《中国医学创新》第１１卷第２期（总第２８４ ）２０１４￣１月 医学综合Ｙｉｘｕｅｚｏｎｇｈｅ ｐ７３基因在成人急性淋巴细胞白血病中表达的研究 俞罡① 【摘要】目的：研究ｐ７３基因在急性淋巴细胞性白血病（ＡＬＬ）发病机制中的作用及临床意义。 方法：收集３２例ＡＬＬ患者及３０例正 常对照组骨髓样本，ＤＮＡ和ＲＮＡ抽提后用ＲＴ—ＰＣＲ检测ｐ７３基因的表达、甲基化特异性ＰＣＲ（ＭＳＰ）检测ｐ７３基因第一外显子甲基化状态， 并结合临床资料进行分析。结果：１１例ｐ７３基因阴性表达，阴性表达率为３４．３８％，其中９例第一外显子区域均发生甲基化（８１．８２％）；２１ 例ｐ７３基因阳性表达，３２例ＡＬＬ患者中，仅ｌ例发生甲基化（４．７６％）；正常对照组３０例，均为ｐ７３基因阳性表达，阳性表达率为１００％。 ｐ７３基因的阴性表达与ＡＬＬ患者的高年龄（≥６０岁）、高白细胞数（≥３０×１０９／Ｌ）及对治疗时间延长（＞４周取得完全缓解）有关。结论： ｐ７３基因异常表达与成人ＡＬＬ的发病机制有关，具有一定的诊断及判断预后的价值；其甲基化可能是ｐ７３基因在ＡＬＬ中表达沉默的主要机制。 Ｉ关键词】ｐ７３基因； 急性淋巴细胞白血病 Ａｂｎｏｒｍａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ７３ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ／ＹＵ Ｇａｎｇｄ／Ｍｅｄｉｃａｉ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ。２０１４．１１（０２）： １２１－１２２ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐ７３ ｇｅｎｅ ｏｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＡＬＬ）ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｃｅ ｏｆ ａｂｎｏｒｍａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ７３ ｇｅｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｇｅｎｏｍｉｅ ＤＮＡ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ３２ ＡＬＬ ａｎｄ ３０ ｎｏｒｍａｌ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ７３ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ（ＭＳＰ）ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｐ７３ ｇｅｎｅ ｅｘｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｏｆ ３２ ＡＬＬ ｓａｍｐｌｅｓ，１１ ｓｈｏｗｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｐ７３ ｍＲＮＡ，ｗｉｔｈ ａｎｅｇａｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ３４．３８％．Ｎｏｒｍａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ａｌｌｈａｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｐ７３ ｇｅｎｅ，ｗｉｔｈ ａｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ １００％．９ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ７３ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｈａｖｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ７３ ｇｅｎｅ，ｗｈｅｒｅａｓ ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ７３ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｈａｖｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ７３ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ａｇｅ（≥６０ ｙｅａｒｓ ｏｌｄ），ｈｉｇｈｅｒ ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ ｃｏｕｎｔ（≥３０×１０９／Ｌ） ａｎｄ ｄｅｌａｙｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｙ（ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｔｔａｉｎｅｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ４ ｗｅｅｋｓ）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ７３ ｇｅｎｅ ｐｒｏｂａｂｌｙ ｐｌａｙｓ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＡＬＬ，ａｎｄ ｍｉｇｈｔ ｈａｖｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｃｅ ｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｉｔｓ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｍａｙ ｂｅ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｅ ｏｆ ｐ７３ ｉｎ ＡＬＬ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】ｐ７３ Ｇｅｎｅ；Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｆｉｒｓｔ－ａｕｔｈｏｒ’ｓ ａｄｄｒｅｓｓ：Ｇｕｉｄｏｎｇ Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｗｕｚｈｏｕ ５４３００１，Ｃｈｉｎａ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４—４９８５．２０１４．０２．０５７ 急性淋巴细胞白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＡＬＬ） 是造血系统恶性疾病之一，其病死率高 】。因此，期望通过 精准有效的分子生物学方法检测相关基因的改变，以探究白 血病发病机制和治疗方法成为热门课题。ｐ７３基因是ｐ５３基 因家族的一个新成员，具备抑癌基因的特性ｆ２］。本文通过试 验研究ＡＬＬ中ｐ７３基因ｍＲＮＡ表达情况及其甲基化状态， 总ＲＮＡ。骨髓标本采用离心柱法及时提取ＤＮＡ。所有引物 由上海生物工程公司合成。 １．２．２ ｐ７３基因表达分析ＲＴ－ＰＣＲ检测ｐ７３基因ｍＲＮＡ的表 达。提取的总ＲＮＡ用ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒（美国Ｇｉｂｃｏ公司）按 说明书合成ｃＤＮＡ。ｐ７３引物序列：上游５’一ＡＧＣＧＧＡＡＴＩ＂ ＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣｃ１ ３’，下游５’一ＣＣＡＧＧＣＴＣ １ｗＣＡＧＣＴＹＣＡ一３’， 以及其和临床关系，探讨ｐ７３基因在ＡＬＬ发病机制中的作 用及其异常表达的临床意义。 １资料与方法 产物３９０ ｂｐ。取１ ＬｃＤＮＡ，以ｐ—ａｃｔｉｎ为内参，ＲＴ—ＰＣＲ 扩增ｐ７３基因片段，产物长度为１６６ ｂｐ。ＰＣＲ反应条件为 ９４ ３０ ｓ、６０℃３０ ｓ、７２ ４５ ｓ，３０个循环。ＰＣＲ产物用 凝胶电泳分离。 １．１ 一般资料（１）ＡＬＬ组患者：２０１２年１月一２０１３年３ 月在本院收治的初发ＡＬＬ患者３２例，男１７例，女１５例， 年龄１８～７４岁。参照２００８年ＷＨＯ诊断标准，所有患者均 经临床、骨髓细胞形态及染色体学、病理学、白血病免疫分 型确诊。（２）对照组：收集同期非白血病患者３０例，骨髓 学均正常，为对照组。两组年龄性别等一般资料比较差异均 无统计学意义（Ｐ＞０．０５），具有可比性。 １．２方法 １．２－３ 甲基化特异性聚合酶链反应（ＭＳ—ＰＣＲ）取２ ｇ 基因组ＤＮＡ，采用ＤＮＡ甲基化试剂盒进行重亚硫酸盐 修饰并纯化。