www.zgzysy.com2018年第1期兽医实验室猪伪狂犬病病毒诊断与检测方法研究进展刘霞 王慧 李照伟/贵州省动物疫病预防控制中心崔燕/甘肃农业大学动物医学院猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）引起的猪﹑牛等多种家畜和野生动物的一种急性传染病，以发热﹑奇痒及脑脊髓炎为主要症状（猪除外）。该病主要引起种猪呼吸系统及生殖系统疾病和仔猪神经系统疾病，成年猪呈隐性感染，仔猪病死率100%。在世界上，已有40多个国家发生此病，发达国家已将本病列为重点防治疾病之一；在我国，自1947年首次报道后，已有20多个省﹑市﹑自治区相继报道过本病，2012年以来PRV的持续性感染和潜在的免疫抑制，更是给我国猪病防治和疫病净化工作带来了很大的困难。国外一些专家认为，全世界由PR造成的损失每年可达几十亿美元，仅低于口蹄疫（FMD）和猪瘟(CSF)。近年来，PR发生报道数急剧上升，目前该病尚无有效的药物治疗。疫苗接种是预防控制PR的主要措施之一，就目前来看，PR的传统疫苗已经相对成熟，但现代疫苗的研究尚处于研究阶段。因此，提高PR的诊断技术是防控该病的先决条件，只有早发现﹑早防控才能更加有效地降低PR的发生，避免养猪业遭受巨大的经济损失。随着免疫学和分子生物学技术的日渐完善，相关的血清学方法和分子生物学方法也不断完善。为此，本文对临床诊断﹑病原学﹑血清学及分子生物学等主要方法的研究进展和应用情况进行综述，以期为PR临床诊断与检测技术提供参考和借鉴。吐-共济失调﹑四肢呈游泳状等神经症状，最后昏迷死亡；成年猪多数不表现临床症状，或仅出现体温轻微升高；怀孕母猪常发生流产，产木乃伊胎或死胎。二、病原学诊断病原学诊断主要包括三种方法，即病毒分离﹑病毒接种及动物感染，被称为诊断PRV的黄金标准，但存在敏感性较差的问题。病毒分离取病死猪或处于发热期病猪的中脑﹑肾脏﹑肝﹑脾及扁桃体，加PBS制成10%悬液，再加双抗，混匀，4℃过夜后2000r/min离心，取上清待动物感染或细胞接种使用。取处理液接种于PK-15﹑SK6等敏感细胞，培养24～72h左右，取培养物进行HE染色，镜检可发现酸性核内包涵体；接种于家兔或小白鼠，接种后2～3d，家兔与小白鼠均出现典型的剧痒症，体温升高，接种后3～5d全部死亡，即可确诊，病毒尚可以在病死兔脑中分离获得。三、血清学方法血清学检测手段，尤其是研制成功的部分ELISA试剂盒操作简单﹑方便，不需要使用昂贵复杂的仪器，已经被广泛应用。目前常应用血清学方法有琼脂免疫扩散试验(AGID)﹑中和试验（NT）﹑酶联免疫吸附试验（ELISA）和乳胶凝集试验（LAT）。1.琼脂免疫扩散试验(AGID)。琼脂免疫扩散试验（AGID）无需特殊设备，技术操作简单，结果准确，因此适用于基层兽研单位和大型猪场的现场定性诊断及猪群无感染的普查。吴斌等(1997)将AGID和血清中和实验(SNT)进行了比较试验，发现与SNT的阳性符合率为94%，可以作为一种检测伪狂犬病和抗体水平的检测。代明娟等(2002)利用AGID技术对5个猪场进行了抗体检测，一、临床诊断临床诊断就是根据流行病学特点﹑典型的临床症状及病例剖检等初步诊断。感染PR的病猪临床症状因年龄和毒株毒力不同而有所差异。其中哺乳仔猪最为敏感，病死率可达100%，主要临床表现为高热﹑排稀便﹑呕69Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.兽医实验室2018年第1期www.zgzysy.com结果分析表明猪场的血清阳性率为80.0%，再一次显示了AGID技术的简便和快捷。2.中和试验（NT）。中和试验（NT）又称微量血清中和试验（MSNT），是检测病毒比较经典的方法，是世界上多数国家诊断PR的法定方法之一。NT敏感性及准确性都较理想，但操作繁琐，且受技术﹑细胞等条件，不适合作为流行病学调查和大批量疫控监测使用。