２ 北方药学２０１４年第１１卷第１１期 Ｈ ＰＬＣ法测定苦豆草药材中生物碱的含量△ 陈海燕 冷晓红 郭鸿雁 郭 超（宁夏职业技术学院银川７５００２１） 摘要：目的：建立苦豆草药材中生物碱含量的测定方法。方法：采用ＨＰＬＣ法测定，色谱柱为Ａｇｉｌｅｎｔ ＴＣ—Ｃ （２）（２５０ｍｍｘ４６ｍｍ， ５ ｍ）；流动相为乙腈—Ｏｌ０５ｍｏ１． 磷酸二氢钾水溶液（三乙胺２．０ｍＵＬ），梯度洗脱；流速为１．０ｍｌ／ｍｉｎ，柱温３Ｏ℃；检测波长２０５ｎｍ。 结果：苦豆草中主要生物碱槐定碱在Ｏ．００８０４ｍｇ・ｍｌ－ｌ￣Ｏ．２４１２ｍｇ・ｍｌ 范围内有良好的线性关系，回收率为９９．３％，ＲＳＤ为１．６３％：氧 化苦参碱在Ｏ．Ｏ０８０８ｍｇ‘ｒｎｌ～－０．２４２４ｍｇ‘ｍｌ 范围内有良好的线性关系，回收率为９９．４％，ＲＳＤ为１．８２％。结论：该方法简便易行、结 ．果准确、可靠，重复性好，可用于苦豆草中生物碱的定量分析方法。 关键词：ＨＰＬＣ苦豆草生物碱 中图分类号：Ｒ９２７．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２—８３５１（２０１４）１１—０００２—０２ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｍｅｔｈｏｄ Ｓｏｐｈｏｒａ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｌｋａｌｏｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｂｙ ＨＰＬＣ ｃｏｌｕｍｎ ｗａｓ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ—Ｃｌ８ ｃｏｌｕｍｎ【２５０ｍｍｘ４．６ｍ ５ｌｘｍ）；ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｏｆ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ一０．０５ｍｏｌ・Ｌ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ ２．０ｍｌ／Ｌ）。 ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｏｆｆ；ｆｌｏｗ １．Ｏｍｌ／ｍｉｎ，ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ３０￣Ｃ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ２０５ｎｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｍａｉｎ ａｌｋａｌｏｉｄ ｓｏｐｈｏｒｉｄｉｎｅ ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ。ｍｌ～～０．２４１２ｍｇ‘ｍｌ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．００８０４ｍｇ，ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９９＿３％，ＲＳＤ ｗａｓ １．６３％；Ｏｘｙｍａｔｒｉｎｅ ａｔ ０．００８０８ｍｇ・ ｍｌ～～０．２４２４ｍｇ‘ｍｌ～ｈａｓ ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９９－４％．ＲＳＤ ｗａｓ １．８２％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ，ａｃｃｕｒａｔｅ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｌｋａｌｏｉｄ ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＨＰＬＣ Ｓｏｐｈｏｒａ Ａｌｋａｌｏｉｄｓ 苦豆草为豆科槐属植物苦豆子（Ｓｏｐｈｏｒａ ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ Ｌ．） 