应的标记的标签。 3.1.5 接种水样
于已灭菌和冷却后的装有10mL乳糖蛋白胨培养液的3个试管中(内有倒管)，分别加入1mL稀释度为10-3的水样；于已灭菌和冷却后的装有10mL乳糖蛋白胨培养液的3个试管中(内有倒管)，分别加入1mL稀释度为10-4的水样；再于已灭菌和冷却后的装有10mL乳糖蛋白胨培养液的3个试管中(内有倒管)，分别加入1mL 稀释度为10-5的水样。共计9管，三个稀释度。同时做空白样品：于1支试管中加入已灭菌和冷却后的10mL乳糖蛋白胨培养液，加1ml灭菌水。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。 3.1.6 观察初发酵结果
培养24h后观察和记录各试管中产酸产气（产酸的培养液会变为黄色）的情况，产酸产气的即为阳性管，并拍照。观察过程中若只见产酸不见产气的话，可轻轻拍打试管壁，产生的气体可能在小倒管内。 3.2 平板分离
3.2.1 实验器皿的包扎与灭菌
用报纸将平板分离用到的培养皿包扎好，于121℃高压灭菌20min，待冷却后使用。 3.2.2 伊红美蓝培养基的配制与灭菌
根据初发酵阳性管的数目：将一定量的伊红美蓝培养基粉末溶解于装有相应量的蒸馏水的锥形瓶中，充分混匀，塞上棉塞并用报纸包扎好，于121℃高压灭菌20min后，倾注已灭菌的平皿，待冷却凝固后使用。 3.2.3 平板划线分离
将培养24h后产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基上，置于37℃恒温箱内培养24h，挑选符合下列特征的菌落：①深紫黑色，具有金属光泽的菌落；②紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；③淡紫红色，中心色较深的菌落。 3.3 革兰氏染色
取培养24h后且具有上述特征的菌落进行革兰氏染色。
2
3.3.1 涂片
取一张洁净载玻片，用油性笔在洁净载玻片的边缘上标记，于玻片两端各滴1滴生理盐水，不要太靠近玻片边沿。分别挑取少量培养24h后且具上述特征的菌落的菌种1和菌种2于玻片两端的生理盐水中，并研磨成均匀浑浊的菌液，涂成约1cm×1cm大小的均匀薄膜，接种环灭菌后放回试管架上。 3.3.2 干燥
涂片最好在室温下自然干燥，但考虑到时间问题，我们打算将涂膜背面置火焰上方不烤手的高处加烘烤，但切勿紧靠火焰，以免将涂膜烤焦，细菌变形，染色后难以观察。 3.3.3 固定
涂片干燥后，手持玻片的一端，将载玻片的背面往返通过酒精灯火焰三次，共约2~3秒钟，注意温度不可太高，以玻片加温面触及皮肤感觉烫而尚能忍受为度。 3.3.4 初染
固定完毕且待冷却后滴加结晶紫溶液，1min后用水洗去。 3.3.5 媒染
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 3.3.6 脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直到流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 3.3.7 复染
用番红染液复染约2min，水洗。 3.3.8 镜检
干燥后用油镜观察。菌体呈蓝紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。并且拍照记录。 3.4 复发酵
3.4.1 根据初发酵阳性管的数目和培养液配方配制一定量的乳糖蛋白胨培养液，分装、灭菌等步骤同初发酵。
3.4.2 上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中(内有倒管)，每管可接种分离自同一初发酵管(瓶)的最典型菌落1-3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者(不论倒管内气体多少皆作为产气论)，即证实有大肠菌群存在。
3
3.5 计算方法
本次接种的水样量是10-3、10-4和10-5 mL/管，浓度较低，需要先查陶雪琴老师等编的环境微生物学实验指导书（第二版）32页的表6-8求得MPN指数，再经下面公式换算成每100mL的MPN值。
MPN=MPN×10（mL）/接种量最大的一管（mL）
4 实验结果与分析
4.1 实验结果
实验结果见表1，表2和表3及相应注释。
表1 接种用水量
接种量（ml） 水样种类 珠江水
注:接种管的数目为3。
表2 大肠杆菌群数的结果
10-1 0 10-2 0 10-3 3 10-4 3 10-5 3 初发酵出现阳性管数 10-3mL/管 产酸（溶液变黄色）、产气
10-4mL/管 产酸（溶液变黄色，颜色较淡）、产气 10-3mL/管 复发酵出现阳性管数 10-3mL/管 10-4mL/管 10-4mL/管 产酸（溶液变产酸（溶液变产酸（溶液变产酸（溶液变黄色）、产气 黄色）、产气 黄色）、产气 黄色）、产气 根据复发酵阳性管数计算1L水样中大肠杆菌群数： 7×105 (个/L) 计算过程：先查陶雪琴老师等编的环境微生物学实验指导书（第二版）32页的表6-8求得MPN指数为7，则MPN=(7×10/10-4)/0.1=7×105 (个/L) 4.2 实验结果的分析
若用最新版的《地面水环境质量标准》（GB 3838-2002）中的粪大肠杆菌群（个／L）标准近似判断（此版本没有总大肠菌群该指标）。本实验总大肠杆菌群7×105 (个/L)
4
