第２７卷第３期 ２００６年９月 扬州大学学报（农业与生命科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｙａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏ１．２７ Ｎｏ．３ Ｓｅｐ．２００６ 应用重组杆状病毒表达的ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原 建立其抗体监测方法 许小琴 ，李迎晓 ，秦爱建 ，邵红霞 （１．扬州大学兽医学院，江苏扬州，２２５００９；２．信阳农业高等专科学校，河南信阳，４６４０００） 摘 要：应用Ｂａｃ—ｔｏ—Ｂａｃ杆状病毒表达系统表达的鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ｊｓ株ＶＰ２基因的重组杆状病毒 ｒｅＢａｃｍｉｄ—ＶＰ２蛋白，建立抗ＩＢＤＶ血清抗体的间接ＥＬＩＳＡ检测方法，研究ＩＢＤＶ ＶＰ２蛋白的结构与功能。结果表明：该 方法与进口试剂盒平行检测对比试验显示，其敏感性为９３．４ ，特异性为９０．９ ；对ＶＰ２亚单位疫苗免疫的血清样本 的８次重复检测，变异系数小于４ ，表明该检测方法对ＶＰ２亚单位疫苗免疫效果的监测、评价具有更高的可靠性。 关键词：鸡传染性法氏囊病病毒；ｒｅＢａｃｍｉｄ—ＶＰ２蛋白；ＥＬＩＳＡ 中图分类号：Ｓ ８５２．６５ ９．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１—４６５２（２００６）０３—０００１—０４ Ｅｓｔａｂｌ ｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ＩＢＤＶ ｕｓｉｎｇ ＶＰ２ ｏｆ ＩＢＤＶ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｕｌ ｏｖｉｒｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ＸＵ Ｘｉａｏ—ｑｉｎ ，ＬＩ Ｙｉｎｇ－ｘｉａｏ ，ＱＩＮ Ａｉ—ｊｉａｎ ，ＳＨＡＯ Ｈｏｎｇ—ｘｉａ （１．Ｃｏｉｌ ｏｆ Ｖｅｔ Ｍｅｄ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ，２２５００９，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｘｍｙａｎｇ Ａｇｒｉｃ Ｃｏｉｌ，Ｘｉｎｙａｎｇ，４６４０００，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＢＤＶ ＶＰ２ ｆｒｏｍ ＪＳ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ｔｈｅ ｒｅ— Ｂａｃｍｉｄ—ＶＰ２ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｂａｃ—ｔｏ－Ｂａｃ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｔｅｓｔ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅ－ ｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｒａ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ＩＢＤＶ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ９３．４％ａｎｄ ９０．９ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｋｉｔ ｆｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｅｒａ ｏｆ ａｎｔｉ—ＩＢＤＶ；ｔｈｅ ｄｅｃ－ ｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｃｈｉｋｅｎ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ＶＰ２ ｓｕｂ—ｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｗａｓ ｒｅｐｅａｔｅｄ ８ ｔｉｍｅｓ．ａｎｄ ｔｈｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ｌａｓｓ ｔｈａｎ ４ ．