中医研究２０１３年１１月 第２６卷 第１１期ＴＣＭ Ｒｅｓ．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１３ Ｖｏ１．２６ Ｎｏ １１ 文章编号：１００１—６９１０（２０１３）１ｌ一００７０—０３ ・药学研究・ 苦马豆中总生物碱的提取工艺研究 张 立，李能莲，舍雅莉，王雅莉，陈 丽，骆亚莉，胡树名，杨扶德 （甘肃中医学院国家中医药管理局中药生药三级科研实验室，甘肃兰州７３００００） 摘要 目的：苦马豆中总生物碱的提取工艺选择。方法：以 苦马豆为材料，通过乙醇回流提取、超声提取、水提取３种工 艺提取其中的总生物碱，并比较３种工艺的差异。结果： ３种工艺总生物碱平均得率分别为６．６４１ ９％、３．９９８ ６％、 １．３１１ ６％，在此基础上设制７５０，８５０，９５０ ｇ／Ｌ ３个乙醇浓 度，物料比１：１５，常温下进行提取得到总生物碱平均得率分 别为０．１００ ４，０．０５３ ９，０．０４４ ９。结论：７５０ ｇ／Ｌ乙醇为苦马 豆中提取总生物碱最佳方法。此为苦马豆中提取总生物碱 提供一定技术支撑。 关键词：苦马豆；总生物碱；提取工艺，药学；研究 中图分类号：Ｒ２８５ 文献标志码：Ｂ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１—６９１０．２０１３．１ １．３４ 苦马豆为豆科苦马豆属植物苦马豆Ｓｗａｉｎｓｏｎｉａ ｓａｌｓｕｌａ Ｔａｕｂｅｒｔ．的带根全草，具有补肾、固精、利水等 功效，为甘肃、宁夏、青海等地民间常用药，常被用来 治疗阳痿、遗精、白带及小便不利等，民间药物名为 “马皮泡…‘尿泡草”“铃当草”“羊卵泡”“红苦豆 子”。民间常用苦马豆素（Ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ，ＳＷ）治疗肾 炎水肿、慢性肝炎、肝硬化腹水等，具有悠久的应用 历史 。苦马豆素具有很强的抗肿瘤、抗辐射及免 疫增强活性，作为一种崭新的抗肿瘤药物，已引起了 极大关注，是当前研究的热点 。苦马豆素是从苦 马豆中提取的吲哚兹定生物碱，分子结构是吲哚兹 定环的１，２，８位上各有１个羟基，化学名为１，２，８一 羟基八氢吲哚兹定，属于醇类，又被命名为吲哚兹 定三醇。苦马豆素的提取是采用对样本酸化、碱化 后从小极性溶剂到大极性溶剂分别萃取，再经离子 交换柱或硅胶柱层析从中分离苦马豆素 。这种 方法提取周期长、步骤繁琐，有待于进一步改进。此 外，也有人工合成苦马豆素的报道 ，但方法步骤 过多、产率低、不适于批量生产。本研究在前人研究 的基础上，采用３种不同工艺提取苦马豆中总生物 碱，并比较总生物碱得率，探索一种经济简便、可用 于苦马豆素批量生产的提取分离工艺，为苦马豆素 的开发利用提供基础。 １药品与试剂 苦马豆Ｓｗａｉｎｓｏｎｉａ ｓａｌｓｕｌａ Ｔａｕｂｅｒｔ．地上部分， ２０１１年８月采集于甘肃省古浪县张家湾，由甘肃中 医学院杨扶德教授提供并鉴定。自然干燥，粉碎，阴 凉处保存备用。７５０，８５０，９５０ ｇ／Ｌ乙醇及碘化铋钾 试剂，均由利安隆博华（天津）医药化学有限公司提 供；化学试剂均为分析纯。 ２ 方 法 ２．１ 乙醇回流提取及总苦马豆碱含量测定 此为第１种工艺。准确称取苦马豆干草粉 ３份，各５ ｇ；分别经７５０，８５０，９５０ ｇ／Ｌ乙醇回流提 取３次，每次２ ｈ；水浴挥去乙醇至浸膏；２ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣ１溶解后过滤得酸水液；３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｒａｉｎ 得上清液；弃去固体杂质；用氨水调水相ｐＨ值至 ９～１０；正丁醇萃取６～８次挥去正丁醇得总生物碱， 称质量，测提取物含量。