浓氨水为分析纯，超纯水实验室自制，苦豆草药材分别购于宁夏 的地上干燥全草，主要分布于我国西北各省区，为一种药用植 盐池、青海西宁、甘肃酒泉、陕西定边、内蒙古阿左旗、，经鉴 物，野生资源很丰富，其植物体中含有２０多种生物碱ｌ１】，以槐定 定为苦豆子的地上干燥全草，粉碎后，过二号筛，备用。 碱、氧化苦参碱等为主，具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫，提 高机体免疫功能等作用日。经药理学研究证明氧化苦参碱抗乙 型肝炎病毒效果显著口１，槐定碱抗肿瘤作用明显 ，其产品苦参 素注射液、苦参素胶囊、槐定碱注射液等已应用于临床。但目前 ２方法与结果 ２．１色谱条件：色谱柱Ａｇｉｌｅｎｔ ＴＣ—Ｃ】８（２）（２５０ｍｍｘ４．６ｒａｍ，５ｔｘｍ， 美捷司）；流动相：乙腈—０．０５ｎｍｌ・Ｌ。。磷酸二氢钾水溶 液（三乙胺２．０ｍｌ／Ｌ）；梯度洗脱：０～１２ｍｉｎ，乙腈６％～１Ｏ％，１２～ 我国尚无苦豆草药材的国家质量标准，本实验在相关研究的基 ４５ｍｉｎ，乙腈１０％；检测波长：２０５ｎｍ；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；进样量 础上［５－９］，采用ＨＰＬＣ法测定了宁夏、青海、甘肃、陕西、内蒙古、新 １０ｔｘＬ，柱温３０￣Ｃ。 疆六个主产区苦豆草中槐定碱和氧化苦参碱的含量，以期为建 ２．２对照品溶液的制备：精密称取槐定碱、氧化苦参碱对照品适 立苦豆草药材质量标准提供参考依据。 量，置于１０ｍｌ量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得质量浓度约 １仪器与试药 为ｌｍｇ・ｍｌ 的混合对照品溶液，作为储备液。 １．１仪器：Ａｇｉｌｅｎｔ １２２０高效液相色谱仪（美捷司，二元 ２．３供试品溶液的制备：取各产地苦豆草细粉各约０．５０ｇ，精密 精密加入３０ｍｌ甲醇，ｌｍｌ浓氨水，密塞， 泵，自动进样器，ＤＡＤ紫外检测器）；ＸＳ１０５十万分之一电子天 称定，置具塞锥形瓶中，平（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ设备上海有限公司）；ＡＳ３１２０超声波清洗器 称定重量，放置室温浸润１２ｈ后，超声处理３０ｍｉｎ，放冷至室温， （２２０Ｖ，１２０Ｗ）天津奥德赛恩斯仪器有限公司；ＦＷ１３５型粉碎机 再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，过 ０．４５１ｘｍ微孔滤膜，得供试品溶液。 （天津泰斯特仪器有限公司）。 １．２试药：槐定碱对照品（批号１１０７８４—２００８０４，供含量测定用）， ２．４系统性试验：分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各 氧化苦参碱对照品（批号ｌ１０７８０—２０１００７，供含量测定用）均购 １０１￣Ｌ，按“２．１”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图ｌ。在本色 自中国药品生物制品检定所；乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸二氢钾、 谱条件下，槐定碱、氧化苦参碱和其他生物碱可达到基线分离， 学纯度合格。 ２结果与讨论 ２００８．３２（７）：３２６—３２７． Ｉ４】刘昭文，吴龙火，王恩军．苯甲酸阿格列汀的合成［Ｊ】．海峡药学， ２１４—２１５． 综上所述，阿格列汀的光学纯度完全取决于（Ｒ）一３一氨基哌 ２０１１（９）：啶的光学纯度，在制备阿格列汀时，只要严格控制（Ｒ）一３－氨基 ［５】时春娟．ＨＰＬＣ法测定苯甲酸阿格列汀片的含量【ＪＪ．中国药房， ３５２１—３５２２． 哌啶的光学纯度即可。因此，我们通过研究对（Ｒ）一３一氨基哌啶 ２０１３（３７）：的光学纯度和阿格列汀的光学纯度之间建立起关系，以期达到 『６］Ｆｏｒ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎ ｉｎｇｅｘ—ｖｉｖｏＤＰＰ一４ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｓｍａ， Ｖｉｌｌｈａｕｅｒ，Ｅ．Ｂ．；Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｊ．Ａ．；Ｎａｄｅｆｉ，Ｇ．Ｂ．；Ｂｕｒｋｅｙ，Ｂ．Ｆ．；Ｄｕｎ－ 通过控制（Ｒ）一３－氨基哌啶的光学纯度即可使苯甲酸阿格列汀 ｓｅｅ：Ｅ．；Ｋａｐａ，Ｐ．；Ｍａｎｇｏｌｄ，Ｂ．Ｌ．；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍ．Ｅ．；Ｈｕｇｈｅｓ，Ｔ．Ｅ．１ 一 的光学纯度符合要求（不得过０．５％），从而提高了合成的效率。 ｎｉｎｇ，Ｂ．此方法操作简单易行，控制苯甲酸阿格列汀光学纯度合格较为 Ｉｌ（３－Ｈｙｄｒｏｘｙ－１－ａｄａｍａｎｔｙ１）ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙ１］－２一ｃｙａｎｏ一（Ｓ）－ｐｙｒｒｏ— 可靠，适合工业化生产时运用。 参考文献 ｌｉｄｉｎｅ：Ａｐｏｔｅｎｔ，ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，ａｎｄ ｏｒａｌｌｙ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｌｅ ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉ— ｄａｓｅ ＩＶ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ２００３，４６：２７７４—２７８９． 『１１张淑芳．治疗糖尿病的新药ＮＥＳＩＮＡ获批在日本上市【ＪＪ．中国 执业药师，２０１０，１２（１６）：５４． 【７】Ｇｗａｈｎｅｙ，Ｓ．Ｌ．，ＩＩ；Ｓｔａｆｏｒｆｄ，Ｊ．Ａ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ４．Ａｎｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５．４０：１４９—１６５． 『２１周英红，黄文龙，张惠斌，等．ＧＬＰ一１受体激动剂及ＤＤＰ—ＩＶ抑 ［８１武田药品工业株式会社．包含阿格列汀和盐酸二甲双胍的固 制剂的研究进展ＩＪＩ．中国药科大学学报，２００８，３９（５）：３８５—３９１． 『３１王珊，范呜．抗２型糖尿病药物Ａｌｏｇｌｉｐｔｉｎ ｆＪ１．药学进展， 卉０【Ｐ］．中国专并４：１０８０１３５１ Ａ，２０１０—０８一ｌ１． 北方药学２０１４年第１１卷第１１期 ３ 分离度均大于１．５，具有良好的分离效果，理论板数各色谱峰均 ＲＳＤ为１．８２％。 在７０００以上，同时空白试验表明无溶剂干扰。 ２．１０样品测定：取６个产地样品，每个产地３份，每份约０．５０ｇ， 峋 Ｂ—供试品 ｈ ０ Ｃ一溶剂空白 图１ ＨＰＬＣ图（１一槐定碱２一氧化苦参碱） Ｆｉｇ．１ ＨＰＬＣ ｏｆ ｍｉｘｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ（Ａ）。ｓａｍｐｌｅ（Ｂ）。 ｓｏｌｖｅｎｔ ｂｌａｎｋ（Ｃ）１－Ｓｏｐｈｏｒｉｄｉｎｅ ２－Ｏｘｙｍａｔｒｉｎｅ ２．５线性关系考察：精密吸取每毫升含槐定碱０．８０４ｍｇ、氧化苦 参碱０．８０８ｍｇ的混合对照品溶液０．１、０．２、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ 和３．０ｍｌ，置于ｌＯｍｌ量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀，过 ０．４５ｔｘｍ微孔滤膜，按“２．１”项下色谱条件依次进样，记录色谱峰 面积。以峰面积为纵坐标（Ｙ），对照品质量浓度为横坐标（ｘ），绘 制标准曲线，进行线性回归。得槐定碱回归方程Ｙ＝２００１５．８８ｘ一 ２７．９５１７８，ｒ＝Ｏ．９９９３；氧化苦参碱回归方程Ｙ＝２００５９．４０ｘ一２．５８５２１， ｒ＝Ｏ．９９９８。结果表明，槐定碱在０．００８０４ｍｇ・ｍ１－１￣０．２４１２ｍｇ・ｍｌ一 呈良好的线性关系，氧化苦参碱在０．Ｏ０８０８ｍｇ・ｍ１－１－０．２４２４ｍｇ・ ｍＩ 呈良好的线性关系。 ２．６精密度试验：取混合对照品溶液，按“２．１”项下色谱条件重复 进样６次，进样量ｌＯｌｘＬ，以混合对照品溶液峰面积进行计算，槐 定碱和氧化苦参碱峰面积的ＲＳＤ分别为０．５４％和０．３１％，表明 仪器精密度良好。 ２．７重复性试验：取同一批次宁夏产苦豆草粉末约０．