2 北方药学2014年第11卷第11期 H PLC法测定苦豆草药材中生物碱的含量△ 陈海燕 冷晓红 郭鸿雁 郭 超(宁夏职业技术学院银川750021) 摘要:目的:建立苦豆草药材中生物碱含量的测定方法。方法:采用HPLC法测定,色谱柱为Agilent TC—C (2)(250mmx46mm, 5 m);流动相为乙腈—Ol05mo1. 磷酸二氢钾水溶液(三乙胺2.0mUL),梯度洗脱;流速为1.0ml/min,柱温3O℃;检测波长205nm。 结果:苦豆草中主要生物碱槐定碱在O.00804mg・ml-l ̄O.2412mg・ml 范围内有良好的线性关系,回收率为99.3%,RSD为1.63%:氧 化苦参碱在O.O0808mg‘rnl~-0.2424mg‘ml 范围内有良好的线性关系,回收率为99.4%,RSD为1.82%。结论:该方法简便易行、结 .果准确、可靠,重复性好,可用于苦豆草中生物碱的定量分析方法。 关键词:HPLC苦豆草生物碱 中图分类号:R927.2 文献标识码:A 文章编号:1672—8351(2014)11—0002—02 Abstract:Objective Establish a method Sophora medicinal alkaloid content.Methods by HPLC column was Agilent Zorbax SB—Cl8 column【250mmx4.6m 5lxm);mobile phase of acetonitrile一0.05mol・L potassium dihydrogen phosphate(triethylamine 2.0ml/L)。 gradient elution off;flow 1.Oml/min,column temperature was 30 ̄C;detection wavelength of 205nm.Results The main alkaloid sophoridine a good linear relationship。ml~~0.2412mg‘ml range of 0.00804mg,recovery was 99_3%,RSD was 1.63%;Oxymatrine at 0.00808mg・ ml~~0.2424mg‘ml~has a good linear relationship within the range of recovery was 99-4%.RSD was 1.82%.Conclusion The method is simple,accurate,reproducible and can be used for quantitative analysis of alkaloid methods. Key words:HPLC Sophora Alkaloids 苦豆草为豆科槐属植物苦豆子(Sophora alopecuroides L.) 浓氨水为分析纯,超纯水实验室自制,苦豆草药材分别购于宁夏 的地上干燥全草,主要分布于我国西北各省区,为一种药用植 盐池、青海西宁、甘肃酒泉、陕西定边、内蒙古阿左旗、,经鉴 物,野生资源很丰富,其植物体中含有20多种生物碱l1】,以槐定 定为苦豆子的地上干燥全草,粉碎后,过二号筛,备用。 碱、氧化苦参碱等为主,具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫,提 高机体免疫功能等作用日。经药理学研究证明氧化苦参碱抗乙 型肝炎病毒效果显著口1,槐定碱抗肿瘤作用明显 ,其产品苦参 素注射液、苦参素胶囊、槐定碱注射液等已应用于临床。但目前 2方法与结果 2.1色谱条件:色谱柱Agilent TC—C】8(2)(250mmx4.6ram,5txm, 美捷司);流动相:乙腈—0.05nml・L。。磷酸二氢钾水溶 液(三乙胺2.0ml/L);梯度洗脱:0~12min,乙腈6%~1O%,12~ 我国尚无苦豆草药材的国家质量标准,本实验在相关研究的基 45min,乙腈10%;检测波长:205nm;流速:1.0ml/min;进样量 础上[5-9],采用HPLC法测定了宁夏、青海、甘肃、陕西、内蒙古、新 10txL,柱温30 ̄C。 疆六个主产区苦豆草中槐定碱和氧化苦参碱的含量,以期为建 2.2对照品溶液的制备:精密称取槐定碱、氧化苦参碱对照品适 立苦豆草药材质量标准提供参考依据。 量,置于10ml量瓶中,加甲醇溶解并定容,摇匀,得质量浓度约 1仪器与试药 为lmg・ml 的混合对照品溶液,作为储备液。 