碘化铋钾试管反应为阴性 停止萃取。实验重复５次。 ２．２超声提取及总苦马豆碱含量测定 此为第２种工艺。准确称取苦马豆干草粉 ４份，各５ ｇ；分别用７５ ｍＬ自来水浸泡苦马豆草粉 １２ ｈ；置于５９ ｋＨｚ超声清洗器４５ ｃｃ，分别处理３０， ６０，９０，１２０ ｍｉｎ，重复２次，过滤得水液；水液置水浴 锅上８０℃浓缩到３０ ｍＬ后，用２ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣＬ酸化； ３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ得上清液；弃去固体杂质； 用氨水调水相ｐＨ值至９～１０；正丁醇萃取６～８次 后回收溶剂得总生物碱称质量，测提取物含量。碘 化铋钾试管反应为阴性停止萃取。实验重复５次。 ２．３ 水提取及总苦马豆碱含量测定 此为第３种工艺。准确称取苦马豆干草粉５ ｇ； 加７５ ｍＬ自来水浸泡过夜；常压下煮沸，每次１ ｈ，共 ３次，过滤得水液；煮沸浓缩到１５ ｍＬ；用２ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣ１酸化过滤得酸水液；３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ得 上清液；弃去固体杂质；最后用氨水调水相ｐＨ值至 ９～１０；正丁醇萃取６～８次后回收溶剂得总生物碱 称质量，测提取物含量。碘化铋钾试管反应为阴性 停止萃取。实验重复５次。 ３ 结 果 见表１～３。 中医研究２０１３年１１月 第２６卷 第１１期ＴＣＭ Ｒｅｓ．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１３ Ｖｏ１．２６ Ｎｏ．Ｉ１ ・７Ｉ・ 表２不同处理间方差分析 分离得到苦马豆素纯品，得率为１４．５２ Ｉ￣ｇ／ｇ。李勤 变异来源ＤＦ ＳＳ ＭＳ Ｆ 处理阃 ７ ０ ５３７ ９９４ ０ ０７６８ ５６３ ４８ ５ ２９９ ６８８ ９ 凡等 采用萃取法改进了甘肃棘豆中苦马豆素提 误差 ３２ ０ ４６４ ０６６ ０．０１４ ５０２ ０４９ 总变异 ３９ １．００２ ０６ 取工艺，但得率仅为５ ｇ／ｇ。上述方法提取周期 表３不同处理间差异显著性 长、步骤繁琐，实验成本高。 本次研究在条件相同的情况下，比较了乙醇回 流、超声处理法和水煮法３种提取工艺对苦马豆中 总生物碱得率的影响。水煮法在３种工艺中消耗成 本最低，但苦马豆素总碱得率最低，且它要求物质的 亲水性和热稳定性高，在萃取的过程中乳化现象严 重，需要正丁醇萃取液长时间加热或静置离心以消 除乳化现象，不适于批量生产。用超声提取中，将植 物样品经水浸泡后采用超声技术处理（３０，６０，９０， １２０ ｒａｉｎ） ，但总碱得率较低，也不适于苦马豆素 总碱的批量生产。３种提取工艺中，乙醇回流提取中 总碱平均得率高于其他两种工艺，其中７５０ ｇ／Ｌ％乙 注：ｌ司列中不ｌ司小写罕母代表差异性显著，ｌ司列中不同大写字母代 醇得率最高，周期短、易于操作，试验中的溶剂回收 表差异性极显著。 后可以重复利用，是目前提取苦马豆素的一种最为 通过表１～３结果分析：提取工艺１，２，３的总生物 简便经济的工艺。游离的生物碱及生物碱盐都能溶 碱平均得率分别是６．６４１ ９％、３．９９８ ６％、１．３１１ ６％。 于甲醇和乙醇，虽然甲醇的沸点低于乙醇且极性比 ７５０ ｇ／Ｌ乙醇回流提取总生物碱平均得率最高，与 乙醇大，对生物碱盐类的溶解性强于乙醇，但甲醇对 其他处理方法比较总生物碱平均得率差异显著及极 人体的毒害较大、价格高于乙醇，故本实验使用乙醇 显著（Ｐ＜０．０１）；８５０ ｇ／Ｌ乙醇与超声６０ ｍｉｎ、水煮 作为溶剂。乙醇质量浓度设计在７５０～９５０ ｇ／Ｌ，是 处理间具有显著差异（Ｐ＜０．