为≥40000，因此判断本次珠江水样属于Ⅴ类。
若用旧版的《地面水环境质量标准》（GB 3838-88）中总大肠菌群（个／L）标准来判断，该标准只有说明总大肠菌群（个／L）≤10000的水体水质为Ⅲ类水，所以只能说明本次珠江水样不是Ⅰ类和Ⅱ类水。
表3 平板分离和革兰氏染色结果描述
平 板 分 编 离 号 来自哪个初发酵管？ 肉眼观察 显微镜观察 革兰氏染色结果 （阴性、阳性） （菌种形态、颜色） （菌体形态、颜色） 深紫黑色，具有金1 10-3 属光泽；圆形、凸起 鲜红色、杆状 阴性 2 10 -3紫黑色，不带金属；圆形、平扁 深紫黑色，具有金暗红色、杆状 阴性 3 10 -4属光泽；圆形、凸起 鲜红色、杆状 阴性 4 10 -4紫黑色，不带金属；圆形、平扁 紫红色、杆状 阴性 5 思考题
5.1 在何种情况下用三倍浓度的乳糖蛋白胨培养基？为什么？
答：接种体积为10ml时，试管内应装入有3倍浓度乳糖蛋白胨培养液5ml。 原因是保证在接种完水样之后，其浓度接近于单料的浓度。而单料的浓度是最适宜大肠菌群生长的。
5.2 伊红美蓝培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？ 答：商品化的伊红美蓝培养基粉末含有以下成分：蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂、氯伊红、美蓝、使用的时候按说明书规定加蒸馏水后充分混匀。
5
在检查大肠菌群时，蛋白胨提供碳源和氮源；乳糖是大肠菌群可发酵的糖类；磷酸氢二钾是缓冲剂；琼脂是培养基凝固剂；伊红和美蓝是抑菌剂和pH指示剂，可抑制革兰氏阳性菌，在酸性条件下产生沉淀，形成具有紫黑色菌落或具黑色中心的外围无色透明等特征的菌落。
5.3 为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实？
答：初发酵是样品的发酵结果，不是大肠菌群纯菌的发酵试验，有可能受其它杂菌影响判断结果。所以应通过平板分离检验是否出现典型的大肠菌群菌落，再进行革兰氏染色检验，若革兰氏染色阴性无芽孢杆菌存在，应进行复发酵证实试验，避免假阳性结果。 5.4 所有发酵管均为阴性反应时，检验结果可否报告为“零”？
答：不可以为零。因为计算总大肠菌群数的时候需要先查表求得MPN得，查表可知，所有发酵管均为阴性反应时MPN值不是零。有可能是此时的接种量未能检查出大肠菌群。 5.5用国标的方法测定一个水样的大肠菌群数和粪大肠菌群分别需要多久时间？ 答：用国标的方法测定一个水样的大肠菌群数需要72h，粪大肠菌群需要48h。 5.6 为什么在新修订《地表水环境质量标准》（GB 3838-2002）中改用粪大肠菌群指标代替总大肠菌群，而且新修订的《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）要增加粪大肠菌群这一微生物指标？
答：为了有效控制生活污水对地表水质的影响。因为已经证明用粪大肠菌群作为卫生学指标比用总大肠菌群更有代表性，粪大肠菌群只存在于温血动物的肠道中，而总大肠菌群在某些水质条件下能在水中自行繁殖，不能真实地代表水体受粪便污染的程度。目前，粪大肠菌群被认为是水体受粪便污染的最实用的指示菌。
5.7用9管法测定某水样的大肠菌群数，复发酵结果是接种量为1ml的3管均为阳性，接种量为0.1ml的3管中有2管为阳性，接种量为0.01ml的3管均为阴性，请计算该水样的总大肠菌群数。（要有计算过程）
答：先查陶雪琴老师等编的环境微生物学实验指导书（第二版）32页的表6-8求得MPN指数为93，则MPN=(93×10/1)/0.1=9300(个/L)
6 心得体会
经过这次环境微生物技能训练之后复习和巩固了之前学习过的实验技术，更注意细节了，例如之前做微生物实验都不够注意无菌操作导致实验结果有很大误差，现在时时刻刻都想着“记得要灭菌”“记得在酒精灯旁边操作”“千万不要错把水样当无菌水用”。
6
当然也有出现问题。第一，无菌水还没完全冷却就开始用来稀释水样，可能就是这个原因导致初发酵结果全部是阴性管，后来只能用别的组初发酵阳性管。第二，倒平板的时候不熟练，难以控制每只平板倒的培养基的体积都差不多，我们倒的有些多有些少，不过我们知道我们不熟练，所以多配了点培养基，趁培养基凝固前，把倒少了的平板在酒精灯旁边再倒多一点培养基。所以我觉得我们还需要多做练习，以后才能做得更规范。
我们小组只有两个人，比别的组少一个，但我们也没有比别人慢一拍，没有做得比别人差，所以我们两个的默契起关键作用，同时谢谢在别的组的舍友空余时间帮我们忙。
7
7 附图
10-3
10
-3
10-4
产酸产气 产酸产气
2 1
图1 初发酵阳性管 图2 10mL/管的初发酵阳性管的伊红美蓝
培养基上的典型大肠菌群菌落
-3
10-4
1 2
图3 10mL/管的初发酵阳性管的伊红美蓝培养基 图4来自10mL/管的初发酵阳性管的
上的典型大肠菌群菌落 1号菌的革兰氏染色结果
-4
-3
8
-3
-4
图5 来自10mL/管的初发酵阳性管的 图6 来自10mL/管的初发酵阳性管的
2号菌的革兰氏染色结果 1号菌的革兰氏染色结果
10-4 10-3 10-4 10-3
产酸产气 产酸产气 产酸产气 产酸产气
图7 来自10mL/管的初发酵阳性管的 图6 复发酵结果
2号菌的革兰氏染色结果
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