Ｉｔ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｕｒｖｅｙ ｏｒ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＶＰ２ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ，ａｎｄ ｈａｖｅ ｈｉｇｈｅｒ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｋｉｔ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：ＩＢＤＶ；ｒｅＢａｃｍｉｄ－ＶＰ２ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＬＩＳＡ 鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）为双节段ＲＮＡ病毒科双节段ＲＮＡ病毒属成员，其基因组由两个 节段双链ＲＮＡ（Ａ、Ｂ）构成。其中，Ａ片段主要编码ＶＰ２￣ＶＰ５几种蛋白，Ｂ片段主要编码ＶＰ１。有研 究［１ 认为，ＶＰ２不仅是ＩＢＤＶ的主要结构蛋白，而且是宿主主要保护性抗原，与病毒中和抗体的诱导与 识别、病毒毒力变异、病毒抗原漂变等有关。国内外许多研究人员［ｚ－９３曾利用ＶＰ２的免疫原性研究抗 ＩＢＤ的基因工程疫苗，分别在大肠杆菌、酵母、重组鸡痘病毒、重组昆虫杆状病毒、重组疱疹病毒等许多 表达系统中，都成功地表达了ＶＰ２蛋白，经动物免疫试验证实，这些表达系统表达的ＶＰ２蛋白都能诱 导机体产生较高的中和抗体，但抗ＩＢＤＶ攻击的免疫保护和保护法氏囊组织损伤的能力却不够理想。 为了进一步研究ＩＢＤＶ ＶＰ２蛋白的结构与功能，探索ＩＢＤＶ ＶＰ２重组诊断抗原在亚单位疫苗免疫 收稿日期：２００６一Ｏ５—２Ｏ 基金项目：国家高技术研究发展计划项目（８６３—２００２ＡＡ２４５０８１） 作者简介：许小琴（１９６２－－ ），男，扬州大学副教授、博士，主要从事中兽医医药科学与临床研究。 Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｕｘｉａｏｑｉｎｇｘ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ 维普资讯 http://www.cqvip.com
２ 扬州大学学报（农业与生命科学版） 第２７卷 效果监测中的应用，本研究应用Ｂａｃ—ｔｏ—Ｂａｃ杆状病毒表达系统表达的ＩＢＤＶ ｊｓ株ＶＰ２基因的重组杆状 病毒ｒｅＢａｃｍｉｄ—ＶＰ２蛋白，建立了抗ＩＢＤＶ血清抗体的间接ＥＩ ＩＳＡ检测方法，该检测方法具有特异性 强、敏感性高的特点，尤其是对ＩＢＤＶ ＶＰ２亚单位疫苗免疫血清抗体的监测更为可靠。 １材料与方法 １．１主要试剂 ＤＭＥＭ、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ、Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５ ０×）为 美国ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司产品。Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ为英国Ｏｘｏｉｄ公司产品。胎牛血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、新生牛血清为杭州四季青公司产品。青霉素、链霉素和氨苄青霉素为国内厂家生产。Ａｍｐｈｏｔｅｒ— ｉｍｙｃｉｎ Ｂ、ＩＰＴＧ、Ｘ—ｇａｌ为上海生物工程公司产品。 ＦＩＴＣ标记的羊抗鼠ＩｇＧ、ＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ和ＨＲＰ标记的兔抗鸡ＩｇＧ均为美国Ｓｉｇｍａ公司 产品；抗体ＩＢＤＶ单抗由美国禽病与肿瘤研究所惠赠；ＤＡＢ（３’，３，＿ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＯＰＤ （ｏ—ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）均为美国Ｓｉｇｍａ公司产品。 １．２试验细胞及毒株 草地贪夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）卵巢细胞Ｓｆ９由扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室（本 室）保存，培养基为ＴＮＭ—ＦＨ完全培养基（Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ，含３．３ Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，３．３ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，１０ Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，０．２５ ｇ・ｍＩ ～Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｍｙｃｉｎ Ｂ， １００ Ｕ・ｍＩ ～Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，ｉ００ ｇ・ｍＩ ～Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，用１０ ｍｏｌ・Ｉ ＮａＯＨ调ｐＨ至６．０）。 重组杆状病毒ｒｅＢａｃｍｉｄ—ＶＰ２由本课题组利用ＩＢＤＶ ｊｓ株的ＶＰ２基因构建。 １．３血清 ． 鸡血清样品３６２份，分别采自扬州大学动物医院门诊病鸡。ＩＢＤ阳性血清、鸡新城疫（ＮＤ）阳性血 清、鸡马立克氏病（ＭＤ）阳性血清、鸡减蛋综合征（ＥＤＳ）阳性血清、鸡传染性支气管炎（ＩＢ）阳性血清均为 本室保存。ＳＰＦ鸡血清采自中牧实业股分有限公司南京药械厂ＳＰＦ鸡繁殖场提供的１日龄ＳＰＦ雏鸡。 其他常规试剂均为国产分析纯产品。 １．４方法 １）重组杆状病毒表达的ＶＰ２包被抗原的制备：取Ｐ３代重组病毒ｒｅＢａｃｍｉｄ—ＶＰ２感染正常Ｓｆ９细 胞，２７‘Ｃ培养７２ ｈ后收取细胞，１２ ０００ ｒ・ｍｉｎ 离心５ ｍｉｎ，去上清，用ＰＢＳ液清洗，１２ ０００ ｒ・ｍｉｎ 离心５ ｍｉｎ，去上清，加超纯水重悬，于冰浴条件下用ＪＹ９２一Ⅱ超声波细胞粉碎仪彻底破碎细胞，装透析 袋，在４ Ｃ冰箱中用５００ ｇ・Ｉ ＿。ＰＥＧ 。。。透析浓缩至原体积的１／１０左右，以１５ ０００ ｒ・ｍｉｎ 离心 ３０ ｍｉｎ，去沉淀；上清以３５ ０００ ｒ・ｍｉｎ （４ Ｃ）离心３ ｈ，去上清；用少量ＴＮＥ（Ｏ．Ｏ１ ｍｏｌ・Ｌ～Ｔｒｉｓ， ０．１ ｍｏｌ・Ｉ ＿。ＮａＣ１，０．０１ ｍｏｌ・Ｌ—ＥＤＴＡ，ｐＨ ７．４）溶解沉淀，以不连续蔗糖密度梯度［梯度由６００和 ２５０ ｇ・ｋｇ 蔗糖组成］３５ ０００ ｒ・ｍｉｎ （４ Ｃ）离心３ ｈ，收集中间层乳白色带，经含１ ｇ・ｋｇ—ＮａＮ。的 ＴＮＥ透析后，再用ＰＥＧ 。。。反渗透浓缩至原总体积的１／５０左右。经紫外分光光度计测得纯化的ｒｅ— Ｂａｃｍｉｄ—ＶＰ２抗原蛋白含量为０．５９８ ｍｇ・ｍＩ ～。抗原分装，于一２０ Ｃ条件下保存。同法制备野生杆状病 毒感染Ｓｆ９细胞的阴性抗原。 ２）ＩＢＤＶ包被抗原的制备：用ＩＢＤＶ ｊｓ株攻毒死亡鸡的法氏囊病料稀释液，经泄殖腔接种２８日龄 ＳＰＦ雏鸡１Ｏ羽（１００ Ｌ・羽＿。，１００个Ｉ Ｄ 。・羽－１），隔离器内饲养观察，接种后９６ ｈ内全部死亡。无菌 采集死亡鸡法氏囊组织，加入５倍量灭菌ＰＢＳ液，于超净工作台内粉碎碾磨，取病料组织液反复冻溶 ４次后，１５ ０００ ｒ・ｍｉｎ＿１离心１０ ｍｉｎ，上清中加入２００ ｍＩ ・Ｌ １氯仿，混匀后８ Ｃ下４ ０００ ｒ・ｍｉｎ 离 心１５ ｍｉｎ，上层水相装袋透析，采用上述方法分离提取的法氏囊病料组织ＩＢＤＶ抗原蛋白为 ０．４５８ ｍｇ・ｍＩ 一。抗原分装，于一２０ Ｃ下保存。 ３）间接ＥＩ ＩＳＡ反应条件的选择：将ｒｅＢａｃ—ＶＰ２抗原、病料组织提取的ＩＢＤＶ抗原和野生杆状病毒 感染的Ｓｆ９细胞阴性抗原，分别用包被液从１：ｉ００开始倍比稀释成９个稀释度包板。前两种抗原各重 维普资讯 http://www.cqvip.com
第３期 许小琴等：应用重组杆状病毒表达的ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原建立其抗体监测方法 ３ 复包被７块板，阴性抗原包被１块板；抗ＩＢＤＶ阳性血清和ＳＰＦ鸡阴性血清分别按１：１００、１：２００、 １：４００倍稀释；兔抗鸡ＩｇＧ酶标二抗以１：３０ ０００稀释，进行方阵测定；其他反应条件参考文献［１０—１１］ 方法进行。 ４）间接Ｅｌ ＩＳＡ的交叉反应：用建立的间接ＥＩ ＩＳＡ方法，分别检测ＩＢＤ阳性血清、ＮＤ阳性血清、 ＭＤ阳性血清、ＥＤＳ阳性血清和ＩＢ阳性血清，各７～１２份。 ５）间接ＥＩ ＩＳＡ与进口试剂盒的对比试验：将３６２份采自动物医院门诊病鸡的血清样本，分别用建 立的间接ＥＩ ＩＳＡ检测方法与美国进口试剂盒按其说明书操作进行平行检测，参照刘秀梵口 所述方法 计算该间接Ｅｌ ＩＳＡ检测结果与进口试剂盒检测结果的符合率、敏感性、特异性、阳性符合率、阴性符合 率、Ｙｏｕｄｅｎ指数。 ６）稳定性试验：选取ＶＰ２基因免疫鸡不同抗体滴度的血清样本１１份，用建立的间接ＥＬＩＳＡ检测 方法，每周进行１次，共重复检测８次。 ２结果与分析 ２．１ ｒｅＢａｃｍｉｄ—ＶＰ２蛋白的ＥＬＩＳＡ抗原性 分别以ｒｅＢａｃｍｉｄ—ＶＰ２在Ｓｆ９细胞内表达的ＶＰ２抗原、病料组织提取的ＩＢＤＶ抗原和野生杆状病毒 感染的Ｓｆ９细胞阴性抗原为间接ＥＩ ＩＳＡ检测抗原，以抗ＩＢＤＶ阳性血清和ＳＰＦ鸡阴性血清为被检测对 象，进行方阵测定。结果表明：ｒｅＢａｃｍｉｄ—ＶＰ２、病料组织ＩＢＤＶ抗原均能特异性地识别抗ＢＤＶ阳性血清 和阴性血清，而野生杆状病毒感染的Ｓｆ９细胞阴性抗原对阳性血清和阴性血清，均呈现阴性结果 （Ｄ 。。 ＜０．１８３）。但病料组织ＩＢＤＶ抗原包被板，在检测ＳＰＦ鸡血清样本时，其Ｄ值均大于０．４５７，明 显高于ｒｅＢａｃｍｉｄ—ＶＰ２抗原和阴性对照抗原包被板对ＳＰＦ鸡血清的检测结果，说明病料组织提取的 ＩＢＤＶ抗原并不是间接Ｅ【 ＩＳＡ检测的理想包被抗原。因此，在本试验数据的分析统计中，未将病料组织 提取的ＩＢＤＶ抗原包被板的检测结果列出。 ２．２间接ＥＬＩＳＡ反应条件 将ｒｅＢａｃｍｉｄ—ＶＰ２抗原以１：１００开始倍比稀释成９个稀释度，阳性血清和阴性血清分别以１：１００ 开始倍比稀释成３个稀释度，方阵测定结果见表１。 表１方阵测定的Ｐ／Ｉｖ值 Ｔａｂ．１ Ｔｈｅ Ｐ ７Ｎ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ …ｏｏ ８．０４（丽１．４７２）１１．１９（ １．４５５）１２．３５（而１．４０８）１１．９３（丽１．３７２）７．７２（ ）ｓ．。ｓ …ｏｏ ８．７３（ １．３６２） （ ）９．８４（ １．３３８）１１．３０（而１．３１１）７．５５（ ） ．。 ……．。ｅ（ ） ．ｚｓ（ ）７．７４（而０．９０５）ｓ．ｓ （ ）７．０９（ ０．６５９） ．１５ ＊括号内为Ｐ／Ⅳ值，且当Ⅳ＜Ｏ．０５时，均取０．０５计算Ｐ／Ⅳ值；Ｐ为阳性组Ｄ值，Ⅳ为ＳＰＦ组Ｄ值。 由表１可见，血清样本３个稀释度的检测结果显示，当血清样本从１：２００稀释度下降到１：４００ 时，Ｄ值明显下降；当抗原从１：８００稀释（包被量为０．７５ ｇ・孔 ）下降到１：１ ６００时，阳性血清以 １：１００和１：２００稀释组的Ｄ值由大于１．３０迅速下降到小于０．８５，且Ｐ／Ⅳ值也由１１．３以上下降到 ７．７２以下，说明此抗原的最佳包被量为０．７５／ｘｇ・孔一，被检血清最佳稀释倍数为１：２００。根据Ｐ／Ⅳ 值最高原则分别测得的最佳包被液为０．０２ ｍｏｌ・Ｉ ＿。（ｐＨ ９．６）碳酸盐缓冲液，最佳封闭液为５ 脱脂 乳，最佳封闭作用方式为３７ ｌＣ作用１ ｈ后４＿Ｃ过夜。检测结果判定标准：每块酶标板上设２份阳性血清 对照和２份阴性血清对照，分别计算其平均阳性Ｄ（Ｄ ）值和平均阴性Ｄ（Ｄ ）值，则待检血清样品的 Ｄ≥０．４３Ｄ ＋０．５７Ｄ 判为阳性，反之为阴性。 维普资讯 http://www.cqvip.com
４ 扬州大学学报（农业与生命科学版） 第２７卷 ２．３ 间接ＥｕＳＡ的交叉反应 用ｒｅＢａｃｍｉｄ—ＶＰ２抗原建立的间接ＥＩ ＩＳＡ分别检测了ＩＢＤ阳性血清、ＮＤ阳性血清、ＭＤ阳性血清、 ＥＤＳ阳性血清、ＩＢ阳性血清，各７～１２份。检测结果表明，ＩＢＤ血清全为阳性，其余血清均为阴性，说明 该方法具有高度的特异性。 ２．４间接ＥＬＩＳＡ与进口试剂盒的对比试验结果 在两种方法平行检测的３６２份动物医院门诊病鸡血清样本中，进ＩＺｌ试剂盒检测为阳性的１９７份血 样中，间接ＥＬＩＳＡ检测为阳性的是１８４份；进ＩＺｌ试剂盒检测为阴性的１６５份血样中，间接ＥＬＩＳＡ检测 为阴性的是１５Ｏ份。平行检测的３６２份血清样品中两种方法检测结果相一致的有３３４份。与进ＩＺｌ试剂 盒相比，间接ＥＬＩＳＡ敏感性为９３．４％（１８４／１９７），特异性为９０．９％（１５ｏ／１６５），总符合率为９２．３ （３３４／３６２）。统计分析显示：阳性符合率为８６．８％［－１８４／（１８４＋１３＋１５＞－１，阴性符合率为８４．３ ［－１５ｏ／ （１５Ｏ＋１５＋１３）］，Ｙｏｕｄｅｎ指数为０．８５。本试验结果说明该间接ＥＬＩＳＡ检测结果有较高的可信度。 ２．５稳定性试验 经间接ＥＬＩＳＡ检测后，取不同抗体滴度的ＶＰ２基因疫苗免疫血清样本１１份，按同样的方法进行 了每周１次共８次的重复检测试验，结果见表２，不同Ｄ值的血清样本变异系数小于４ ，说明该间接 ＥＩ ＩＳＡ检测方法对检测ＶＰ２基因疫苗免疫血清抗体具有很好的重复性。 