・ｌＯ・ 匿垫苤查 ！！生 第 卷舅１期Ｍｅｄ＆Ｐｈａｒｍ Ｊ Ｃｈｉｎ ＰＬＡ，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．１，Ｊａｎ．２０１７ ・论著・ 高糖对原代人脐静脉内皮细胞的损伤作用及机制研究 哈小琴，王 娟，白燕青，徐 倩，曹荟哲，曾通旭，杨志华 ［摘要］ 目的观察高浓度葡萄糖对原代人脐静脉内皮细胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅ１１，ＨＵＶＥＣｓ）的 分别用低浓度葡萄糖（ＬＧ组，５．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）和高浓度葡萄糖（ＨＧ组，３５ ｍｍｏ１／ 损伤作用，并探讨其损伤机制。方法Ｌ）培养基培养ＨＵＶＥＣｓ ２４、７２、１２０ ｈ，胆囊收缩素八肽（ＣＣＫ一８）检测高糖对ＨＵＶＥＣｓ存活率影响，荧光探针检测细胞 活性氧（ＲＯＳ）、一氧化氮（ＮＯ）水平，蛋白免疫印迹检测Ｂａｘ、Ｂｃｌ一２、沉默信息调节因子１（ｓｉｌｅｎｔ ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ２ ｈｏｍｏｌｏｇ １，ＳＩＲＴ１）和一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）的表达。结果ＨＧ组处理７２、１２０ ｈ细胞存活率、Ｂｃ１．２均低于 ＬＧ组，ＲＯＳ水平、Ｂａｘ和Ｂａｘ／Ｂｃｌ一２高于ＬＧ组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。ＨＧ组处理ＨＵＶＥＣｓ ２４、７２、１２０ ｈ ＳＩＲＴ１和ＮＯ相对含量低于ＬＧ组，处理７２、１２０ ｈ ｅＮＯＳ低于ＬＧ组（Ｐ＜０．０５）。结论 高糖可使ＨＵＶＥＣｓ存活率下 降，增强细胞内氧化应激反应，提高Ｂａｘ／Ｂｃｌ－２比值，可能与抑制ＳＩＲＴ１一ｅＮＯＳ通路使ＮＯ生成减少有关。 ［关键词］ 人脐静脉内皮细胞；一氧化氮；高糖；沉默信息调节因子１ 【中国图书资料分类号］ Ｒ５８７．１ ［文献标志码］ Ａ ［文章编号］ ２０９５ １４０Ｘ（２０１７）Ｏ１－００１０－０５ ［ＤＯＩ］ １０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５—１４０Ｘ．２０１７．０１．００３ Ｉｎｊｕｒｙ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｎ Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＵＶＥＣｓ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ＨＡ Ｘｉａｏ—ｑｉｎ ，ＷＡＮＧ Ｊｕａｎ‘・ ，ＢＡＩ Ｙａｎ．ｑｉｎｇ’ＸＵ Ｑｉａｎ ，ＣＡＯ Ｈｕｉ．ｚｈｅ ，ＺＥＮＧ Ｔｏｎｇ—ｘｕ ，ＹＡＮＧ Ｚｈｉ—ｈｕａ （１．Ｄｅ． ，ｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｌａｎｚｈｏｕ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ａｒｅａ Ｃｏｍｍａｎｄ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００５０，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｕｙｅ Ｃｏｕｎｔｙ Ｐｅｏｐｌｅ￣Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｕｙｅ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２７４９００，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｉｎｊｕｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ（ＨＵＶＥＣｓ）ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｊｕｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＨＵＶＥＣｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ（ＬＧ，５ ５ ｍｍｏｌ／Ｌ）ａｎｄ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ（ＨＧ，３５ ｍｍｏｌ／Ｌ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｆｏｒ ２４ ｈ，７２ ｈ ａｎｄ １２０ ｈ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＨＧ ｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ＨＵＶＥＣｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ一８（ＣＣＫ一８）ａｓｓａｙ， ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ）ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ（ＮＯ）ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｅｘｐｒｅｓ— ｓｉｏｎｓ ｏｆ ＨＧ ｏｎ Ｂａｘ，Ｂｃｌ一２，ｓｉｌｅｎｔ ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ２ ｈｏｍｏｌｏｇ １（ＳＩＲＴ１）ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｅＮＯＳ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎ ＨＧ ｇｒｏｕｐ，ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｆｏｒ ７２ ｈ ａｎｄ １ ２０ ｈ．ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ａｎｄ Ｂｃ１．２ ｗｅｒｅ ｌｏｗｅｒ．ｗｈｉｌｅ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ＲＯＳ ａｎｄ Ｂａｘ／Ｂｃｌ一２ ｒａｔｉｏ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ＬＧ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）；ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｏｒｆ ２４ ｈ，７２ ｈ ａｎｄ １２０ ｈ，ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ＳＩＲＴ１，ａｎｄ ｅＮＯＳ ｗｅｒｅ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ＬＧ ｇｒｏｕｐ：ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｏｒｆ ７２ ｈ ａｎｄ １２０ ｈ．ｅＮＯＳ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ＬＧ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＨＧ ｍａｙ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ。ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｉｍｐｒｏｖｅ Ｂａｘ／Ｂｃｌ一２ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＨＵＶＥＣｓ．ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｂｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＳＩＲＴ１．ｅＮＯＳ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ＮＯ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ；ＮＯ；Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ；Ｓｉｌｅｎｔ ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａ— ｔｉｏｎ ２ ｈｏｍｏｌｏｇ １ 糖尿病血管并发症是糖尿病患者致死致残的主 症的发生、发展密切相关，高糖所致的血管内皮功能 障碍是糖尿病血管并发症的始发因素和病理生理基 要原因，其病理生理机制包括：高血糖、高游离脂肪 酸、胰岛素抵抗、一氧化氮（ＮＯ）生成减少利用度降 低、炎性反应、氧化应激增强、糖基化终产物累积、血 管平滑肌细胞功能障碍等。其中高血糖与血管并发 ［基金项目］ 国家自然科学基金（８１２７３５６８） ［作者单位］７３００５０兰州，兰州军区兰州总医院检验科（哈 础¨训。因此，研究高糖状态下血管内皮细胞损伤 机制对糖尿病血管并发症的防治尤为重要。本文以 原代人脐静脉内皮细胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏ— ｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ，ＨＵＶＥＣｓ）为细胞模型，通过检测高糖对 细胞活性氧（ＲＯＳ）、ＮＯ产生、凋亡相关蛋白，以及 沉默信息调节因子１（ｓｉｌｅｎｔ ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ２ ｈｏｍｏｌｏｇ １，ＳＩＲＴ１）和内皮型一氧化氮合 小琴、王娟、白燕青、徐倩、曹荟哲、曾通旭、杨志华）；２７４９００ 山东巨野，巨野县人民医院检验科（王娟） ［通讯作者］ 哈小琴，Ｅ—ｍａｉｌ：ｈａｘｉａｏｑｉｎ２０１３＠１６３．