根据ｐ７３基因第一外显子ＣｐＧ岛序列特 征设计甲基化特异性引物ｐ７３一ＭＦ、ｐ７３一ＭＲ和非甲基 化特异性引物ｐ７３一ＵＦ、ｐ７３一ＵＲ。引物序列ｐ７３一ＭＦ： ５’一ＧＧＡＣＧＴＡＧＣＧＡＡＡＴＣＧＧＧＧＴＴＣ一３’：ｐ７３一ＭＲ： ５’一ＡＣＣＣＣＧＡＡＣＡＴＣＧＡＣＧＴＣＣＧ一３’：ｐ７３一ＵＦ：５’一 １．２．１标本采集化疗前，无菌条件下抽取ＡＬＬ组及对照 ＡＧＧＧＧＡＴＧＴＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＧＧＴＴＴ一３’：ｐ７３一ＵＲ：５’一 组患者骨髓各４ ｍＬ，Ｔｒｉｚｏｌ（美国Ｇｉｂｃｏ公司）一步法提取 ①广西桂东人民医院通信作者：俞罡 Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ Ｖｏ１．１ １，Ｎｏ．２ Ｊａｎ。２０１ ４ ＡＴｃＡｃＡＡＣｃｃｃＡＡＡｃＡＴＣＡＡｃＡＴｃＣＡ一３’，行甲基化特异性 ＰＣＲ（ＭＳＰ），ＰＣＲ产物用凝胶电泳分离，ＭＳＰ产物大小分 广西梧州５４３００１ 别是６８ ｂｐ和７７ｂｐ。 ｌ－３统计学处理采用ＳＰＳＳ １３．０软件行统计学分析，计数 一１２１— 医学综合Ｙｉｘｕｅｚｏｎｇｈｅ 《中国医学创新》第１１卷第２期（总第２８４￣］）２０１４ １月 资料采用 检验，等级／频数资料用ｚ检验，以Ｐ＜０．０５为 差异有统计学意义。 ２结果 阻，作为抑癌基因的ｐ７３基因在肿瘤的发病中占有重要的地 位，具有可抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞发生凋亡的特 性。国外大量临床研究发现，ｐ７３基因在人类肿瘤中极少发 ＡＬＬ组ｐ７３基 ２．１两组ｐ７３基因ｍＲＮＡ的检测结果比较生突变，在多种人类肿瘤中有不同水平表达的现象 】。该基 因与多种肿瘤的发生、发展和预后有一定相关性＿６】。本研 究结果发现，成人ＡＬＬ存在较高比例的ｐ７３ ｍＲＮＡ阴性表 因阴性表达率为３４．３８％，阳性表达率为６５．６２％，对照组阳 性表达率为１００％，两组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１ ｏ 见表１。 表１ 两组ｐ７３基因ＲＴ－ＰＣＲ检测结果比较 例（％） ２．２ ｐ７３基因甲基化检测结果比较ＡＬＬ组共有１１位ｐ７３ 基因阴性表达患者，其中９例在第一外显子区域发生甲基化， 而阳性表达组的２１例患者中只有１例发生甲基化，两组比 较差异有统计学意义（Ｐ＜０．Ｏ１）。见表２。 表２ ｐ７３基因甲基化检测结果比较 例（％） ２－３ ｐ７３基因阴性表达与ＡＬＬ患者临床指标的关系ｐ７３基因 阴性表达与患者年龄、化疗前白细胞总数（ＷＢＣ）和治疗反 应时间均相关。＜６０岁者、初诊ＷＢＣ＜３０×１０９／Ｌ者、化疗≤４ 周缓解者的ｐ７３基因阴性表达率分别为２０．８３％、１８．１８％、 １５．００％，均显著低于≥６０岁者、初诊ＷＢＣ≥３０×１０９／Ｌ者、 ＞４周ＣＲ者的７５．００％、７０．００％、６６．６７％，比较差异均有统 计学意义（Ｐ＜０．０１ ｏ ｐ７３基因阴性表达与性别无关，男性患 者阴性表达率为３５．２９％，女性为３３．３３％，比较差异无统计 学意义（Ｐ＞０．０５ ｏ见表３。 表３ Ｄ７３基因阴性表达与临床指标的关系 ３讨论 ｐ７３基因是ｐ５３基因家族中发现的一个新成员，是一个 新的抑癌基因，由１３个外显子和１２个内含子组成［３Ｊ。其检 测的基因序列与ｐ５３具有高度的同源性，也具有调控细胞正 常生长，诱导细胞周期阻滞和凋亡，参与ＤＮＡ损伤的修复 作用 ］。肿瘤发生发展的本质在于细胞的生长与凋亡之间的 动态平衡状态被打破，从而导致细胞过度生长，凋亡抑制受 一１２２一 达，表明ｐ７３基因的缺失与成人ＡＬＬ的发病机制有着紧密 的联系。 由于ｐ７３基因在人类肿瘤突变率极低，ｐ７３基因缺失 的原因成为目前研究的重点，国外研究发现ｐ７３基因可以 通过甲基化而失表达，从而诱导肿瘤的发生及发展【７ １。本 研究表明，在ＡＬＬ患者ｐ７３基因阴性表达组中共１１位患 者，其中９例第一外显子区域均发生甲基化，甲基化几率为 ８１．８２％，而阳性表达组的２１例患者仅１例发生甲基化，这 表明第一外显子甲基化是ｐ７３基因缺失的主要机制。 同时，本试验通过临床研究发现，ｐ７３基因阴性表达与 患者性别无关，与患者年龄、化疗前白细胞总数、对化疗的 反应等临床指标有关，因而，可将ｐ７３基因阴性表达作为预 后判断的指标之一。 总之，随着研究的进一步深入，未来可以通过检测ｐ７３ 基因的基因表达情况及甲基化状态，作为临床诊断ＡＬＬ的 依据及预后判断的指标，为临床ＡＬＬ的治疗方案提供新思路。 