表２间接ＥＬＩＳＡ的稳定试验 Ｔａｂ．２ Ｔｈｅ ｒｅｐｅａｔ ｔｅｓｔ ｏｆ｜ｎｄｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｗｉｔｈｉｎ ａ ｂａｔｃｈ 重复 不同编号样品Ｄ４９。ｎｍ值 次数 １ ０．３９９ ０．３９２ ０．４０１ ０．４０２ ０．３９６ ０．４１１ ０．４０８ ０．３９７ ０．４０１ ０．００６ ３ ２ ０．１１４ ０．１１６ ０．１１６ ０．１０９ ０．１０７ ０．１１５ ０．１０８ ０．１１２ ０．１１２ ０．００３ ５ ３．１７ ３ １．１３８ １．１３７ １．１３９ １．１３４ １．１４２ １．１４１ １．１３７ １．１３８ １．１３８ ０．００２ ５ ０．２２ ４ ０．９０５ ０．９１４ ０．９１３ ０．９０８ ０．９１１ ０．９０７ ０．９０５ ０．９０９ ０．９０９ ０．００３ ４ ０．３８ ５ ０．２３４ ０．２３７ ０．２２８ ０．２２９ ０．２１３ ０．２３４ ０．２３２ ０．２２９ ０．２３２ ０．００３ １ １．３４ ６ ０．０６９ ０．０６４ ０．０７０ ０．０６７ ０．０６６ ０．０６５ ０．０６８ ０．０６７ ０．０６７ ０．００２ ０ ２．９９ ７ ０．０５６ ０．０５４ ０．０５７ ０．０５３ ０．０５５ ０．０５７ ０．０５８ ０．０５３ ０．０５５ ０．ＯＯ１ ９ ３．４７ ８ １．３３９ １．３３８ １．３３１ １．３６２ １．３４２ １．３５７ １．３３９ １．３４７ １．３４４ ０．０１０ ４ ０．７８ ９ ０．８４１ ０．８５０ ０．８４７ ０．８５１ ０．８４６ ０．８４３ ０．８４５ ０．８４９ ０．８４７ ０．００３ ５ ０．４１ １０ ０．８９２ ０．８８６ ０．８８７ ０．８８９ ０．８９４ ０．８８７ ０．８９３ ０．８９１ ０．８９０ ０．００３ ０ ０．３４ １１ ０．７８９ ０．７８２ ０．７８５ ０．７８１ ０．７８７ ０．７９１ ０．７８３ ０．７８６ ０．７８５ ０．００３ ５ ０．４４ ＣＶ／ １．６４ ３讨论 １）随着对杆状病毒分子生物学的研究，利用昆虫核多角体病毒的多角体蛋白基因（ｐｈｇ）的强启动 子而建立起来的高效多用载体宿主表达系统已成为引人注目的新型表达系统。以杆状病毒为载体的昆 虫细胞表达系统具有明显的优势。在感染细胞中，外源基因蛋白表达水平可达１ ｍｇ・ｍＬ （含２×１Ｏ 个培养细胞），其表达能力是其他系统所无法相比的；且杆状病毒有严格的宿主专一性，对脊椎动物和植 物均无致病性，也不能在非宿主细胞中繁殖或发生整合，十分安全；杆状病毒在昆虫细胞中既能表达原 核基因又能表达真核基因，其表达产物的抗原性与天然蛋白十分相似。本课题组构建的表达ＩＢＤＶ ＶＰ２ 基因的重组杆状病毒ｒＢａｃｍｉｄ—ＶＰ２在Ｓｆ９细胞中可以大量繁殖，ｒＢａｃｍｉｄ—ＶＰ２蛋白的表达量为 ０．５９８ ｍｇ・ｍＩ ＿。。经间接免疫荧光试验证实，该重组病毒表达的ＶＰ２蛋白与天然ＶＰ２蛋白一样，均可 被ＩＢＤＶ单克隆抗体和抗ＩＢＤＶ阳性血清抗体所识别。 ２）利用重组杆状病毒ｒＢａｃｍｉｄ—ＶＰ２在Ｓｆ９细胞中表达的ＶＰ２蛋白作为抗原，建立的抗ＩＢＤＶ血清 抗体间接ＥＬＩＳＡ检测方法与进ＩＺｌ试剂盒平行检测的３６２份血清，阳性符合率为８６．８％［－１８４／（１８４＋ １３＋１５）］，阴性符合率为８４．３％，敏感性为９３．４％（１８４／１９７），特异性为９０．９ ，表明该检测方法具 （下转第３４面） 维普资讯 http://www.cqvip.com
３４ 扬州大学学报（农业与生命科学版） 第２７卷 ２００３，３０（８）：７５５－７６０． ［９］王启贵，钟发刚，李辉，等．绵羊产羔性状主效基因检测研究［Ｊ］．遗传，２００５，２７（１）：８Ｏ一８４． ［１０］储明星，成荣，陈国宏，等．小尾寒羊和湖羊高繁殖力候选基因ＢＭＰ１５的研究［Ｊ］．安徽农业大学学报， ２００５，３２（３）：２７８—２８２． ［１ １］ｔ３ｏｄｉｎ Ｌ，Ｌｅｃｅｒｆ Ｆ，Ｐｉｓｓｅｌｅｔ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｈｏｗ ｍａｎｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａ￣ｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｏｖｕｌａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ａｎｄ ｌｉｔｔｅｒ ｓｉｚｅ ｉｎ ｐｒｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｌａｃａｕｎｅ ｍｅａｔ ｓｈｅｅｐ［Ｇ］∥Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｍａｊｏｒ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ＱＴＬ ｉｎ Ｓｈｅｅｐ ａｎｄ Ｇｏａｔ．