５０ｇ，平行 精密称定６份，按“２．３”项下制备，按“２．１”项下色谱条件测定，测 得槐定碱和氧化苦参碱峰面积的ＲＳＤ分别为０．６７％和０．４６％。 ２．８稳定性试验：取同一批次宁夏产苦豆草供试品溶液，分别在 ０、２、４、６、８ｈ进样，结果槐定碱峰面积的ＲＳＤ为０．６１％，氧化苦 参碱峰面积的ＲＳＤ为０．２８％，表明供试品溶液在８ｈ内稳定，见 图２。 苦豆草生物碱稳定性 １５ｏ０ 峰１０００ 面 积５００ ＿●＿槐定碱 －＇０ ４１－氧化苦参碱 Ｏｈ ２ｈ ４ｈ ６ｈ ８ｈ 时阃（ｈ） 图２苦豆草生物碱稳定性 Ｆｉｇ．２ Ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｓｏｐｈｏｒａ ａｌｏｐｅｅｕｒｏｉｄｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ２．９加样回收率试验：取已测定的苦豆草药材（宁夏产）粉末６ 份，每份约０．２５ｇ，精密称定后置于ｌＯＯｍｌ具塞锥形瓶中，加浓氨 水ｌｍｌ、甲醇３０ｍｌ，每份样品分别精密加入槐定碱、氧化苦参碱 对照品，约与供试品中所含成分量比例为１：１，再按“２．３”项下方 法操作，制备供试品溶液，按“２．１”项下色谱条件测定，结果平均 回收率槐定碱为９９．３％，ＲＳＤ为１．６３％；氧化苦参碱为９９．４％， 精密称定，按供试品溶液的制备方法制备，进高效液相色谱仪按 本文色谱条件测定，以外标法计算样品中槐定碱和氧化苦参碱 的含量，结果见表１。 表１苦豆草药材中槐定碱和氧化苦参碱含量（ｎ＝３） Ｔａｂｌｅ １ Ｓｏｐｈｏｒｉｄｉｎｅ，Ｏｘｙｍａｔｒｉｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ Ｒａｄｉｘ Ｓｏｐｈｏｒａ ａｌｏｐｅｅｕｒｏｉｄｓ（ｎ＝３） ３讨论 样品测定选取６个产地的苦豆草药材，从两种生物碱总和 来看，仅甘肃酒泉产地的含量偏低，其他产地并无显著差别。本 实验做了以下分析研究： ３．１流动相选择：以乙腈—０．０５ｍｏｌ・Ｌ－ 磷酸二氢钾水溶液不同梯 度洗脱系统进样，结果显示，流动相系统在０ｍｉｎ～１２ｍｉｎ～４５ｍｉｎ， 乙腈采用６％～１０％～１０％的比例洗脱，各生物碱可实现基线良好 分离，且分离度大于１．５。经实验对比发现将２ｍｌ三乙胺加入 Ｏ．０５ｔｏｏｌ・Ｌ－ 磷酸二氢钾水溶液，可使各色谱峰的峰形尖锐、峰形 对称。 ３．２提取方法选择：选用超声方法提取生物碱可增加生物碱的提 取率，缩短提取时间。 ３－３提取溶剂选择：苦豆草中的生物碱为弱碱，具有一定的水溶 性，通过甲醇、乙醇和纯水溶解样品进样，结果显示，纯水溶解的 样品因有水溶性物质，杂峰较多，对色谱峰的分离造成干扰；而 甲醇和乙醇溶解的样品其色谱峰的峰形对称性和分离度均较 好，但在２０５ｎｍ波长处乙醇比甲醇有较多吸收，故选用甲醇作 溶剂溶解样品效果最好。 参考文献 ［１］江苏新医学院．中药大辞典［Ｍ］．上海：上海科技出版社，１９８６： １２９３． 【２］杨家新，喻志芳．苦豆子的研究进展ＩＪ１．天津药学，１９９８，１０（１）： ４３—４６． ［３】陈小松，王国俊，蔡雄，等．氧化苦参碱对乙型肝炎病毒转基因 小鼠乙肝抗原表达的影响［Ｊ】．第二军医大学学报，１９９９，２０（１０）： ７４６—７４８． ［４］李雪梅，李兰珍，陈绍励，等．槐果碱对动物肿瘤的抑制作用【Ｊｊ． 中国药理学报，１９８４，５（２）：１２５—１３０． 『５］李凯，王银兰，朱会琴．ＨＰＬＣ法测定苦豆子总碱中３种生物碱 的含量叽西北药学杂志，２００４，１９（２）：５３—５４． ［６】李艳艳，等．苦豆子化学成分及其生物活性研究进展［Ｊ】．西北农 业学报，２００５，１４（２）：１３３—１３６． ［７］田箐，范欣戎，李晓东，等．ＨＰＬＣ法定性定量分析苦豆草药材 中多个生物碱成分［Ｊ】．药物分析杂志，２０１０，３０（５）：８１０—８１３． 【８】马玲，王俊卿，田杰，等．ＨＰＬＣ同时测定苦豆草中７种生物碱 的含量［Ｊ］．中国中药杂志，２０１１，３６（１１）：１４８３—１４８６． ［９】冷晓红，马玲，王俊卿．不同物候期苦豆草中主要生物碱量的 动态变化研究ｆＪ１．中草药，２０１１，４２（１０）：２１１０—２１１３． △基金项目：科技部国家科技支撑项目ｆ编号２０１１ＢＡＩＯ５Ｂ０４），苦 豆子药材及提取物质量标准研究和生产过程标准研究。