ｃｏｒｎ 酶（ｅＮＯＳ）表达的影响，探究高糖诱导血管内皮细胞 损伤机制。 医药杂盎２０１７生１月筮 鲞筮 塑 ！ 鱼 １材料和方法 ： ！： 竺： ： ：』 ： Ｑ ！ ： ： １．３．２ ＣＣＫ．８检测高糖对ＨＵＶＥＣｓ存活率的影响： 取第３—５代细胞，调整细胞浓度为３×１０ 个／ｍｌ， 经兰州军区兰州总医院伦理学委 １．１标本来源接种于９６孔板。将细胞分为低糖组（ＬＧ组）与高 糖组（ＨＧ组），每组设４个复孑Ｌ，待细胞融合至 ５０％，将ＬＧ组和ＨＧ组分别以葡萄糖浓度为５．５和 ３５ ｒｎｍｏｌ／Ｌ的ＥＣＭ换液，分别处理２４、７２、１２０ ｈ。 员会批准，产妇知情同意，无菌留取新鲜脐带１根 （６ ｈ内，约１５ ａｍ）。术前四项（乙型肝炎、丙型肝 炎、艾滋病、梅毒）检测阴性，置于装有５０ ｍｌ无菌 ＰＢＳ的广口瓶内，立即进行ＨＵＶＥＣｓ分离培养。 处理结束后，ＨＧ组每孔加入１０ ｔｘｌ ＣＣＫ一８溶液， ３７％培养箱孵育２ ｈ，用酶标仪测定４５０ ｌｌｍ处吸光 １．２主要材料及仪器设备 内皮细胞培养基（ｅｌｌ— ｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉｕｍ，ＥＣＭ）、内皮细胞生长因子 （ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，ＥＣＧＳ）购于美国 Ｓｉｃｉｅｎｃｅｌｌ公司，胎牛血清、Ⅱ型胶原蛋白酶购于美 国ＧＩＢＣＯ公司，４５％葡萄糖液购于美国Ｓｉｇｍａ公 司，ＣＤ３１、ＣＤ３４荧光抗体购于美国ＢＤ公司，胆囊收 缩素八肽（ＣＣＫ．８）试剂购于日本同仁化学研究所， ＲＯＳ、ＮＯ荧光探针购于江苏碧云天生物技术有限公 司，小鼠抗人ｅＮＯＳ单克隆抗体、兔抗人Ｂａｘ单克隆 抗体、兔抗人Ｂｃ１．２单克隆抗体、小鼠抗人Ｂ—Ａｃｔｉｎ 单克隆抗体购于美国Ａｂｃａｍ公司，兔抗人ＳＩＲＴ１单 克隆抗体购于美国Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ公司，小鼠抗兔 ＩｇＧ、山羊抗小鼠ＩｇＧ购于中杉金桥公司，细胞培养 瓶、培养皿及９６孔板购于美国Ｃｏｍｉｎｇ公司。流式 细胞分析仪（ＢＤ公司，美国），全自动凝胶成像分析 仪（ＵＶＩｔｅｅ Ｃｏｎｐａｎｙ，英国），ＩＮＣ１５３型ＣＯ２培养箱 （美墨尔科技公司，德国），电泳仪和自动酶标仪 （Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司，美国）。 Ｉ．３试验方法 １．３．１原代ＨＵＶＥＣｓ的分离、培养、鉴定：采用酶 消化法分离ＨＵＶＥＣｓ，无菌条件下留取长约１５ ａｍ 新鲜脐带（６ ｈ之内）１根，无菌ＰＢＳ冲洗脐带表面 至无血污。将脐带两端用大剪刀修剪平整，找到脐 静脉，插入灭菌的不锈钢灌胃针头，注射器抽取 ３７℃无菌ＰＢＳ冲洗至液体变为无色。向静脉内注 入约５ ｍｌ １％的Ⅱ型胶原蛋白酶并用血管钳夹闭脐 带两端，３７℃水浴１０～１５ ｒａｉｎ，期间轻轻揉搓脐带外 表面促使内皮细胞脱落。将脐带一端沿血管钳剪断 收集消化液于无菌培养皿内，并向脐静脉内注入约 １０ ｍｌ ＰＢＳ冲洗，将冲洗液也收集到培养皿内。将培 养皿内细胞悬液转移至离心管内１０００ ｒ／ｒａｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，弃上清，加入到含５ ｍｌ ＥＣＭ完全培养基（含 １％ＥＣＧＳ和５％ＦＢＳ）的一次性细胞培养瓶内， ３７℃５％ＣＯ 饱和湿度细胞培养箱培养。２４ ｈ后观 察细胞形态并换液，细胞融合７０％～８０％时，按１： ４进行传代培养。细胞传代培养至第３代，消化细 胞，ＣＤ３１荧光抗体避光染色３０ ｒａｉｎ，流式细胞仪检 测阳性细胞百分率。 度值，计算细胞存活率。细胞存活率（％）＝ＨＧ组 ＯＤ值／ＬＧ组ＯＤ值×１００％。 １．３．３荧光探针检测ＨＵＶＥＣｓ细胞内ＲＯＳ和ＮＯ 含量：以１×１０ 个／孔种６孔板，细胞融合５０％后， 将细胞分为ＬＧ组与ＨＧ组，处理２４、７２、１２０ ｈ后， 消化细胞，ＰＢＳ洗涤２次，分别用１：１０００稀释的 ＲＯＳ荧光探针和ＮＯ荧光探针染色２０ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗 涤３次，用３００ Ｉｘｌ ＰＢＳ重悬细胞，以４９５ ｎｍ为激发 波长５１５ ｎｍ为发射波长，流式细胞仪检测细胞荧光 效率。 １．３．４蛋白免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）检测高糖对 ＨＵＶＥＣｓ Ｂａｘ、Ｂｃ１．２、ＳＩＲＴ１和ｅＮＯＳ蛋白表达影响： 将细胞分为ＬＧ组、高糖处理２４ ｈ组（ＨＧ－２４ ｈ组）、 高糖处理７２ ｈ组（ＨＧ．７２ ｈ组）和高糖处理１２０ ｈ组 （ＨＧ－１２０ ｈ组）。细胞处理结束后，ＰＢＳ冲洗２次， 甩干，每瓶细胞内加入１００ ｔｚｌ蛋白裂解液（１ ｍｌ裂 解液中含有１０ Ｉ浓度为１００ ｍｍｏｌ／Ｌ的苯甲基碘 酰氟化物溶液），冰上裂解３０ ｍｉｎ。用细胞刮刀将 裂解液刮至细胞瓶一角，转移至ＥＰ管内，离心取上 清进行蛋白定量。