邱德新等应用MSNT和伪狂犬病乳胶凝集实验(LAT)诊断试剂盒进行了PRV抗体效价测定和相关性分析，结果表明两种方法检测结果符合率高，特异性强，LAT比MSNTMSNT3种诊断方法对45份猪血清样品进行了PR血清杭体检测，结果表明MSNT的准确性﹑敏感性﹑特异性均最为敏感。（LAT）3.乳胶凝集试验（LA T）。乳胶试验凝集试验是利用抗原和抗体特异性结合的特点，将抗原先用乳胶包被，再与相应血清反应，几分钟内即可得出结果，具有操作简单﹑方便﹑快速。与NT相比，LAT具有更加广阔的推广前景。罗勇等利用乳胶凝胶实验技术对疑似猪瘟病的病猪进行了猪伪狂犬病毒的检测，230份血清中阳性率11%。近年，美国已经有商品化的LAT试剂盒供临床使用。国内华中农业大学也成功研制了gGLAT和gELAT试剂盒。4.酶联免疫吸附试验（ELISA）。酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为广泛应用的一种免疫检测方法，被OIE定为诊断PR的首选血清学方法。它是以物理方法将抗体(或抗原)吸附在固体载体上，随后的一系列免疫学和酶促生化反应都在此固相载体上进行的免疫酶测定实验，具有特异﹑敏感﹑快速﹑简便的优点，适用于实验室大批量样品的检测﹑产地检疫及流行病学调查等。国内蒋玉雯等(1988)建立了检测伪狂犬病病毒抗体间接ELISA方法，认为ELISA敏感性高，且快速﹑简便，适于大面积血清学调查。随着基因工程缺失疫苗的研制成功，我国唐勇﹑罗飞等学者又陆续建立了可以鉴别诊断野毒株和疫苗毒株﹑敏感性和特异性更高的ELISA方法。进行了原位杂交，从单细胞的水平上检出存在的潜伏感染。在国内，郭万柱等采用32P探针标记PRV全基因组和重组质粒应用斑点杂交技术，能检测出10pg的PRVDNA，并具有较高的特异性。王琴等﹑魏伟等相继以非放射性生物素和光敏生物素标记DNA探针，均能有效地检测出PRVDNA。2008年，刘志杰等制备了地高辛标记的gE基因核酸探针，对PRV野毒的最低检出量为4pg，与PCR检测结果一致，表明该核酸探针可用于PR野毒感染的临床诊断。（1）常规PCR方法。聚合酶链式反应2.PCR方法。敏感﹑安全可靠等明显优势，在检测PRV方面得到了广泛应用。目前，PRV检测的基因片段主要有gB﹑gD﹑gG和gE等，其中gD基因是主要中和抗原基因。我国周复春等应用PCR技术进行了PRV的检测，并对潜伏的感染部位也进行了相应的研究；石建平等对常规PCR法进行了改进，将试验缩短到4h内完成，提高PCR的效率，使PCR技术更趋于实用化；Katz等﹑刘丽娜等建立的套式PCR和多重PCR能有效区分野毒株和不同疫苗株。近年来，随着这项技术的不断进步，检测PRV与其他猪病病毒的PCR方法也相继建立，这种多重PCR将成为分子生物学检测和流行病学调查的常用方法。（2）实时荧光定量PCR方法。实时荧光定量PCR技术(Real-timeFluo-rescentQuantitativePolymeraseChainReaction，FQ-PCR)是20世纪90年代中期在PCR定性技术基础上发展起来的高灵敏度的核酸定量技术，该技术已被广泛应用于遗传学﹑育种学﹑营养学和医学等研究领域，应用前景相当广阔。2009年，赵丽等根据gH﹑gE基因先后建立了PRV实时定量荧光RCR﹑鉴别PR野毒与疫苗毒感染的荧光定量PCR两种方法；吕建强等根据gD基因建立了PRV实时荧光RCR方法，最低检测限可达1.42pg/μl的总DNA；MaW等根据gB﹑gE基因建立了快速检测区分PR野毒与基因缺失疫苗毒的实时荧光定量PCR方法，能够快速﹑特异地检测出感染和潜伏感染野猪体内的PRV。敏感﹑快速简便和实用。孙广力等应用LAT﹑AGID﹑（PolymeraseChainReaction，PCR）因其快速﹑特异﹑四、分子生物学技术1.核酸探针。在多种诊断伪狂犬病的方法中，核酸探针技术是近年来迅速发展起来的一种新型分子生物学技术探针技术。