Ｔｏｕｌｏｕｓｅ：ＩＮＲＡ，Ｆｒａｎｃｅ，２００３：２－１１． ［１２］Ｈａｎｒａｈａｎ Ｊ Ｐ，Ｇｒｅｇａｎ Ｓ Ｍ，Ｍｕｌｓａｎｔ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｏｏｃｙｔｅ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ＧＤＦ９ ａｎｄ ＢＭＰ１ ５ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｂｏｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｏｖｕｌａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ａｎｄ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｄ Ｂｅｌｃｌａｒｅ ｓｈｅｅｐ（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ） ［Ｊ］．Ｂｉｏ Ｒｅｐｒｏｄ，２００４，７０（４）：９００—９０９． ［１ ３］Ｇｕｏ Ｗ，Ｃｈｕ Ｍ Ｘ，Ｄｅｎｇ Ｘ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｄｏｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ５ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ｐｒｏｌｉｆｉｃａｃｙ ｉｎ Ｓｍａｌｌ Ｔａｉｌ Ｈａｎ ｓｈｅｅｐ［Ｊ］．Ａｓｉａｎ—Ａｕｓｔ Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ，２００４，１７（１１）：１４９１—１４９５． ［１４］储明星，桑林华，王金玉，等．小尾寒羊高繁殖力候选基因ＢＭＰ１５和ＧＤＦ９的研究［Ｊ］．遗传学报，２００５， ３２（１）：３８—４５． ［１ ５］Ｂｒａｗ—Ｔａｌ Ｒ，ＭｃＮａｔｔｙ Ｋ Ｐ，Ｓｍｉｔｈ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｏｖａｒｉｅｓ ｏｆ ｅｗｅｓ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｘ—ｌｉｎｋｅｄ Ｉｎｖｅｒｄａｌｅ ｇｅｎｅ（ ｃ ） ａｒｅ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｄ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ ｂｕｔ ｃｏｎｔａｉｎ ｍａｎｙ ａｂｎｏｒｍａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏ Ｒｅｐｒｏｄ，１９９３，４９（５）： ８９５—９０７． （上接第４面） 有特异性强、敏感性高的特点。尤其是ＶＰ２基因疫苗免疫的血清样本不同时间的多次重复试验表明，变 异系数小于４ ９，５，这为进一步研究ＶＰ２亚单位苗免疫效果的监测、评价奠定了基础。 参考文献： ［１］ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｔ，Ｏｇａｗａ Ｍ，Ｉｎｏｓｈｉｍａ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９６，２２３：２１９—２２３． ［２］ Ａｚａｄ Ａ Ａ，Ｍｃｋｅｒｎ Ｎ Ｍ，Ｍａｃｒｅａｄｉｅ Ｉ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｏｓｔ—ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＶＰ２）ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒａｓｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９１，９：７１５－７２２． ［３］ Ｈｅｉｎｅ Ｈ Ｇ，Ｂｏｙｌｅ Ｄ Ｂ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＶＰ２ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａ ｆｏｗ ｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｒｅｃｏｍ ｂｉ— ｎａｎｔ ｃｏｎｆｅｒｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ，１９９３，１３１：２７７—２９２． ［４］ Ｄａｒｔａｉｌ Ｒ，Ｂｕｂｌｏｔ Ｍ，Ｌａｐｌａｃｅ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｏｆ ｔｕｒｋｅｙ ｒｅｃｏｍ ｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｅｓａｓｅ ｖｉｒｕｓ（ＩＢＤＶ）ＶＰ２ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ａｎ ＩＢＤＶ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９９５，２１１（２）：４８Ｉ－４９０． ［５］ Ｊａｇａｄｉｓｈ Ｍ Ｎ，Ｖａｕｇｈａｎ Ｐ Ｒ，Ｉｒｖｉｎｇ Ｒ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒ￣ｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，１９９０，９５：１７９—１８６． ［６］ Ｍａｃｒｅａｄｉｅ Ｉ Ｇ，Ｖａｎｇｈａｎ Ｐ Ｒ，Ｃｈａｐｍａｎ Ａ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｐａｓｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｖｉｒａｌ ＶＰ２ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｙｅａｓｔ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，１ ９９０，８：５４９—５２２． ［７］ Ｂａｙｌｉｓｓ Ｃ Ｄ，Ｐｅｒｔｅｒｓ Ｒ Ｗ，Ｃｏｏｌ Ｊ Ｋ Ａ，ｅｔ ａ１．Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｗｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｔｈｅ ＶＰ２ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃ— ｔｉｏｕｓ ｂｕｒ￣ｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９１， １２０：１９３—２０５． ［８］ Ｄｙｂｉｎｇ Ｊ Ｋ，Ｊａｃｋｗｏｏｄ Ｄ Ｊ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ， １９９６，４１：６１７－６２６． ’ ［９］ Ｖａｋｈａｒｉａ Ｖ Ｎ，Ｓｎｙｄｅｒ Ｄ Ｂ，Ｈｅ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒ￣ｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｕｒｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｏｎｆｅｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎｓ［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，１９９３，７４：１２０１—１２０６． ［１０］ 徐宜为．免疫检测技术［Ｍ］．２版．北京：科学出版社，１９９１． ［１１］ 杨利国，胡少昶，魏平华，等．酶免疫测定技术［Ｍ］．南京：南京大学出版社，１９９８． ［１２］ 刘秀梵．兽医流行病学［Ｍ］．２版．北京：中国农业出版社，２０００．
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