按５０ Ｉｘｇ／￣Ｌ蛋白量上样，进行 ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，电泳结束后，将目的蛋白和Ｂ．Ａｃ． ｔｉｎ蛋白所在区带电转移至纤维素膜上。５％脱 脂奶粉封闭２ ｈ，４℃一抗稀释液（Ｂ—Ａｃｔｉｎ：１：２０００； Ｂａｘ：１：２０００；Ｂｃｌ一２：１：２０００；ＳＩＲＴ１：１：１０００； ｅＮＯＳ：１：１０００）孵育过夜。加入１：５０００稀释的酶 标二抗，室温孵育２ ｈ。电化学发光（ＥＣＬ）超敏发光 液显色，曝光。分析目的蛋白条带灰度值，并计算目 的蛋白相对表达量，目的蛋白相对表达量＝目的蛋 白灰度值／１３一Ａｃｔｉｎ灰度值。 １．４统计学方法 应用ＳＰＳＳ ２１．０软件进行统计 学分析，计量资料以均数±标准差（ ．４－ｓ）表示，多组 间比较采用单因素方差分析，两两比较采用ｔ检验， ０【＝０．０５为差异有统计学意义。 ２ 结果 ２．１原代ＨＵＶＥＣｓ的形态学观察及鉴定 细胞培 养至２４ ｈ镜下可观察到短梭形贴壁细胞，围绕单个 医药杂志２０１７年１月第２９卷第１期Ｍｅｄ Ｐｈａｒ Ｃ ： ： ！』ａｎ． Ｑ ！ ： ： ３讨论 ＨＵＶＥＣｓ是研究糖尿病血管内皮细胞损伤体外 实验最常用的细胞模型，主要有原代ＨＵＶＥＣｓ和 ＨＵＶＥＣｓ细胞株两种。ＨＵＶＥＣｓ细胞株种类较多， 包括ＨＵＶＥＣｓ－Ｃ、ＨＵＶＥＣｓ一１２、ＥＡ．ＨＹ９２６等，多为 端粒永生化或与癌细胞杂交所得，培养要求低，可以 无限传代。相对于细胞株原代ＨＵＶＥＣｓ ｖＷＦ因子 分泌表达量高，电镜观察内皮细胞特异性Ｗｅｂｅｌ－ Ｐａｌａｄｅ小体多，具有更好的内皮生物学特性，但分离 培养要求高且有杂细胞 。ＨＵＶＥＣｓ原代培养的方 法有组织块移植法、机械刮取法和酶消化法，其中酶 消化法应用最为普遍 。胶原蛋白酶相较于胰酶 作用温和，对细胞损害小且掌握好消化时间所得杂 细胞也较少。本研究采用Ⅱ型胶原蛋白酶３７℃消 化１５～２０ ｍｉｎ，ＣＤ３１细胞阳性率达９９．６４％。除此 之外，培养基的选择对原代ＨＵＶＥＣｓ的培养尤为重 要，本实验采用内皮细胞培养基，加入１％的ＥＣＧＳ， 细胞状态良好可稳定传代。因此，Ⅱ型胶原蛋白酶 消化联合ＥＣＭ培养可迅速获得大量原代ＨＵＶＥＣｓ， 是良好的原代ＨＵＶＥＣｓ来源。 血管内皮细胞结构和功能的完整性是保障正常 血液循环的基础。正常情况下，内皮细胞除具有屏 障作用外还可通过分泌多种生物活性因子（如ＮＯ、 前列环素）发挥调节血流量和血管张力的作用。糖 尿病时高血糖、氧化应激增强、游离脂肪酸升高，胰 岛素抵抗均可导致内皮细胞功能障碍。而高血糖所 致的内皮细胞功能障碍是糖尿病血管病变的始发因 素和病理生理学基础 ，因此研究高糖状态下血 管内皮细胞的损伤机制对糖尿病血管病变的防治至 关重要。本研究结果显示，ＨＧ组处理７２、１２０ ｈ ＨＵＶＥＣｓ存活率均低于ＬＧ组，ＲＯＳ水平高于ＬＧ 组，提示高浓度葡萄糖可使ＨＵＶＥＣｓ存活率降低， 提高细胞内ＲＯＳ水平。 Ｂｃｌ一２蛋白家族在多种细胞凋亡通路的调节中 起着至关重要的作用，Ｂｃｌ一２和Ｂａｘ是Ｂｃ１．２蛋白家 族最重要的组成部分，分别起到抑制细胞凋亡和促 进细胞凋亡的作用 。本研究结果显示，ＨＧ组处 理７２、１２０ ｈ Ｂｃｌ一２低于ＬＧ组，Ｂａｘ和Ｂａｘ／Ｂｃ１．２均 高于ＬＧ组，提示高糖可以促进Ｂａｘ表达并抑制Ｂｃｌ一 ２表达，使Ｂａｘ／Ｂｃｌ一２比值增大，ＨＵＶＥＣｓ凋亡增加。 ＳＩＲＴ１是Ｓｉｒｔｕｉｎ家族成员，可以通过对组蛋白 去乙酰化，影响细胞转录，参与多种细胞代谢调 节 。。 。在血管系统￣ＩＲＴ１与血管生成及维护血管 内皮细胞稳态密切相关¨ 。 。２型糖尿病患者内皮 祖细胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ，ＥＰＣｓ）减少与 ＳＩＲＴ１蛋白水平下调相关¨ ，上调ＳＩＲＴ１表达可以 减少ＥＰＣｓ自噬诱导的凋亡，防止ＥＰＣｓ衰老和分化 障碍，促进内皮细胞损伤修复 ” 。近期研究表 明，ＳＩＲＴ１可以通过ＰＤ—Ｋｉｎａｓｅ／ＡＫＴ信号通路增加 ｅＮＯＳ表达并增强胰岛素敏感性改善细胞功 能 。在内皮细胞中Ｌ．精氨酸通过ｅＮＯＳ转化为 ＮＯ和瓜氨酸。ＮＯ作为内皮依赖性血管舒张因子， 具有降低血小板聚集，抑制白细胞黏附，防止单核细 胞趋化，血管平滑肌细胞增殖的功能 。正 常情况下，内皮依赖性血管舒张因子与内皮依赖性 血管收缩因子间的平衡对控制局部血管张力和功能 至关重要。高糖时ＮＯ分泌减少、ＲＯＳ升高，ＮＯ生 物利用度降低，促使血管痉挛，加速血管并发症进 程。本研究结果显示，ＨＧ组处理ＨＵＶＥＣｓ ２４、７２、 １２０ ｈ ＳＩＲＴ１和ＮＯ相对含量低于ＬＧ组，处理７２、 １２０ ｈ ｅＮＯＳ低于ＬＧ组。提示高浓度葡萄糖可以通 过抑制ＳＩＲＴ１．ｅＮＯＳ轴，降低细胞内ＮＯ水平。 综上所述，高糖可使ＨＵＶＥＣｓ存活率降低，其 机制与细胞内ＲＯＳ水平和Ｂａｘ／Ｂｃｌ一２比值升高导致 的细胞凋亡增加以及ＳＩＲＴ１。ｅＮＯＳ通路被抑制，ＮＯ 生成减少有关。