它具有特异性良好﹑敏感程度高的优点，被广泛用于PRV的诊断和检测中。Maes等用生物素和地高辛标记的探针从三叉神经节诊断出PRVDNA，并五、展望我国是世界第一养猪大国，生猪存出栏数及猪肉产量多年来位居世界第一,然而我国养猪业一直受到疫病问题的困扰，PR就是其中主要疫病之一。目前用于诊断PR的检测方法很多，各有其优缺点。传统方法可靠，但往往操作较复杂或耗时较长，实际应用中有一定的困难；70Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.www.zgzysy.com2018年第1期兽医实验室保定周边地区猪圆环病病原﹑抗体水平调查及分析刘子伟 翟含流/河北省保定市莲池区动物卫生监督所郑朝朝 刘涛 邹立宏/瑞普（保定）生物药业有限公司刘子伟 翟含流/河北省保定市莲池区动物卫生监督所吴浩/河北省保定市农业局猪圆环病毒病（PCVD）是由圆环病毒引起的一种能导致猪群免疫抑制的传染病，近几年在我国广泛流行，严重制约了我国养猪业的发展。圆环病毒2型（PCV-2）主要导致断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)﹑猪皮炎与肾病综合征(PDNS)﹑新生仔猪先天性震颤(CT)﹑猪增生性坏死性间质性肺炎(IP)﹑相关性肠炎以及怀孕母猪的繁殖障碍等一系列疾病。猪圆环病毒导致猪群免疫抑制，为其他病毒和细菌的感染提供了便利，猪群的死亡率大大增加。为了解保定市周边地区2015—2017年猪圆环病毒2型疫病流行情况，本试验用PCR方法和ELISA方法对保定市周边清苑﹑徐水﹑高阳﹑满城﹑望都5个县10个中型猪场及92个个体养猪场提取857份猪血清样本，进行了猪圆环病毒病2型病原﹑抗体水平调查，为今后猪圆环病毒病的防治提供参考。10个中型养猪场﹑约50%个体养殖户使用国产猪圆环病毒2型灭活疫苗进行免疫；（2）检测试剂。DNA/RNA提取试剂盒，购自大连宝生物工程有限公司；猪圆环病毒2型引物序列参考GenBank，由北京擎科生物技术有限公司合成；猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒，购自瑞普（保定）生物药业有限公司。2.方法（1）病原检测。按照核酸提取试剂盒说明书提取待检血清样品的DNA，做好标记；配制RT-PCR反应体系，设置RT-PCR程序扩增猪圆环病毒2型片段；对RT-PCR产物进行凝胶电泳检测，计算病原检出率。结果判定标准：凝胶电泳出现目的条带判为抗原阳性，没有出现目的条带判为抗原阴性；（2）抗体检测。按照猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒说明书，对待检血清样品进行400倍稀释，检测抗体水平，计算S/P。结果判定标准：S/P值≥0.25判为阳性；0.16＜S/P＜0.25判为可疑；S/P≤0.16判为阴性。一、材料和方法1.材料（1）血清。采集自保定市周边5县的10个中型养猪场和92个个体养殖户，母猪或仔猪静脉血，离心﹑分离制备血清，分装，-20℃保存﹑备用。猪群未表现明显临床症状，暂未出现因圆环病毒感染导致的损失。据调查二、结果与分析待检血清样品病原检出结果如下表1：1.病原检测结果。血清学方法，特别是鉴别ELISA试剂盒的研制成功和广泛应用，不仅使PR的检测变得简便﹑快速﹑敏感，还可以鉴别野毒和疫苗毒；分子生物学方法灵敏度高﹑特异性好，随着研究的深入和完善将会越来越被广泛应用。当然，无论哪一种诊断检测方法都不能彻底解决所有问题，可以根据检测目的和要求进行选择和配合应用，以期达到早发现﹑早解决。同时，还应不断深入研究，建立更多快速﹑简便﹑实用的检测诊断方法，以更好的促进该病的综合防控和疫病净化工作的开展。参考文献（略）71Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.