０５）。８５０ ｇ／Ｌ乙醇提 因为苦马豆中生物碱种类较多，仅使用水或乙醇做 取的出膏率平行５次试验，差别较大，分析原因可能 溶剂不能完全提取，且苦马豆为草本植物，材料的吸 是工艺的可重复性较差，同时８５０ ｇ／Ｌ乙醇提取的 湿性比较强，所以选择的物料比较大，在第一次浸提 成分较为黏稠，对生物碱纯化不利。 时加量较多。此与陈绍淑 、赵宝玉 的报道一 ４讨 论 致。在提取过程中发现：９５０ ｇ／Ｌ乙醇提取的成分 苦马豆Ｓｗａｉｎｓｏｎｉａ ｓａｌｓｕｌａ Ｔａｕｂｅｒｔ．为豆科苦马 中所含色素多，测定生物碱之前需用石油醚除掉色 豆属植物，在我国其资源丰富，对其提取物苦马豆素 素；８５０ ｇ／Ｌ乙醇提取的成分较为黏稠，对生物碱纯 药用价值的发掘和研究方兴未艾。Ｃｏｌｅｇａｔｅ等 首 化不利；７５０ ｇ／Ｌ乙醇提取的成分数量较少，颜色 次分离苦马豆素是用热乙酸乙酯索氏提取２４ ｈ，水 淡。由此可见，如果需要色素可使用９５０ ｇ／Ｌ乙醇 溶部分上强酸性阳离子交换柱，收集稀氨水洗脱部 做提取溶剂；如果节约成本，可使用７５０ ｇ／Ｌ乙醇做 分，浓缩后的残留物过药用琼脂糖凝胶柱，回收溶剂 提取溶剂。同时苦马豆素为大极性生物碱，根据相 后重结晶，最后得到白色针状结晶。葛鹏斌等 分 似相溶的原理，本研究在提取过程中对植物样品经 别从茎直黄芪和小花棘豆中分离出苦马豆素。童德 酸化、碱化处理后，直接使用了大极性的正丁醇对碱 文等 通过升华法和高效液相色谱从甘肃棘豆中 水液中生物碱进行萃取，省去了常规先使用氯仿、乙 ・７２・ 中医研究２０１３年１１月 第２６卷 第１１期ＴＣＭ Ｒｅｓ．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１３ Ｖｏ１．２６ Ｎｏ．１１ 酸乙酯等小中极性溶剂反复萃取的步骤。 参考文献： 马豆素研究初报［Ｊ］．中国农学通报，２００５，２１（５）：１４３— １４５． ［１］甘肃省卫生局．甘肃中草药手册［Ｍ］．兰州：甘肃人民出 版社，１９７３：１５１２． ［９］赵俊，童德文，税媛媛，等．甘肃棘豆草中苦马豆素的提 取分离工艺比较研究［Ｊ］．西北植物学报，２００６，２６（７）： １４５９—１４６３． ［２］杨扶德，罗文蓉，林丽，等．苦马豆的生药学研究［Ｊ］．中 医药学刊，２００３，２１（９）：１５８７—１５８８． ［１０］王铮敏．超声波在植物有效成分提取中的应用［Ｊ］．三 明高等专科学校学报，２００２，１９（４）：４５—５３． ［１１］郭孝武，吉晓芹．杜仲叶中总黄酮物质超声提取的研 究［Ｊ］．西北植物学报，２００３，２３（１１）：１９８４—１９８７． ［１２］申金龙，孙良顺，李峰，等．钩藤中总生物碱提取丁艺研 究［Ｊ］．安徽农业科学，２０１０，３８（１）：３５８—３７５． ［１３］陈绍淑．小花棘豆生物碱系统分析及其活性研究［Ｄ］． 杨凌：西北农林科技大学，２００３． ［３］吴旭锦，杨呜琦，白春黎，等．苦马豆素的来源及分离方 法进展［Ｊ］．动物医学进展，２００５，２６（５）：４１—４４． ［４］Ｇｅｒｒｅｓ Ｈｅｉｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｄｉｒｋ Ｒａａｔｚ，Ｏｌｉｖｅｒ Ｒｅｉｓｅｒ．Ｓｔｅｒｅｏｓｅ— ｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｙｒｉｄｉｎｅｓ『Ｊ］．Ｔｅｔｒａ— ｈｅｄｒｏｎ，２００５，６１：６４３—６５５． ［５］Ｃｏｌｅｇａｔｅ ＳＭ，Ｄｏｒｌｉｎｇ ＰＲ，Ｈｕｘｔａｂｌｅ ＣＲ．Ａ ｐｅｅｔｒｏｓｅｏｐｉｃｉｎｖｅｓ— ｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ：ａｎ ａ－ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒｆｏｍ Ｓｗａｉｎｓｏｎｉａ ｅａｎｅｃｅｎｓ［Ｊ］．