参考文献 Ｉ１】张辉，莫武宁，杨峥，等．ＷＷＯＸ和ｐ７３基因在急性淋巴细胞白血 病中表达的研究ｍ．中华检验医学杂志，２０１２，３５（９）：８２０－８２５． ｆ２】刘壮，张义堂，吴香苓，等．Ｐ７３基因在儿童急性淋巴细胞白血 病的表达【ｊ１＿临床儿科杂志，２０１０，２８（５）：４１０．４１３． ［３】Ｄｅｎｅｂｅｒｇ Ｓ，Ｇｒｏｖｄａｌ Ｍ，Ｋａｒｉｍｉ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｉｆｅ ａｎｄ ｇｌｏｂａｌ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ［Ｊ］．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０１０，２４（４）：９３２－９４１． 】Ｋｉｍ Ｍ，Ｙｉｍ Ｓ Ｈ，Ｃｈｏ Ｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＫＮ２Ａ （ｐ１６。ｐ１４）ａｎｄ ＣＤＫＮ２Ｂ（ｐ１５）ｇｅｎｅｓ ｉｓ ａ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ Ｂ—ｌｉｎｅａｇｅ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ： ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ，２００９，１９５（１）：５９－６５． 【５】Ｂｅｎｉｔｅｓ Ｂ Ｄ，Ｆａｔｔｏｒｉ Ａ，Ｈａｅｋｅｌ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｗ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＰＡＦ一１ ＸＬ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｍａｙ ｂｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆａｉｌｕｒｅ ｏｆ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ，２００８，４１（７）： ５７１—５７８． ［６］Ｖｉｏｌｅｔｔａ Ｂ，Ｐａｕｌｏ Ｓ，Ｅｒｉｃ Ｃ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ａｌｌｅｌｉｃ ｌｏｓｓｅｓ ａｔ ｌｐ３６ ａｎｄ １９ｑ１３ ｉｎ ｇｌｉｏｍ ａｓ：ｃｏｒｅｒｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｃｌａｓｓｉｉｆｃａｔｉｏｎ，ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ １ ５０一ｋｂ ｍｉｎｉｍａｌ ｄｅｌｅｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｎ ｌ ｐ３６，ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＡＭＴＡ１ ａｓ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００５，１１（３）：１１１９—１１２８． ［７】何勇，童玲，范土志，等．ｐ７３基因与人类肿瘤的研究进展［Ｊ］．肿 瘤防治杂志，２００５，１２（７）：５５１—５５４． 【８】Ｓａｔｏ Ｈ，Ｏｋａ Ｔ，Ｓｈｉｎｎｏｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ，Ｍｕｈｉ－ｓｔｅｐ ａｂｅｒｒａｎｔ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ ｈｙｐｅｒ—ｍｅｔｈｙｌａｔｉ０ｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ Ｔ—ｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２０１０，１７６（１）：４Ｏ２—４１５． （收稿日期：２０１３—０７—２２）（本文编辑：黄新珍） ＭｅｄｉｃａＩｌｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｃｈｉｎａ Ｖｏ１．１ １，Ｎｏ．２ Ｊａｎ，２０１４