1.1仪器:Agilent 1220高效液相色谱仪(美捷司,二元 2.3供试品溶液的制备:取各产地苦豆草细粉各约0.50g,精密 精密加入30ml甲醇,lml浓氨水,密塞, 泵,自动进样器,DAD紫外检测器);XS105十万分之一电子天 称定,置具塞锥形瓶中,平(Mettler Toledo设备上海有限公司);AS3120超声波清洗器 称定重量,放置室温浸润12h后,超声处理30min,放冷至室温, (220V,120W)天津奥德赛恩斯仪器有限公司;FW135型粉碎机 再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,过滤,取续滤液,过 0.451xm微孔滤膜,得供试品溶液。 (天津泰斯特仪器有限公司)。 1.2试药:槐定碱对照品(批号110784—200804,供含量测定用), 2.4系统性试验:分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各 氧化苦参碱对照品(批号l10780—201007,供含量测定用)均购 101 ̄L,按“2.1”项下色谱条件进样,记录色谱图,见图l。在本色 自中国药品生物制品检定所;乙腈、甲醇为色谱纯,磷酸二氢钾、 谱条件下,槐定碱、氧化苦参碱和其他生物碱可达到基线分离, 学纯度合格。 2结果与讨论 2008.32(7):326—327. I4】刘昭文,吴龙火,王恩军.苯甲酸阿格列汀的合成[J】.海峡药学, 214—215. 综上所述,阿格列汀的光学纯度完全取决于(R)一3一氨基哌 2011(9):啶的光学纯度,在制备阿格列汀时,只要严格控制(R)一3-氨基 [5】时春娟.HPLC法测定苯甲酸阿格列汀片的含量【JJ.中国药房, 3521—3522. 哌啶的光学纯度即可。因此,我们通过研究对(R)一3一氨基哌啶 2013(37):的光学纯度和阿格列汀的光学纯度之间建立起关系,以期达到 『6]For method of determin ingex—vivoDPP一4 inhibition in plasma, Villhauer,E.B.;Brinkman,J.A.;Nadefi,G.B.;Burkey,B.F.;Dun- 通过控制(R)一3-氨基哌啶的光学纯度即可使苯甲酸阿格列汀 see:E.;Kapa,P.;Mangold,B.L.;Russell,M.E.;Hughes,T.E.1 一 的光学纯度符合要求(不得过0.5%),从而提高了合成的效率。 ning,B.此方法操作简单易行,控制苯甲酸阿格列汀光学纯度合格较为 Il(3-Hydroxy-1-adamanty1)amino]acety1]-2一cyano一(S)-pyrro— 可靠,适合工业化生产时运用。 参考文献 lidine:Apotent,selective,and orally bioavailable dipeptidyl pepti— dase IV inhibitor with antihyperglycemic properties.J.Med.Chem. 2003,46:2774—2789. 『11张淑芳.治疗糖尿病的新药NESINA获批在日本上市【JJ.中国 执业药师,2010,12(16):54. 【7】Gwahney,S.L.,II;Staforfd,J.A.Inhibitors of dipeptidyl peptidase 4.Annn.Rep.Med.Chem.2005.40:149—165. 『21周英红,黄文龙,张惠斌,等.GLP一1受体激动剂及DDP—IV抑 [81武田药品工业株式会社.包含阿格列汀和盐酸二甲双胍的固 制剂的研究进展IJI.中国药科大学学报,2008,39(5):385—391. 『31王珊,范呜.抗2型糖尿病药物Alogliptin fJ1.药学进展, 卉0【P].中国专并4:10801351 A,2010—08一l1. 北方药学2014年第11卷第11期 3 分离度均大于1.5,具有良好的分离效果,理论板数各色谱峰均 RSD为1.82%。 在7000以上,同时空白试验表明无溶剂干扰。 2.10样品测定:取6个产地样品,每个产地3份,每份约0.50g, 峋 B—供试品 h 0 C一溶剂空白 图1 HPLC图(1一槐定碱2一氧化苦参碱) Fig.1 HPLC of mixed reference substances(A)。sample(B)。 solvent blank(C)1-Sophoridine 2-Oxymatrine 2.5线性关系考察:精密吸取每毫升含槐定碱0.804mg、氧化苦 参碱0.808mg的混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0ml,置于lOml量瓶中,用甲醇溶解定容至刻度,摇匀,过 0.45txm微孔滤膜,按“2.1”项下色谱条件依次进样,记录色谱峰 面积。以峰面积为纵坐标(Y),对照品质量浓度为横坐标(x),绘 制标准曲线,进行线性回归。得槐定碱回归方程Y=20015.88x一 27.95178,r=O.9993;氧化苦参碱回归方程Y=20059.40x一2.58521, r=O.9998。结果表明,槐定碱在0.00804mg・m1-1 ̄0.2412mg・ml一 呈良好的线性关系,氧化苦参碱在0.O0808mg・m1-1-0.2424mg・ mI 呈良好的线性关系。 2.6精密度试验:取混合对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件重复 进样6次,进样量lOlxL,以混合对照品溶液峰面积进行计算,槐 定碱和氧化苦参碱峰面积的RSD分别为0.54%和0.31%,表明 仪器精密度良好。 2.7重复性试验:取同一批次宁夏产苦豆草粉末约0.50g,平行 精密称定6份,按“2.3”项下制备,按“2.1”项下色谱条件测定,测 得槐定碱和氧化苦参碱峰面积的RSD分别为0.67%和0.46%。 2.8稳定性试验:取同一批次宁夏产苦豆草供试品溶液,分别在 0、2、4、6、8h进样,结果槐定碱峰面积的RSD为0.61%,氧化苦 参碱峰面积的RSD为0.28%,表明供试品溶液在8h内稳定,见 图2。 苦豆草生物碱稳定性 15o0 峰1000 面 积500 _●_槐定碱 -'0 41-氧化苦参碱 Oh 2h 4h 6h 8h 时阃(h) 图2苦豆草生物碱稳定性 Fig.2 Alkaloids from Sophora alopeeuroids stability 2.9加样回收率试验:取已测定的苦豆草药材(宁夏产)粉末6 份,每份约0.25g,精密称定后置于lOOml具塞锥形瓶中,加浓氨 水lml、甲醇30ml,每份样品分别精密加入槐定碱、氧化苦参碱 对照品,约与供试品中所含成分量比例为1:1,再按“2.3”项下方 法操作,制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,结果平均 回收率槐定碱为99.3%,RSD为1.63%;氧化苦参碱为99.4%, 精密称定,按供试品溶液的制备方法制备,进高效液相色谱仪按 本文色谱条件测定,以外标法计算样品中槐定碱和氧化苦参碱 的含量,结果见表1。 表1苦豆草药材中槐定碱和氧化苦参碱含量(n=3) Table 1 Sophoridine,Oxymatrine content in Radix Sophora alopeeuroids(n=3) 3讨论 样品测定选取6个产地的苦豆草药材,从两种生物碱总和 来看,仅甘肃酒泉产地的含量偏低,其他产地并无显著差别。本 实验做了以下分析研究: 3.1流动相选择:以乙腈—0.05mol・L- 磷酸二氢钾水溶液不同梯 度洗脱系统进样,结果显示,流动相系统在0min~12min~45min, 乙腈采用6%~10%~10%的比例洗脱,各生物碱可实现基线良好 分离,且分离度大于1.5。经实验对比发现将2ml三乙胺加入 O.05tool・L- 磷酸二氢钾水溶液,可使各色谱峰的峰形尖锐、峰形 对称。 3.2提取方法选择:选用超声方法提取生物碱可增加生物碱的提 取率,缩短提取时间。 3-3提取溶剂选择:苦豆草中的生物碱为弱碱,具有一定的水溶 性,通过甲醇、乙醇和纯水溶解样品进样,结果显示,纯水溶解的 样品因有水溶性物质,杂峰较多,对色谱峰的分离造成干扰;而 甲醇和乙醇溶解的样品其色谱峰的峰形对称性和分离度均较 好,但在205nm波长处乙醇比甲醇有较多吸收,故选用甲醇作 溶剂溶解样品效果最好。 参考文献 [1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科技出版社,1986: 1293. 【2]杨家新,喻志芳.苦豆子的研究进展IJ1.天津药学,1998,10(1): 43—46. [3】陈小松,王国俊,蔡雄,等.氧化苦参碱对乙型肝炎病毒转基因 小鼠乙肝抗原表达的影响[J】.第二军医大学学报,1999,20(10): 746—748. [4]李雪梅,李兰珍,陈绍励,等.槐果碱对动物肿瘤的抑制作用【Jj. 中国药理学报,1984,5(2):125—130. 『5]李凯,王银兰,朱会琴.HPLC法测定苦豆子总碱中3种生物碱 的含量叽西北药学杂志,2004,19(2):53—54. [6】李艳艳,等.苦豆子化学成分及其生物活性研究进展[J】.西北农 业学报,2005,14(2):133—136. [7]田箐,范欣戎,李晓东,等.HPLC法定性定量分析苦豆草药材 中多个生物碱成分[J】.药物分析杂志,2010,30(5):810—813. 【8】马玲,王俊卿,田杰,等.HPLC同时测定苦豆草中7种生物碱 的含量[J].中国中药杂志,2011,36(11):1483—1486. [9】冷晓红,马玲,王俊卿.不同物候期苦豆草中主要生物碱量的 动态变化研究fJ1.中草药,2011,42(10):2110—2113. △基金项目:科技部国家科技支撑项目f编号2011BAIO5B04),苦 豆子药材及提取物质量标准研究和生产过程标准研究。