但高糖通过何种机制抑制ＳＩＲＴｔ， 以及ＳＩＲＴ１如何抑制ｅＮＯＳ的活性都有待进一步 研究 ［参考文献】 ［１］ Ｃａｂａｌｌｅｒｏ Ａ Ｅ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ ｉｎ— ｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ａ ｒｏａｄ ｔｏ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ『Ｊ］． Ｏｂｅｓ Ｒｅｓ，２００３，１１（１１）：１２７８—１２８９． ［２］Ｔａｂｉｔ Ｃ Ｅ，Ｃｈｕｎｇ Ｗ Ｂ，Ｈａｍｂｕｒｇ Ｎ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉ— ａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｏｒｄ， ２０１０，１１（１）：６１－７４． ［３］ 李慧，李秀娟，古力热巴・夏依买旦，等．ＥＡ．ＨＹ９２６人 脐静脉内皮细胞株与原代细胞生物特性的比较研究 ［Ｊ］．医科大学学报，２０１４，３７（１）：３６—３９． ［４］ Ｋａｄａｍ Ｓ Ｓ，Ｔｉｗａｒｉ Ｓ，Ｂｈｏｎｄｅ Ｒ Ｒ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｉｓｏｌａ． ｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ『Ｊ］．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏ Ａｎｉｍ，２００９，４５（１—２）：２３—２７． ［５］ ｘｕ Ｊ，Ｚｏｕ Ｍ Ｈ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒ— ｇｅｔｓ ｆｏｒ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ２００９，１２０（１３）：１２６６—１２８６． ［６］Ｐｏｂｅｒ Ｊ Ｓ，Ｍｉｎ Ｗ，Ｂｒａｄｌｅｙ Ｊ Ｒ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅ－ ｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｉｎｊｕｒｙ，ａｎｄ ｄｅａｔｈ［Ｊ］．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐａｔｈｏｌ， ２００９，４：７１－９５． ［７］ Ｒｅｅｄ Ｊ Ｃ．Ｂｃｌ－２：ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｓ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ・１４・ 匡垫苤壹 ！ １月第２９卷第１期Ｍｅｄ＆Ｐｈａｒｍ Ｊ Ｃｈｉｎ ＰＬＡ，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．１，Ｊａｎ．２０１７ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｒｅｓ，２０１５，６１（３）：Ｉ８７—１９７． ｚ－Ｋａｓｓａｉ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ ［１６］ Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｘａｖｉｅｒ Ｓ，Ｍｏｓｋｏｗｉｔｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｉｒｔｕｉｎ １ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｍｅｄｉ— ｏｆ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ， １９９５，９（２）：４５１－４７３． ［８］ Ｂｒａｄｙ Ｈ Ｊ，Ｇｉｌ—Ｇ６ｍｅｚ Ｇ．Ｔｈｅ ｐｒｏ—ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｂｃ１．２ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ，Ｂａｘ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９８，３０ （６）：６４７－６５０． ａｔｅｓ ｓｔｒｅｓｓ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２０１２，１８０（３）：９７３—９８３． ６ Ｃ Ａ，Ｓｈｂａｔ Ｌ，Ｍａｒｃｈｅｓｉ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｍｔｈｆｒ ｄｅｆｔ— ［１７］ Ｌｅｍａｒｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｖｉａ ［９］Ｃｈｏｎｇ Ｚ Ｚ，Ｓｈａｎｇ Ｙ Ｃ，Ｗａｎｇ Ｓ，ｅｔ ａ１．ＳＩＲＴ１：ｎｅｗ ａｖｅｎｕｅｓ ｏｆ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｆｏｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ，２０１２，１６（２）：１６７－１７８． ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｅＮＯＳ ａｎｄ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＩＲＴ１［Ｊ］． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１１，３００（３）：Ｈ７４５一 Ｈ７５３． ［１Ｏ］Ｏｂｌｏｎｇ Ｊ Ｅ．Ｔｈｅ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＮＡＤ＋／ｎｉｃｏｔｉｎａｍ． ｉｄｅ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ ｉｎ ｓｋｉｎ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ，ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔ— ｉｃｓ，ａｎｄ ａｇｉｎｇ［Ｊ］．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ），２０１４，２３：５９— ６３． ａ１．Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ［１８］ Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｆｅｎｇ Ｘ，Ｗｕ Ｊ，ｅｔｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ Ｏｌｌ ｄａｍａｇｅｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ［１１］Ｐａｔｅｌ Ｓ Ａ，Ｖｅｌｉｎｇｋａａｒ Ｎ Ｓ，Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ Ｒ Ｖ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ— ｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｂｙ ｔｈｅ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ ｂｙ ３－ａｍｙｌｏｉｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＩＲＴ１／ＡＫｔｌ ｐａｔｈｗａｙ ［Ｊ］．Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ，２０１４，４０（２）：２５８．２６７． ¨［１９］ Ｗ，Ｄｕ Ｄ，Ｗａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｓｉｌｅｎｔ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ［Ｊ］．Ａｎｔｉｏｘｉｄ ｒｅｄｏｘ ｓｉｇｎａｌ，２０１４，２０（１８）：２９９７—３００６． ［１２］Ｃｈｅｎ Ｚ，Ｐｅｎｇ Ｉ Ｃ，Ｃｕｉ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ，ＳＩＲＴ１， ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ２０１０，１０７（２２）：１０２６８—１０２７３． １（ＳＩＲＴ１）ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎ— ｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＰＩ３ Ｋ／ＡＫｔ／ｅＮＯＳ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ，２０１５，８ （３）：２２７４—２２８７． Ｔｓａｏ Ｐ Ｓ，ＭｃＥｖｏｙ Ｌ Ｍ，Ｄｒｅｘｌｅｒ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｎ— ［２０］ ｄｏｔｈｅｌｉａｌ ａｄｈｅｓｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ｈｙｐｅｒｃｈ０ｌｅｇｔｅｒｏｌｅｍｉａ ｉｓ ａｔｔｅｎｕａ－ ［１３］Ｂｒｅｉｔｅｎｓｔｅｉｎ Ａ，Ｗｙｓｓ Ｃ Ａ，Ｓｐｅｓｃｈａ Ｒ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｐｅｒｉｐｈ— ｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｓｉｒｔｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｎ ｐａ— ｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１３，８ （１）：ｅ５３１０６． ｔｅｄ ｂｙ Ｌ—ａｒｇｉｎｉｎｅ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９４，８９（５）：２１７６－ ２１８２． ［１４］Ｂａｌｅｓｔｒｉｅｒｉ Ｍ Ｌ，Ｓｅｒｖｉｌｌｏ Ｌ，Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｏｒ ｇｌｙ— ｃａｅｍｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｄｕｃｅｓ ｅｎｄｏ— ｈ Ｐ Ｍ，Ｈａｓｓａｌｌ Ｄ Ｇ，Ｇｌａｄｗｉｎ Ａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘ— ［２１］ Ｂａｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ．Ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ａｎｄ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ ｂｙ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ＳＩＲＴ１ ｓｉｇ— ｎａｉｌｉｎｇ ＶＩＡ ｐｌａｔｅｌｅｔ—ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２０１３，５６（１）：１６２—１７２． ［１５］Ｍａｒｔｉｎ Ａ，Ｔｅｇｌａ Ｃ Ａ，Ｃｕｄｒｉｃｉ Ｃ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｆ ＳＩＲＴ１ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒ０ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］． ［Ｊ］．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ，１９９１，１１（２）：２５４—２６０． （收稿时间：２０１６—０９—２１ 修回时间：２０１６—１０—１４） （上接５页） ２０１５，７０（８）：９５９—９６８． ｅ Ａ Ｍ，Ｎｉｌｌｎｉ Ｅ Ａ．Ｍｉｎｉｒｅｖｉｅｗ：Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｉｒｔｌ ｒｅｇｕ— ［１６］ Ｔｏｏｒｉｌａｔｅｓ ｅｎｅｒｇｙ ｂａｌａｎｃｅ ＶＩＡ ｔｈｅ ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ａｌ— ［１３］万赞，余文，陈赞，等．去乙酰化酶ＳＩＲＴ１与血管内皮 功能关系研究进展［Ｊ］．中华男科学杂志，２０１２，１８ （９）：８３１—８３４． ｔｅｒｎａｔｅ ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２０１４，２８（９）： １４２３—１４３４． ［１４］Ｋｉｔａｄａ Ｍ１，Ｋｏｙａ Ｄ．ＳＩＲＴ１ ｉｎ Ｔｙｐｅ ２ Ｄｉａｂｅｔｅｓ：Ｍｅｃｈａ— ｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ Ｊ， ２０１３，３７（５）：３１５—３２５． ａｏ Ｆ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｓ１ＲＴ１ ｍｅｄｉａｔｅｓ ［１７］ Ｇａｏ Ｚ，Ｗａｎｇ Ｈ，ＸｉＳＰＨＫ１／Ｓ１ Ｐ—－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏ・－ ［１５］Ｃｈｕｎｇ Ｋ Ｗ，Ｃｈｏｉ Ｙ Ｊ，Ｐａｒｋ Ｍ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎ－ ｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ＳＩＲＴ１ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ ＵＶＢ—Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓｋｉｎ ｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｉｌｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１６，７４：１５２— １６０． Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｂｙ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ （收稿时间：２０１６—１０—１０修回时间：２０１６—１０—３０） ａｎｄ ｐ５３ Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ Ａ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，