Ａｕｓｔ Ｊ Ｃｈｅｍ，１９７９，３２：２２５７— ２２６４． ［１４］赵宝玉．疯草中生物碱系统分析及其毒性的比较病理 学研究［Ｄ］．杨凌：西北农林科技大学，２００１． 通信作者：杨扶德，教授，ｇｓｚｙｙｆｄ＠１６３．ｅｏｍ 基金项目：甘肃中医学院中青年科研基金（编号０９ＺＱ一 １１） ［６］葛鹏斌，赵宝玉，童德文，等．小花棘豆中苦马豆素的提 取分离与结构鉴定［Ｊ］．中国农学通报，２００３，１９（１）：１— ３． ［７］童德文，曹光荣，李绍君．甘肃棘豆中苦马豆素的分离与 鉴定［Ｊ］．西北农林科技大学学报，２００１，２９（３）：５—８． ［８］李勤凡，王建华，刘志斌，等．萃取法提取甘肃棘豆中的苦 收稿日期：２０１３—０２—１１；修回日期：２０１３—０５—１３ （编辑 陶 珠） 文章编号：１００１—６９１０（２０１３）１１—００７２—０４ ・药学研究・ ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ同时测定清开灵注射液中胆酸和猪去氧胆酸 李桂本 ，刘珊珊 ，李振国 （１．河南省食品药品检验所，河南郑州４５０００３；２．河南中医学院，河南郑州４５０００８） 摘要 目的：采用ＨＰＬＣ—Ｅ１ ＳＤ同时测定清开灵注射液中胆酸 和猪去氧胆酸的含量，为清开灵注射液多指标质量控制奠定基 础。方法：采用Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ—Ｃ｝８（４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ ｍ）柱， 或提取物配伍而成的纯中药注射剂…，具有清热解 毒、化痰通络、醒神开窍之功效，广泛应用于内、外、 妇、儿各科，尤其是上呼吸道感染性疾病及中枢神 经系统疾病，并已成为了中药急症抢救常用药 物 。现代药理研究表明，清开灵注射液具有解 热、镇静、抗病毒、抗菌作用 ，其中胆酸类成分是 发挥药效最重要的有效成分，具有对抗全氟异丁烯 所致肺水肿等作用 。胆酸的测定方法主要有薄 流动相甲醇一乙腈一】ｇ／Ｌ甲酸溶液（６８：４：２８），体积流量 １ ｍＬ／ｍｉｎ，载气流量２．０ Ｌ／ｍｉｎ，柱温３５℃，漂移管温度８５℃。 结果：胆酸和猪去氧胆酸分别在０．２５１ ４～２．５１４ ０ ｇ（ｒ＝ ０．９９９ ６），０．２１６ ４～２．１６４ ０ Ｉｘｇ（ｒ＝０．９９９ ５）范围内呈良好的 线性关系，平均回收率分别为９９．８２％（ＲＳＤ＝２．５７％）， ９９．１４％（ＲＳＤ＝２．５ｌ％）。结论：方法简便、快速、准确，可为 评价该药胆酸类成分的含量提供依据。 层扫描法 、高效液相色谱一紫外检测法（ＨＰＬＣ・ ｕＶ） 等。本文采用高效液相色谱一蒸发光散射 检测法（ＨＰＬＣ．ＥＬＳＤ）同时测定清开灵注射液中胆 关键词：清开灵注射液／药效学；ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ；胆酸；猪去氧 胆酸 中图分类号：Ｒ２８４．２ 文献标志码：Ｂ 酸、猪去氧胆酸的含量，灵敏度高，分离度好，干扰 少，对评价和控制制剂的质量具有重要意义。 １药品、试剂与仪器 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１—６９１０．２０１３．１１．３５ 清开灵注射液是在古方“安宫牛黄丸”基础上 拆方改制，由胆酸、猪去氧胆酸、黄芩苷、水牛角 （粉）、珍珠母（粉）、栀子、板蓝根、金银花８味药材 清开灵注射液（批号１２０９１５０３，１２０９１６０４， １２１００１０１），河南神农制药厂产品。胆酸、猪去氧胆
